Name: Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer epileptiforme activiteit opnemen en moduleren in knaagdier hersenenplakjes met micro-elektrode arrays. Deze methode optimaliseert stimulatieprotocollen voor epilepsieonderzoek en verbetert inzicht in neurale circuitdynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

G.P. is Marie Skłodowska-Curie Fellow gefinancierd door de Europese Unie MSCA-IF-2014 project Re.B.Us, G.A. n.660689, onder het kader-programma H2020. De GUI-mapMEA is vrij beschikbaar op verzoek aan de auteur van ilaria.colombi@iit.it.

<ol><li>Fisher, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+classification+of+seizure+types+by+the+International+League+Against+Epilepsy%3A+Position+Paper+of+the+ILAE+Commission+for+Classification+and+Terminology%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology.</a> Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Epilepsy+Facts+Sheet%22">Epilepsy Facts Sheet</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/</a> (2017).</li>
<li>Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24652452">Stigma in epilepsy.</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444(2014).</li>
<li>Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+treatment+response+in+newly+diagnosed+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy.</a> Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).</li>
<li>Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+12+years+after+temporal+lobe+epilepsy+surgery%3A+a+long-term%2C+prospective+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study.</a> Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).</li>
<li>Dingledine, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDingledine%2C+R+%22Brain+slices%22">Brain slices</a>. , Plenum Press. (1984).</li>
<li>Avoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+and+pharmacological+mechanisms+leading+to+epileptiform+synchronization+in+the+limbic+system+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro.</a> Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).</li>
<li>Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+induced+by+changes+in+extracellular+potassium+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus.</a> J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).</li>
<li>Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+extracellular+magnesium+induces+epileptiform+activity+and+spreading+depression+in+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices.</a> J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).</li>
<li>Huberfeld, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+pre-ictal+discharges+emerge+at+the+transition+to+seizure+in+human+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy.</a> Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).</li>
<li>Pitkanen, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPitkanen%2C+A+%22Models+of+seizures+and+epilepsy%22">Models of seizures and epilepsy</a>. , (2017).</li>
<li>Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Aminopyridine+produces+epileptiform+activity+in+hippocampus+and+enhances+synaptic+excitation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition.</a> J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).</li>
<li>Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fixed-array+multi-microelectrode+system+designed+for+long-term+monitoring+of+extracellular+single+unit+neuronal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro.</a> Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).</li>
<li>Pine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+action+potentials+from+cultured+neurons+with+extracellular+microcircuit+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes.</a> J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).</li>
<li>Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dynamics+contribute+to+long-term+single+neuron+response+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations.</a> Front Neural Circuits. 8, 71(2014).</li>
<li>Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-electrode+array+recordings+of+human+epileptic+postoperative+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Boido, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortico-hippocampal+hyperexcitability+in+synapsin+I%2FII%2FIII+knockout+mice%3A+age-dependency+and+response+to+the+antiepileptic+drug+levetiracetam%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam.</a> Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+4-aminopyridine+in+vitro+epilepsy+model+analyzed+with+a+perforated+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array.</a> Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).</li>
<li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Ivanov, A., Zilberter, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+state+of+energy+metabolism+in+brain+slices%3A+the+principal+role+of+oxygen+delivery+and+energy+substrates+in+shaping+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroenergetics%22%5BJournal%5D)">Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity.</a> Front Neuroenergetics. 3, 9(2011).</li>
<li>MultichannelSystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+PH01%22">Manual PH01</a>. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf">https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf</a> (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+epileptiform+activity+can+be+independent+of+synaptic+transmission%2C+gap+junctions%2C+or+diffusion+and+is+consistent+with+electrical+field+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission.</a> J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).</li>
<li>Panuccio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ictogenesis+and+parahippocampal+networks+in+a+rodent+model+of+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).</li>
