Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays
15 mei 2018
We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuromodulatie voor epilepsiebehandeling, zoals welk hersengebied en welk stimulatieprotocol het meest geschikt zijn. Het grote voordeel van deze techniek is dat hersenslices van knaagdieren een vereenvoudigd, realistisch model van hersencircuits vertegenwoordigen, terwijl micro-elektrode-arrays meerdere observatiepunten met bekende inter-elektrodeafstand toestaan. Om de MEA voor te bereiden, spreidt u het elastomeer afdichtmiddel gelijkmatig uit over het onderoppervlak van de opnamekamer en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.
Monteer vervolgens de opnamekamer met behulp van een pincet op de MEA en oefen lichte druk uit. Verspreid een afdichtlaag rond de buitenrand van de opnamekamer. Plaats vervolgens de MEA/kamer-assemblage in een gesloten, vochtige omgeving en laat deze overnacht op kamertemperatuur uitharden.
Om de opnamebank voor te bereiden, stel de warme bad op 32 graden Celsius. Giet vervolgens de holding ACSF in de holding- en voorverwarmingskamers. Laat de oplossingen borrelen met een mengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide en verwijder eventuele vastgelopen luchtbellen met behulp van een omgekeerde Pasteur-pipet.
Houd de holdingkamer op kamertemperatuur en plaats de voorverwarmingskamer in het warme bad. Bereid volgens standaardprocedures horizontale hippocampus-cortex hersenslices voor en laat ze minstens 60 minuten herstellen in de holdingkamer op kamertemperatuur. Giet 4AP ACSF in een incubatiekamer.
Laat het vervolgens borrelen met een mengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide en verwijder eventuele vastgelopen luchtbellen met behulp van een omgekeerde Pasteur-pipet. Bedek vervolgens de kamer en breng deze over naar het warme bad. Zorg ervoor dat de voorverwarming ACSF en de 4AP ACSF temperaturen 30 tot 32 graden Celsius zijn.
Gebruik een omgekeerde glazen Pasteur-pipet om een hersenslice over te brengen naar de voorverwarmingskamer en laat het weefsel 25 tot 30 minuten rusten. Breng vervolgens de hersenslice over naar de 4AP ACSF incubatiekamer en laat deze 60 minuten rusten. Laat de 4AP ACSF door de perfusieslang in een beker stromen tot er geen lucht meer in zit.
Stop vervolgens de oplossingstroom. Plaats de droge MEA-chip in de MEA-versterker en bevestig het hoofd van de versterker. Gebruik vervolgens een plastic Pasteur-pipet om 4AP ACSF over te brengen naar het inlaat- en uitlaatreservoir van de opnamekamer.
Bevestig de verwarmingskatheter aan een magnetische houder en plaats de punt ervan in de inlaatpoort van de opnamekamer. Bevestig vervolgens de magnetische houder aan een magnetische strip op het hoofd van de MEA-versterker. Verbind de perfusieslang met de katheter en de katheter met de thermostaat.
Plaats vervolgens de zuignaald in het uitlaatreservoir. Controleer of er negatieve druk is door de zuignaald onder te dompelen in de ACSF en controleer op een constant laagfrequent zuiggeluid. Stel vervolgens de stroomregelaar in om een stroomsnelheid van één milliliter per minuut mogelijk te maken en begin met perfuseren.
Zodra de 4AP ACSF door de katheter stroomt, zet de thermostaat aan. Stel de verwarmingskatheter in op 37 graden Celsius en de MEA-basis op 32 graden Celsius om een temperatuur van 32 tot 34 graden Celsius in de opnamekamer te bereiken. Plaats vervolgens de externe referentie-elektrode in het inlaatreservoir van de opnamekamer.
Zodra het 4AP ACSF-niveau en de opnametemperatuur zijn gestabiliseerd zoals gewenst, draai de perfusie en de zuigstopkraan naar de uit-stand om ze tijdelijk te stoppen. Breng snel een hersenslice over naar de opnamekamer van de MEA met behulp van een omgekeerde glazen Pasteur-pipet. Pas de positie op het opnamegebied van de MEA aan zoals nodig met behulp van een gebrand polijst, gekrulde Pasteur-pipet of een zachte, compacte, kleine borstel.
