Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie
May 11th, 2018
Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.
Het algemene doel van dit protocol is om een kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van motorneuron axon arborisatiepatronen mogelijk te maken met behulp van een lichtbladmicroscoop en beeldanalysesoftware op muisembryo's. Deze methode kan helpen om de ontwikkeling van motorneuronen te begrijpen in coördinatie met complexe bewegingen. Het grote voordeel van deze techniek is dat je axon arborisatiepatronen van motorneuronen van verschillende hoeken kunt observeren en beeldmateriaal kunt maken en elk individueel zenuwknooppunt kwantitatief kunt analyseren.
De procedure wordt gedemonstreerd door Ya-Ping Yen en Ee Shan Liau, twee afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, fixeer de embryo's afzonderlijk in een 24-wellsplaat met één milliliter vers bereide 4% paraformaldehyde in PBS per putje bij vier graden Celsius op een shaker gedurende een nacht. De volgende dag, was de gefixeerde embryo's minstens drie keer, elk gedurende vijf tot tien minuten, met één milliliter 1X PBS en incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius.
Vervolgens permeabiliseer elke embryo in één milliliter 0,5% PBST gedurende een nacht bij vier graden Celsius op een shaker. Blokkeer elk monster met één milliliter 10% FBS bereid in 1X PBS gedurende een nacht bij vier graden Celsius op een shaker. Daarna, incubeer elk embryo met één milliliter anti-GFP primaire antilichaam bij vier graden Celsius gedurende 72 uur met constant schudden.
Na de primaire antilichaam incubatie, was elk embryo met één milliliter 0,5% PBST in de loop van één tot twee dagen bij vier graden Celsius op een shaker. Daarna, breng één milliliter secundair antilichaam aan en incubeer in het donker gedurende een nacht bij vier graden Celsius met constant schudden. De volgende dag, was elk embryo met één milliliter 0,5% PBST minstens drie keer bij vier graden Celsius op een shaker gedurende twee tot drie dagen.
Vervolgens, incubeer elke embryo in een commercieel klaringsmiddel met een brekingsindex van 1,49 nd in een 1,5 milliliter buisje beschermd tegen licht bij kamertemperatuur gedurende een nacht. Stel 5X/0,1 verlichtingsoptiek en 5X/0,1 detectieoptiek in. Monteer de monsterhouder en monstercapillair.
Bereid de monsterkamer voor door deze te vullen met klaringsoplossing. Om het embryo te monteren, bereid een P200 pipettetip voor door het bovenste deel weg te snijden zodat deze past op de diameter van het capillair en verwijder het puntige deel voor de monsterbevestiging. Smelt vervolgens het stompe uiteinde van de pipettetip met een kleine vlam.
Dood de vlam en bevestig het embryo snel verticaal op het gesmolten uiteinde. Pas het bovenste deel van de pipettetip aan met het monstercapillair en plaats de voorbereide monsterkamer in de microscoop. Gebruik de beeldvormingssoftware, selecteer Locatie Capillair onder het tabblad Locatie en pas de X, Y en Z assen aan.
Selecteer vervolgens Locatie Monster en zoom tot 0,6X om te focussen op het embryo. Laat de buffer van de kamer enige tijd in evenwicht komen met het embryo om eventuele vuil of bellen te verwijderen. Voor beeldacquisitie onder het tabblad Acquisitie, definieer de lichtbaanparameters zoals Detective Objectieven, Laser Blokkeringsfilter, Stralingsdeler, Camera's en Lasers.
Vink het vakje Pivot Scan aan voor schaduwreductie. Definieer vervolgens de acquisitie-instellingen, Bit Diepte tot 16-bit, Zoom tot het bereik tussen 0,36 en 0,7X, enkele site verlichting of dubbele site verlichting. Klik op Continu en stel de Laser Intensiteit, Expositietijd, Laservermogen en Lichtbladpositie in.
Druk vervolgens op Stop om de beeldacquisitie te beëindigen. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het transparante monster zich binnen de kortste lichtbaan bevindt om gedetailleerde acquisitie van afbeeldingen van fijne arboriseerde structuren op individuele motorzenuwen mogelijk te maken. Voor multidimensionale acquisitie, definieer de Z-stack door de z-positie voor de eerste en laatste afbeelding te verplaatsen.
Klik op Optimaal om het aantal sneden in te stellen. Klik vervolgens op Start Experiment om de geselecteerde Z-stack te verwerven. Wanneer dit klaar is, sla het beeld op in czi-formaat.
Om axon arborisatie te kwantificeren, open het afbeeldingsbestand in de beeldanalysesoftware. Pas de afbeeldingskleur, helderheid en contrast aan met behulp van het venster Weergave Aanpassing om filamenten te detecteren op basis van lokale intensiteitscontrast. Klik vervolgens op de knop Nieuwe filamenten toevoegen en selecteer het Autopath-algoritme in het vervolgkeuzemenu.
Selecteer het gebied van belang en definieer vervolgens de start- en zaadpunten door de grootste en dunste diametermetingen toe te wijzen die kunnen worden gemeten met behulp van de Slice-modus. Wijs een startpunt toe aan de rand van het gebied van belang. Om handmatig startpunten toe te voegen of te verwijderen, verander eerst de wijzermodus, navigeer selecteer en klik vervolgens met de linkermuisknop op de punten van belang.