<li>Barbarosie, M., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CA3-driven+hippocampal-entorhinal+loop+controls+rather+than+sustains+in+vitro+limbic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures.</a> J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).</li>
<li>Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+control+of+epileptiform+excitability+in+an+in+vitro+model+of+limbic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures.</a> Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).</li>
<li>Benini, R., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+subicular+networks+gate+hippocampal+output+activity+in+an+in+vitro+model+of+limbic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures.</a> J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).</li>
<li>D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+low-frequency+stimulation+reduces+epileptiform+synchronization+in+limbic+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks.</a> Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).</li>
<li>Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+rat+hippocampal+slice+revisited+with+multi-electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays.</a> Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).</li>
<li>Pulizzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+wide-field+photostimuli+evoke+and+modulate+oscillatory+reverberating+activity+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks.</a> Sci Rep. 6, 24701(2016).</li>
<li>Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multi-electrode+array+recordings+in+studies+of+network+synaptic+plasticity+in+both+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space.</a> Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).</li>
<li>Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+reliably+investigating+hippocampal+sharp+wave-ripples+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro.</a> PLoS One. 4 (9), e6925(2009).</li>
<li>Aiba, I., Noebels, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+depolarization+in+the+brainstem+mediates+sudden+cardiorespiratory+arrest+in+mouse+SUDEP+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models.</a> Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246(2015).</li>
<li>MA, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMA%2C+R+%22Jasper%27s+Basic+Mechanisms+of+the+Epilepsies+%22">Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies </a>. Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).</li>
<li>Motamedi, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+epileptiform+activity+by+cooling+in+rat+hippocampal+slice+epilepsy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models.</a> Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).</li>
<li>Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+seizure+termination+by+focal+cooling%3A+temperature+dependence+and+automated+seizure+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection.</a> Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Multilaterale milieu-akkoorden zijn een instrument van onschatbare waarde voor neurofysiologie onderzoeken en rijpheid hebben bereikt in de afgelopen jaren dankzij tientallen exploratie en ontwikkeling. MEA's bieden in vergelijking met conventionele veld potentiële opname, het grote voordeel van een hoger aantal waarnemingspunten en bekende tussen elektrode afstand, die cruciaal zijn voor het nauwkeurig lokaliseren neuronale netwerk interacties.
De MEA opname-techniek kan ook worden gekoppeld aan andere electrofysiologie benaderingen, zoals patch-clamp opname15, om te onderzoeken de relatie tussen enkel neuron en neuronale netwerkactiviteit. Bovendien kan de mogelijkheid van het visualiseren van veld potentials en multi-unit activiteit tegelijkertijd bieden waardevolle inzichten in de correlatie tussen de activiteit van kleine neuronale ensembles en collectieve neuronale netwerken. De combinatie met spanning-gevoelige kleurstoffen, calcium beeldvorming, en optogenetics29 kan afgeleid neurofysiologie fenomenen met behulp van polyedrale benaderingen. Naast farmacologische studies, de mogelijkheid van het uitvoeren van zowel opname en stimulatie met hetzelfde systeem maakt de MEA opname techniek zeer krachtig en veelzijdig: bijvoorbeeld, is het mogelijk om te bestuderen van de Synaptische plasticiteit fenomenen op de de kern van geheugen vorming30, met behulp van de protocollen van de neuromodulatie gepresenteerde, die relevant zijn voor DBS voor de behandeling van epilepsie en een breed scala aan aandoeningen van de hersenen. De recente bewijs dat de MEA opname-techniek met succes kan worden toegepast op de hersenen met epileptische weefsel16 toont zijn onschatbare waarde nut in epilepsie onderzoek, zowel om te begrijpen van de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verwoestende ziekte en te fine-tunen DBS algoritmen te verbeteren het.
Echter MEAs het nastreven van electrofysiologie experimenten onder 'limit' voorwaarden voor segmenten van de hersenen, als gevolg van de eis van een verzonken opname-kamer en de noodzaak om de hersenen te laten dwingen snijd rust op het stevige substraat waar de micro-elektroden zijn geïntegreerd. Hersenweefsel wordt dus geen voldoende zuurstoftoevoer, die op zijn beurt kan invloed hebben op de kwaliteit van de opnamen.
Het protocol hier beschreven kan betrouwbaar opnemen en bestuderen van de ictogenesis in knaagdieren limbische netwerken gekoppeld aan multilaterale milieu-akkoorden met behulp van het model van de acute in vitro 4AP en voeren van langdurige tijdperken van de elektrische stimulatie, waarmee relevante informatie voor de evaluatie van DBS beleid.