Plaats de houder op de hersenslice. Start de perfusie en de zuiging opnieuw door de stopkranen terug te draaien naar de aan-stand. Maak een foto van de hersenslice met een camera gemonteerd op een omgekeerde microscoopstandaard.
Voer vervolgens de script mapMEA uit op de computersoftware om de GUI te starten om de elektroden in kaart te brengen. Klik op de knop Bladeren om de foto van de hersenslice te laden. Zorg ervoor dat de referentie-elektrode in de bovenste kolom van de linkerhelft van de MEA verschijnt.
Klik vervolgens op de knop Aanwijzer activeren. Selecteer de bovenste en onderste elektroden in de linkerkolom van de array om de XY-coördinaten voor beelduitlijning en elektrodenkaart aan te geven. Selecteer in het vervolgkeuzemenu van het plaktype Horizontaal.
Vink het selectievakje Standaardstructuren aan. Selecteer met behulp van de genummerde drukknoppen onder de foto van de hersenslice de elektroden die overeenkomen met de ROI en klik op de overeenkomstige drukknoppen in het structuurpaneel om ze toe te wijzen. Herhaal deze stap voor elke ROI.
Druk vervolgens op de knop Opslaan. De software genereert een resultatenmap met een tabel met de geselecteerde elektroden en ROI's. Voor elektrofysiologisch onderzoek zet u de stimuluseenheid ten minste 10 minuten voorafgaand aan het stimulatieprotocol aan om zelfkalibratie en stabilisatie mogelijk te maken.
Start vervolgens de stimuluscontrolesoftware en controleer of de stimulator en MEA-versterker correct zijn aangesloten, zoals aangegeven door een groene LED in het hoofdpaneel van de stimuluscontrolesoftware. Stel de stimulatie in in bipolaire configuratie. Sluit de stimuluseenheid aan op de grond.
Verbind vervolgens de elektrodeparen in contact met de piramidale cellage van het CA1/proximale subiculum onder degenen die met het script mapMEA zijn gekarteerd. Om gegevens te verzamelen, drukt u op de afspeelknop in het hoofdpaneel van de opnamesoftware. Neem ten minste vier ictale ontladingen op.
Voer vervolgens een snelle input/output-test uit om de beste stimulusintensiteit te identificeren. Gebruik hiervoor het hoofdpaneel om een vierkante bifasische positief-negatieve stroompuls te ontwerpen met een duur van 100 microseconden per fase. Vo
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het registreren en elektrisch moduleren van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiforme activiteit in hersensecties van knaagdieren met behulp van micro-elektrodearrays (MEA's). De experimentele opstelling maakt een langdurige weefsellevensvatbaarheid mogelijk en maakt gebruik van een op maat gemaakte grafische gebruikersinterface voor real-time elektrodemapping en selectie van stimulatieparen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschappen
- Epilepsieonderzoek
Achtergrond
- Deze methode beantwoordt cruciale vragen over neuromodulatie voor de behandeling van epilepsie.
- Hersenselecties van knaagdieren dienen als een vereenvoudigd model van hersencircuits.
- Micro-elektrodenarrays maken meerdere waarnemingen mogelijk op bekende inter-elektrodeafstanden.
Doel van de studie
- Om stimuleringsprotocollen voor de behandeling van epilepsie te optimaliseren.
- Om de effecten van elektrische modulatie op epileptiforme activiteit te evalueren.
- Om gedetailleerde methodologieën te bieden voor het opzetten van de MEA en de preparatie van hersensecties.
Gebruikte methoden
- Het belangrijkste platform is het gebruik van ex vivo hersensecties van knaagdieren en micro-elektrode-arrays.
- Hippocampus-cortex hersensecties worden geprepareerd en geïncubeerd met 4-aminopyridine (4AP) om epileptiforme activiteit op te wekken.
- Cruciale methodologische stappen omvatten het herstel van de hersensecties, de incubatiecondities en nauwkeurige temperatuurbeheersing tijdens het experiment.
- De op maat gemaakte grafische gebruikersinterface ondersteunt de elektrode-mapping en de stimulatieconfiguraties.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt effectief de registratie van ictale ontladingen en interictaal-achtige gebeurtenissen mogelijk via speciaal ontworpen bipolaire stimulatieprotocollen.