Selecteer vervolgens handmatige drempels voor zaadpunten om ervoor te zorgen dat alle zichtbare arborisatie wordt gemarkeerd. Voeg vervolgens handmatig zaadpunten toe of verwijder ze. Vink het vakje Afgebroken segmenten verwijderen aan en verwijder zaadpunten rond startpunten.
Pas vervolgens de drempel voor achtergrondsubtractie aan en voltooi het proces. Het is noodzakelijk om achtergrondartefacten te verwijderen en te bevestigen dat de detectorbaan ware axon arborisatie reflecteert voor nauwkeurige kwantificering. Aan het einde, kies de gewenste stijl en kleur.
Onder het tabblad Statistieken, selecteer Gedetailleerd en gebruik filamentnummer, dendriet eindpunten om de motorzenuwterminals te kwantificeren als een indicator van motoraxon arborisatie. Exporteer vervolgens de afbeelding van het gereconstrueerde axon als een tiff-bestand. LSFM biedt gedetailleerde 3D-visualisatie van motoraxon arborisatie in muisembryo's.
Motorneuronen worden onderworpen aan het hierboven beschreven protocol en gelabeld met transgenisch uitgedrukt GFP. Om axon arborisatie in meer detail af te beelden en k
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het visualiseren van motorische neuronprojectie en axonarborisatie in transgene Hb9::GFP muisembryo's. Met behulp van lichtbladfluorescentiemicroscopie maakt de methode kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen van axonpatronen mogelijk, waardoor het begrip van motorische neuronontwikkeling wordt bevorderd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Neuro-ontwikkeling
- Beeldtechnieken
Achtergrond
- Het protocol richt zich op motorische neuronen, essentieel voor het coördineren van complexe bewegingen.
- Axonarborisatie van motorische neuronen is cruciaal voor functionele neurale circuitreeksen.
- Het begrijpen van deze patronen kan inzichten bieden in neuro-ontwikkelingsprocessen.
Doel van studie
- Motorische neuronaxonarborisatie visualiseren en kwantitatief analyseren.
- Een methode vaststellen die kan worden aangepast voor andere neuronnavigatieprocessen.
- Ons begrip van de ontwikkeling van motorische neuronen in muisembryo's verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het belangrijkste platform dat wordt gebruikt is lichtbladfluorescentiemicroscopie.
- Muisembryo's die GFP tot expressie brengen onder de Hb9-promotor dienen als biologisch model.
- Embryo's worden voorbereid door middel van immunokleuring en clearingtechnieken voorafgaand aan beeldvorming.
- Kritische stappen omvatten fixatie, permeabilisatie en antilichaamincubatie van de monsters.
Belangrijkste resultaten
- De bevindingen bevestigen het vermogen om fijne details van axonarborisatie in 3D te visualiseren.
- Kwantitatieve analyse vergemakkelijkt de evaluatie van de arborisatiepatronen van individuele motorische zenuwen.
- Deze methode staat aanpassingen in vergroting toe om ingewikkelde structuren te onthullen.
Conclusies
- De studie toont een robuust protocol voor het analyseren van de ontwikkeling van motorische neuronen.
- De methode vergroot inzichten in neurongedrag en mogelijke toepassing in andere studies.
- De bevindingen dragen bij aan een breder begrip van neurale mechanismen die onderliggen aan beweging.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing motor axon navigation and arborization in mouse embryos provides mechanistic insights into neurodevelopmental processes relevant to target validation in neurodegenerative disease models. Quantitative assessment of axon terminal patterns supports predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological interventions affecting motor neuron connectivity. This approach enables early de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular perturbations to structural phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing motor axon trajectory defects in genetic mutants or disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative analysis of axon arborization as a phenotypic readout.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by correlating molecular changes with neurodevelopmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D imaging data suitable for high-content screening of compound libraries.
- Quantitative Output: Provides filament number and terminal point measurements enabling dose-response analysis of axon growth inhibitors or enhancers.
- Scalability: Compatible with clearing and immunostaining workflows adaptable to multi-well embryo processing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to motor neuron disease models (e.g., ALS, SMA) using Hb9::GFP reporter lines to assess axonal pathology.
- Translational Continuity: Bridges discovery phenotypes to preclinical validation by quantifying arborization deficits predictive of functional impairment.
- Biomarker Alignment: Axon terminal counts serve as quantifiable histopathological endpoints correlating with motor circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural phenotyping downstream of target engagement and upstream of functional behavioral assays in motor neuron disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon guidance molecules via qualitative and quantitative arborization profiling.
- Screening: Enables assay standardization through consistent clearing, staining, and imaging parameters across genetic backgrounds.
- Analytics: Generates morphometric data (filament count, terminal points) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural phenotypes to functional outcomes in preclinical models of motor neuron degeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental and neurodegeneration programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in motor neuron development studies through direct visualization of axon patterning.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, clearing, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural validation of target modulation in neurodevelopmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on axon arborization profiles in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, immunostaining, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to light sheet fluorescence microscopy and compatible image analysis software (e.g., Imaris).
- Necessitates standardization of antibody incubation and washing steps to minimize variability in GFP signal detection.
- Adaptation to alternative models may require optimization of clearing reagents and refractive index matching.
- Practical limitations include embryo size constraints and potential signal quenching during prolonged clearing or storage.