Eerdere studies over elektrische neuromodulatie van epileptische limbische netwerken gebaseerd op het gebruik van conventionele veld potentiële opname hebt gebruikt muis of rat hersenen segmenten met soortgelijke resultaten24,-25; maar het gebruik van rat hersenweefsel bleek meer uitdagend, redelijkerwijs als gevolg van de zwakkere connectiviteit ten opzichte van hersenweefsel verkregen muizen7. Met betrekking tot de MEA techniek zijn muis hersenen segmenten geschikt op grond van hun kleiner. Bovendien, gezien het hogere tarief van voorkomen van Ictale-achtige lozingen in muis tegenover rat hersenweefsel, is het mogelijk om te testen aanzienlijk meer segmenten van de hersenen gedurende een experimentele dag, waardoor op zijn beurt verzamelen van de gegevens sneller en efficiënter, en kan het aantal gebruikte dieren te verminderen.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:
Ictale lozingen opgenomen met behulp van de aangepaste kamer beschreven hier lijken te zijn vergelijkbaar in duur en tarief van voorkomen die waargenomen met behulp van de conventionele MEA ring kamer en hetzelfde MEA type (planar micro-elektroden, vgl. 17). Het moet echter worden benadrukt dat hersenen segment dikte aanzienlijk moet worden verlaagd wanneer met behulp van de conventionele ronde opname kamer samen met een lage perfusie-tarief (1 mL/min), die een belemmering voor de succesvolle voortzetting van neuromodulatie vormen kan verschuldigde experimenten om slechte verbindingen.
In dit protocol biedt een laag-volume aangepaste opname kamer geïnspireerd door patch-clamp opname kamer ontwerp stabiele en betrouwbare laminaire flow die is van cruciaal belang voor de succesvolle uitoefening van MEA opnamen; het laat ook de hersenen segment dikte 400 µm verhogen met het oog op een eerlijke trade-off tussen weefsel levensvatbaarheid en intrinsieke connectiviteit. Het wordt immers erkend dat laminaire flow van de oplossing voor het opnemen in de kamer is wenselijk voor hersenen segment electrofysiologie, omdat het niet is beïnvloed door de temperatuur, zuurstof, en pH verlopen die worden waargenomen in de circulaire-flow opname ronde kamers19,20,31 (zoals degene voorzien van verkrijgbare MEA). Dergelijke verlopen voeren experimentele bias en ook schadelijk zijn voor het segment van de hersenen. Opname kamers van een relatief klein volume (~1.5 mL) samen met een hoge perfusie tarief (5-6 mL/min)16,31 toestaan voor passende uitwisseling van de perfusie-medium (≥3 tijden / min). De aangepaste kamer gemakkelijk kan worden verkregen uit commerciële bronnen tegen een betaalbare prijs of geproduceerd in eigen huis met behulp van 3D-printing technologie. Andere studies hebben gemeld MEA opnames van 400 µm dik menselijk brein segmenten16 -met behulp van de conventionele MEA ring kamer, terwijl het volume van de ACSF tot 1 mL en handhaving van een hoge perfusie tarief (5-6 mL/min) met behulp van een geluidsarme peristaltische pomp. Echter, de auteurs hebben gebruikt een ander model van ictogenesis, dat wil zeggen, de lage Mg2 +, die is waarschijnlijk dat minder beïnvloed dan het 4AP-model door ephaptic mechanismen met betrekking tot aanzienlijke stijging van de concentratie van extracellulaire K+ 11 , 22. Wij hebben gevonden dat een hoog perfusie-tarief is niet wenselijk in het 4AP-model, mogelijk als gevolg van de snelle wash out van geaccumuleerde extracellulaire K+, die wellicht aanzienlijk worden verhoogd in de opname ACSF16. In feite Ictale gebeurtenissen te zien meer 'gedeelde' wanneer ASCF perfusie snelheid werd verhoogd tot 2-3 mL/min en de hersenen-segment was ondergedompeld door een dikke laag van de ACSF, overwegende dat volwaardige lozingen exposeren robuuste tonic-klonische onderdelen kon worden hersteld bij de terugkeer naar een lager tarief voor perfusie (1 mL/min) en een dunner ACSF laag rechts op het weefsel oppervlakte niveau (gegevens niet worden weergegeven). De zaal van de aangepaste opname in dit protocol omschreven kunt uitwisselen van het medium perfusie 3 - 5 keer / min bij een debiet van 1 mL/min. Zo is de algehele zuurstoftoevoer naar de hersenen segmenten sterk verbeterd zelfs bij relatief lage perfusie tarieven, terwijl nog het waarborgen van een stabiele temperatuur en hoge signaal-/ ruisverhouding opnemen. Bovenal is het mogelijk om te houden van de concentratie van de extracellulaire K+ op een fysiologische waarde.