- Elektrode-mapping resulteert in geoptimaliseerde selecties van regio's van belang (ROI's) voor stimulatie.
- De bevindingen zullen het begrip van de modulatie van hersencircuits die relevant zijn voor epilepsie verbeteren.
Conclusies
- Deze studie illustreert een levensvatbare methode voor het bestuderen van de modulatie van door 4AP geïnduceerde epileptiforme activiteit.
- De bevindingen ondersteunen toepassingen bij het ontwikkelen van behandelstrategieën voor epilepsie en het verbeteren van ons begrip van de dynamiek van neurale circuits.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt preklinische evaluatie van neuromodulatiestrategieën voor epilepsie mogelijk door een stabiel, langdurig model van epileptiforme activiteit in hersensnijden van knaagdieren te bieden. Het ondersteunt de validatie van targets en het mechanisch reduceren van risico's bij stimulatieprotocollen voorafgaand aan in vivo testen. Het platform vergroot het voorspellend vertrouwen bij het identificeren van optimale hersengebieden en stimulatieparameters voor de ontwikkeling van DBS.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door epileptiforme netwerkactiviteit in gedefinieerde hersengebieden te isoleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele validatie van targets via aanhoudende elektrische modulatie en het volgen van de netwerkrespons.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door stimulatieprotocollen te identificeren die ictale events betrouwbaar moduleren.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert stabiele, reproduceerbare epileptiforme patronen die meerdere uren aanhouden voor consistente screening van verbindingen of stimulatie.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van de frequentie en duur van ictale ontladingen mogelijk als farmacodynamische read-outs.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-electrode arrays voor parallelle tests van stimulatieconfiguraties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert fenotypen van temporale kwabepilepsie met behulp van 4AP-geïnduceerde activiteit in hippocampus-cortex-coupes.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door de effecten van neuromodulatie op het herstel van het netwerk te testen.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria op basis van de door stimulatie geïnduceerde afname van epileptische events.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische neuromodulatiescreening, waardoor een iteratieve verfijning van stimulatiestrategieën mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van netwerkmechanismen die ten grond liggen aan epileptiforme propagatie en modulatie.
- Screening: Levert reproduceerbare elektrofysiologische meetwaarden voor het evalueren van stimulatieparameters onder verschillende condities.
- Analytics: Biedt kwantificeerbare metrieken zoals aanvalsduur en inter-event intervallen voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt netwerkresponsen op coupesniveau met potentiële klinische DBS-uitkomsten via herstelmetrieken.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het testen van meerdere neuromodulatiebenaderingen in een gestandaardiseerd epileptiform model.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van het doelwit door langdurige, stabiele observatie van epileptiforme netwerken onder gecontroleerde stimulatie mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door laminaire perfusie, temperatuurcontrole en real-time elektrodemapping via een GUI.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het verminderen van faalpercentages in latere fasen van de ontwikkeling van neuromodulatie via vroegtijdige mechanistische inzichten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang van stimuleringsprotocollen mogelijk op basis van reproduceerbare onderdrukking van ictale events.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, de preparatie van hersenplakjes en het werken met MEA.
- Afhankelijk van perfusiesystemen, temperatuurregulatie en stimulus-isolatie-units voor stabiele opnames.
- Vereist standaardisatie van de oriëntatie van de plakjes, de incubatietijd en de stimuleringsprotocollen tussen verschillende gebruikers.
- Aanpassing naar andere hersengebieden vereist validatie van de inductie van epileptiforme activiteit en de nauwkeurigheid van de elektrode-mapping.
- Praktische beperkingen omvatten signaaldegradatie bij lage perfusiesnelheden en thermische drift tijdens langdurige experimenten.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Preparation of the MEA/Custom Chamber Assembly
1:15
Preparation of the Recording Bench
2:52
Preparation of the MEA Set-up
4:39
MEA Live Mapping
6:33
Recording and Electrical Modulation of the Epileptiform Activity
8:49
Results: Representative Experiment of Electrical Modulation of Ictogenesis Using Brain Slices Coupled to MEAs
9:21
Conclusion