Het 4AP model van ictogenesis vereist geen elke wezenlijke verandering van de Ionische samenstelling van ACSF, zoals verlaging Mg2 + of toenemende K+, en biedt het unieke voordeel om zowel de excitatory als de remmende overbrengingen intact te houden 12, een aspect dat zeer relevant is in epilepsie onderzoek in het licht van de cruciale rol van glutamaterge zowel GABAergic netwerken in epileptiform synchronisatie (Zie 7). De 4AP-ACSF gebruikt in dit protocol bevat een fysiologische K+ -concentratie (3,25 mM) en een iets lagere Mg2 + concentratie dan het bedrijf ACSF (1 mM versus 1.3 mM). Deze concentratie valt nog steeds binnen de gerapporteerde fysiologische waarden van Mg2 + concentratie in het CSF van knaagdier en het wordt gebruikt in veel laboratoria (zie bijvoorbeeld17,,18). Het doel van het protocol beschreven, hebben we gevonden dat deze lichte daling heeft de voorkeur om te helpen bij het effect van 4AP.
In vorige werk, is 4AP toegepast op het segment van de hersenen wanneer het al binnen de opname kamer17,18 geplaatst was. Tenzij de experimentator observeren van de latentie van de tijd tussen de toepassing van de 4AP en het begin van de epileptiform patronen moet, vinden wij dat deze aanpak nogal tijdrovend is en niet geschikt is om de langdurige opname en stimulatie sessies in dit protocol beschreven. Pre-incubatie van hersenen segmenten in 4AP bij 32 ° C kunt sparen veel experimentele tijd, omdat de hersenen segmenten kunnen worden vooraf behandeld in serie terwijl het nastreven van het experiment met behulp van andere weefselsecties.
De langdurige levensvatbaarheid van hersenen segmenten wellicht handig om te analyseren netwerkfuncties op de lange termijn. Bovendien is hun verbeterde veerkracht aan repetitieve elektrische stimulatie van groot voordeel als de experimentator wil vergelijken verschillende stimulatie-protocollen, die moeten worden uitgevoerd in hetzelfde segment hersenen voor statistische robuustheid. In onze handen, wanneer testprotocollen 3 stimulatie, elk voorafgegaan door een fase van de controle en gevolgd door een herstelfase, het experiment kan duren 3-5 h. In dit verband is live MEA toewijzing cruciaal om te activeren het juiste traject en onderdrukken in plaats van het voordeel van ictogenesis via elektrische stimulatie. Onze gebruikersvriendelijke GUI is een snel, eenvoudig en flexibel instrument toewijzen van de elektroden van verschillende breinstructuur. In tegenstelling tot de commerciële software kan het toevoegen van aangepaste MEA lay-outs zelfs met elementaire programmering vaardigheden. Afbeeldingen kunnen worden verworven op heldere gebied; Dus, is een algemene doel-camera die goede resolutie heeft en past op een Microscoop geschikt. Een omgekeerde Microscoop is essentieel voor het visualiseren van de microelectrodes positie ten opzichte van het segment van de hersenen, aangezien dit worden onder het weefsel verborgen zou als met behulp van een rechtop Microscoop. Een stereomicroscoop wordt echter aanbevolen naast het omgekeerde type als de experimentator uitvoeren van mes-snijdt moet verstoort of specifieke neuronale studierichtingen.
Ten slotte, een ander voordeel van de voorgestelde aanpak is de vergadering van de goedkope en relatief gemakkelijk van de meeste van de vereiste hulpmiddelen, zoals de kamer aangepaste opname en de kamers van het bedrijf, het warme bad en het segment anker, evenals het onnodige gebruik van een dure Geluidsarme peristaltische pomp.
Beperkingen van de techniek:
MEA opname niet mogelijk visualiseren van zeer langzame golven, dat wil zeggen, DC verschuivingen in het signaal. Dergelijke verleggingen basislijn kunnen helpen asymptotische meting van Ictale kwijting duur en, meest belangrijk, ze zijn fundamenteel voor het bestuderen van corticale verspreiden depressie (een verschijnsel dat betrekking heeft op plotselinge onverwachte dood in epilepsie32 en wordt gedeeld tussen epilepsie en migraine33).
Met betrekking tot elektrische neuromodulatie kunt het protocol hier beschreven verschillende stimulatie sessies uitvoeren zonder hersenen segment levensvatbaarheid. We kunnen maximaal 3 sessies van de stimulatie van 20-45 min, vergelijkbaar met wat in eerdere werk25gemeld uitvoeren. Hoewel de hersenen segmenten kunnen waarschijnlijk weerstaan een hoger aantal sessies van de stimulatie of langer stimulatie protocollen, testte wij niet hersenen segmenten in dit opzicht. Het is raadzaam om de beperking van het aantal stimulatie protocollen tot en met 3 en het vermijden van langdurige (≥60 min) stimulatie sessies, die hersenweefsel gehandhaafd onder deze limiet omstandigheden, tot het uitblijven van herstel bij stimulans geldopname aanzienlijk kunnen benadrukken.
Kritische stappen binnen het Protocol:
Verschillende kritieke factoren kunnen een belemmering vormen de succesvolle uitoefening van opname en modulatie van de epileptiform-activiteit in de hersenen segmenten gekoppeld aan MEA. Naast de knaagdiersoort gebruikt en de kwaliteit van de segmenten van de hersenen, het percentage van de perfusie tijdens opname en de dynamiek van de stroom van de ACSF (dwz., laminaire versus circulaire) binnen de opname kamer, we hebben geconstateerd dat de voorwaarden voor herstel en lange termijn onderhoud van segmenten van de hersenen alsook de wijze van toepassing van de 4AP zijn de meest kritische stappen.
Bij het gebruik van een verzonken bedrijf kamer is het van cruciaal belang voor het opslaan van de segmenten van de hersenen bij kamertemperatuur te behouden weefsel netwerk hersenactiviteit en het voordeel van de inductie van Ictale-achtige lozingen door toepassing van de 4AP. In onze handen verslechterd herstel en onderhoud bij 32 ° C het hersenweefsel binnen 3-4 uur van het snijden.
Incubatie van hersenen plakjes in 4AP-ACSF bij kamertemperatuur en opname bij 32 ° C is, echter niet wenselijk. We hebben veel problemen in het observeren van robuuste terugkerende Ictale lozingen in deze voorwaarde gevonden. Inderdaad, lage temperaturen in het bereik van 20-24 ° C hebben gemeld te temperen of zelfs te voorkomen 4AP-geïnduceerde ictogenesis beide in vitro34 en in vivo35. Dus, de 4AP-incubatie en opname-temperaturen moeten vallen binnen de 30-34 ° C en gepaard moeten gaan. Om te voorkomen dat het hersenweefsel onder teveel stress als gevolg van de gelijktijdige inductie van hyperexcitability door de 4AP en de plotselinge blootstelling van hersenen segmenten van kamertemperatuur aan de warme (32 ° C) 4AP-ACSF, is het van fundamenteel belang voor het uitvoeren van een tussenliggende vooraf opwarming van de aarde stap en laat die de hersenen segmenten koeien op het bedrijf ACSF bij 32 ° C gedurende 20-30 min. deze stap overslaan invloed kunnen zijn op de inductie ictogenesis door 4AP.
Een ander aspect dat moet worden genoemd is het belang van D-glucose-concentratie in de ACSF na het snijden. Een concentratie van 25 mM behoudt de hersenen segmenten beter dan de concentratie van de 10 mM gebruikt in veel laboratoria en het verbetert ook het tarief van voorkomen van Ictale activiteit, die 2-fold sneller (, waardoor het makkelijker om te zetten van een lange reeks van experimentele protocollen in verschillende segmenten van de hersenen elke dag).
Tot slot moeten enkele belangrijke fijne details tijdens de segmenteringshulplijnen procedure worden genoemd. Ten eerste, sta niet toe de de hersenen intact en de segmenten van de hersenen te bevriezen in de kou snijden ACSF. Koeling van de hersenen voor < 2 min volstaat gezien de kleine omvang van de hersenen van de muis. Weefselsecties moeten onmiddellijk uit de buffer lade worden overgedragen aan de spoeldouche bekers bij kamertemperatuur. Spoelen van het snijden is ACSF heel belangrijk dat anders de hoge sacharose concentratie zal maken de hersenen segmenten aan de nylon gaas van de kamer van het bedrijf vasthouden. Om effectief spoelen het weefsel, is het belangrijk om te minimaliseren van de snijden ACSF inhoud van de Pipet van de overdracht om niet vervuilen het bedrijf ACSF overdreven. De 2-traps spoelen helpt bij het minimaliseren van verontreiniging. Na voltooiing van de segmenteringshulplijnen procedure, moeten weefselsecties worden overgedragen onmiddellijk uit de spoeldouche bekers in de vergaderzaal van bedrijf, waar de zachte nylon mesh geschorste halverwege in het bedrijf ACSF weefsel oxygenatie kan aan beide zijden. Hetzelfde principe moet worden toegepast in alle stadia na de segmenteringshulplijnen procedure: hersenen segmenten moeten nooit zitten aan de onderkant van het bekerglas, ze mag niet in contact met de zijkanten van de kamers van het bedrijf, en ze moeten nooit met elkaar in contact, noch overlappen.
Wijzigingen en probleemoplossing:
ACSF samenstelling kan worden aangepast van de experimentator. Bijvoorbeeld kunnen drugs worden toegevoegd aan het ontleden van de bijdrage van bepaalde neurotransmitters of ionenkanalen om de werkzaamheid van elektrische neuromodulatie. Bovendien, pyrodruivenzuur en ascorbinezuur (Zie tabel 2) mag achterwege blijven, hoewel wij vinden dat zij een krachtige neuroprotectieve rol uitoefenen. In tabel 3 rapporteren we de meest voorkomende problemen die kunnen worden aangetroffen in dit protocol en hoe om te gaan met hen.
Conclusies:
MEA opname is ongetwijfeld een waardevolle techniek inspelen op de interactie van neuronale netwerken in gezondheid en ziekte. Naast farmacologische studies is het ook mogelijk om elektrische neuromodulatie protocollen die relevant voor DBS toegepast op epilepsie en andere neurologische aandoeningen zijn. In dit protocol, hebben we aangetoond dat het mogelijk om te reproduceren van typische periodieke stimulatie experimenten met vergelijkbare resultaten verkregen met de conventionele extracellulaire veld potentiële opname en externe elektroden te stimuleren. De toenemende beschikbaarheid van commerciële gebruiksvriendelijke apparaten en geavanceerde software-instrumenten maken de MEA opname techniek ook geschikt voor gesloten-lus stimulatie experimenten, zodat ad hoc stimulatie aan het hersenweefsel en onderzoeken van de bijdrage van de feedbackmechanismen neuronale netwerk antwoorden.

Epilepsie is een levensbedreigende progressieve aandoening veroorzaakt door ongecontroleerde activiteit van de hersenen1; het draagt onder de hoogste last van ziekte en belangrijke sociale stigma2,3. TLE is het meest voorkomende syndroom (40%) en de meeste vaak (~ 30%) resistent tegen anti-epileptische medicatie4. Terwijl chirurgische ablatie van de epileptogene weefsel de conditie van de patiënt verbeteren kan, het is niet haalbaar in alle patiënten en kan geen garantie voor een volledig beslag-vrij leven5. Modulatie van epileptische limbische netwerken door elektrische DBS is een veelbelovende aanpak als farmacologische behandeling of Neurochirurgie zijn niet geschikt.
Knaagdier hersenen segmenten zijn een waardevol instrument om te bestuderen hoe neuronale netwerken functie in gezondheid en ziekte6 door middel van in vitro electrofysiologie technieken, zoals ze, ten minste in deel, de oorspronkelijke architectuur en connectiviteit van de hersenen behouden regio('s) van belang (ROI). In het bijzonder, horizontale gecombineerde hippocampus-Entorinale cortex (hippocampus-EG) segmenten omvatten de essentiële neuronale netwerken die betrokken zijn bij TLE en in in vitro TLE onderzoek7daarom regelmatig werkzaam zijn.
Inbeslagneming-achtige activiteit kan acuut worden veroorzaakt in plakjes van de hersenen door het veranderen van de Ionische samenstelling van de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF), zoals het verminderen van magnesium terwijl het verhogen van kalium8,9,10, of door middel van farmacologische manipulaties, zoals het blokkeren van remmende GABAergic activiteit (Zie11 voor een algehele herziening). Deze modellen zijn echter gebaseerd op de eenzijdige wijziging van excitatie en inhibitie; ze staan dus geen bestuderen de interactie en de gezamenlijke bijdrage van excitatory en remmende netten te ictogenesis. Continue perfusie van segmenten van de hersenen met de convulsant drug-4AP verbetert zowel de excitatory als de remmende transmissie, waardoor acute ictogenesis studeren terwijl synaptic activiteit over het algemeen intact12.
MEA's laten opnemen van de elektrische activiteit door neuronale netwerken uit een groter aantal waarnemingspunten in vergelijking tot conventionele extracellulaire veld potentiële opname, waar ruimtelijke beperkingen beperken het aantal elektroden die kunnen worden gegenereerd ondergebracht op de hersenen segment oppervlak. Bovendien, MEA chips bieden het extra voordeel van bekende tussen elektrode afstand, die erg handig voor trace propagatie is en beoordelen van de reizende snelheid van opgenomen signalen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor opname van beschaafde neuronen13,14, worden MEA's nu ook gebruikt te karakteriseren de elektrofysiologische kenmerken van acute hersenen segmenten knaagdieren15 en mens16verkregen. Dus, in het kader van epilepsie onderzoek, MEA's vertegenwoordigen een waardevol instrument voor het lokaliseren van interacties van de neuronale netwerken de kern van ictogenesis16,17,18.
MEA opname draagt echter inherent technische uitdagingen in de verkrijging of het behoud van een stabiele epileptiform patroon in heel lang (enkele uren) experimentele protocollen. Eerst, weefsel oxygenatie kan niet toereikend zou zijn binnen de grote en ronde ondergedompeld-type opname kamer19,20 typische van verkrijgbare MEAs, terwijl arme signal-to-noise verhouding en temperatuur instabiliteit kunnen beïnvloeden de kwaliteit van de opname wanneer een hoge perfusie-tarief (6-10 mL/min) wordt gebruikt voor het verbeteren van de zuurstoftoevoer naar de hersenen-segment (zie bijvoorbeeld de technische opmerkingen over verwarming en perfusie apparatuur21). Tweede, terugkerende lozingen met hoogfrequente componenten, zoals epileptiform de lozingen, worden nauwelijks nageleefd bij het gebruik van ondergedompeld-type opname kamers19; Dit is met name het geval wanneer de acute epileptiform-patroon chemisch geïnduceerde is en ephaptic mechanismen omvat, zoals het geval voor de 4AP model22 (Zie11 voor een uitgebreid overzicht). Om deze beperkingen te overwinnen, hebben onderzoekers verschillende strategieën voorgesteld. Bijvoorbeeld, zijn de perfusie tarief19,20 te verhogen terwijl het verminderen van de hersenen segment dikte (≤300 µM) en gebied17,18 cruciale factoren voor het bereiken van onvoldoende zuurstoftoevoer naar het weefsel. Verbeterde hersenen segment levensvatbaarheid kan daarnaast ook worden bereikt door gebruik te maken van geperforeerde MEA's (pMEAs), waardoor het hersenweefsel van beide zijden18zoogdierlevercellen.
Overwegende dat de beschreven aanpak aanzienlijk verbeterd de haalbaarheid van MEA opnemen vanaf de hersenen segmenten, ze zijn niet getest tegen verlengd (enkele uren) opnemen en elektrische stimulatie sessies, de laatste vertegenwoordigen een aanzienlijke stress voor het hersenweefsel. Langdurige opnamesessies kunnen worden verplicht te bestuderen van de evolutie in de tijd van de specifieke kenmerken van de epileptiform patronen die zou niet mogelijk zijn te ontmaskeren door op korte termijn metingen. In het kader van de DBS onderzoek, langdurige experimentele protocollen mogelijk moet evalueren en vergelijken van de effecten van verschillende stimulatie paradigma's in het zelfde segment van de hersenen.
Wanneer alleen spontane elektrische activiteit worden geregistreerd moet, in kaart brengen van de elektroden met betrekking tot de ROI gebeurt meestal a posteriori, dat wil zeggen, tijdens de analyse van de gegevens; in plaats daarvan, de studie van evoked reacties of elektrische neuromodulatie paradigma's vereist dat stimulatie worden afgeleverd aan specifieke ROI(s), de noodzaak van snelle en gemakkelijke live elektrode toewijzing tijdens het experiment te dicteren.
We illustreren hier, een eenvoudige experimentele protocol waarmee voor inductie en onderhoud van een stabiele 4AP-geïnduceerde epileptiform patroon in volwassen knaagdieren hersenen plakjes. De waargenomen activiteit weergave getrouwe van de elektrofysiologische kenmerken van dit model zoals gekenmerkt met behulp van conventionele extracellulaire electrofysiologie technieken. Het aantal uur of langer aanhoudt en outlasts aanhoudende elektrische stimulatie voor herhaalde langdurige tijdperken. De kamers gebruikt om te handhaven en uit te broeden van de segmenten van de hersenen kunnen worden gemakkelijk gemonteerd met behulp van standaard laboratorium benodigdheden (figuur 1A) Overwegende dat een aangepaste opname kamer waardoor optimale oplossing wisselkoers en laminaire flow (figuur 1B) worden verkregen uit commerciële bronnen of met behulp van 3D-printing technologie tegen een betaalbare prijs. Snelle toewijzing van de ROI(s) voor real-time bewaking en voor de selectie van stimulerende elektroden wordt mogelijk gemaakt door een aangepaste gebruikersvriendelijke GUI met de naam mapMEA, vrij beschikbaar op aanvraag.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57548/57548fig1.jpg"> Figuur 1: aangepaste apparatuur die wordt gebruikt voor dit protocol. (A) het bedrijf kamers voor herstel, vooraf opwarming van de aarde en pre-incubatie in 4AP worden geassembleerd met behulp van een bekerglas en een petrischaal. De petrischaal moet kleiner in diameter dan de breker en is op zijn plaats gehouden door middel van een zuiger van de spuit. De onderkant van de petrischaal wordt vervangen door een nylon gaas (van zachte kousen) gelijmd met cyanoacrylaat op de rand van de petrischaal. Zuurstof wordt geleverd via een gebogen wervelkolom naald 22 G, ingevoegd tussen de muren van de petrischaal en het bekerglas. Bubbels moeten tekenen van de kant van het bekerglas en nooit bereiken de nylon gaas om te voorkomen dat hersenen segment verplaatsing. De bovenkant van een petrischaal kan worden gebruikt als een deksel te voorkomen ACSF verdamping en handhaven van zuurstof saturatie. (B) aangepaste opname kamer. in: inlaat reservoir aan de canule verwarming en de referentie-elektrode. uit: outlet reservoir aan de zuiging naald. rec: opname kamer. (C) glas Pasteur Pipet, gekruld door brand-polijsten, gebruikt voor het behandelen van het weefsel en haar positie binnen de kamer opnemen aanpassen. (D) aangepaste segment hold-down anker. (E) de eindmontage van de opname-kamer op de MEA-chip gemonteerd. Een segment van de hersenen ligt op de bodem op zijn plaats gehouden door het anker. De rode pijl geeft de PTFE-buis die betrekking hebben op de canule Verwarming, overwegende dat de rode cirkel geeft aan de referentie-elektrode, een verzadigde KCl pellet ondergedompeld door ACSF in het inlaat-reservoir dat. De blauwe pijl geeft de zuig naald in het outlet-reservoir. <a href="/files/ftp_upload/57548/57548fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P7886</td><td>Benodigd voor MEA coating</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S9888</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P9541</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Adrich</td><td>795488</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>CaCl2*2 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>C3306</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD016</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S5761</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>MgCl2*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M2670</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>MgSO4*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M5921</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD023</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, 98%&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>107360</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>4-aminopyridine</td><td>Sigma-Adrich</td><td>A78403</td><td>Krampenverwekkend medicijn</td></tr><tr><td>STG-2004</td><td>Multichannel System</td><td>STG4004-1.6mA</td><td>4-kanaals stimulusgenerator met spanning (&plusmn;8 V) en stroomuitgang (&plusmn;1.6 mA)</td></tr><tr><td>MEA1060</td><td>Multichannel System</td><td>N/A</td><td>MEA versterker</td></tr><tr><td>planar MEA</td><td>Multichannel System</td><td>60MEA500/30iR-Ti w/o ring</td><td>Moet zonder ring zijn om het gebruik van de aangepaste opnamekamer mogelijk te maken</td></tr><tr><td>McRack</td><td>Multichannel System</td><td></td><td>Opnamesoftware</td></tr><tr><td>McStimulus II</td><td>Multichannel System</td><td></td><td>STG4004 controlesoftware</td></tr><tr><td>TC02</td><td>Multichannel System</td><td>TC02</td><td>2-kanaals thermostaat</td></tr><tr><td>PH01</td><td>Multichannel System</td><td>PH01</td><td>Verwarmde perfusiekaan</td></tr><tr><td>MPH&nbsp;</td><td>Multichannel System</td><td>MPH&nbsp;</td><td>Magneethouder voor PH01 en zuignaald</td></tr><tr><td>Elastostil E43</td><td>Wacker</td><td>E43</td><td>Elastomere afdichting gebruikt om de aangepaste opnamekamer op de MEA te monteren</td></tr><tr><td>MEA Custom Chamber</td><td>Crisel Instrument</td><td>SKE-chamber MEA</td><td>Aangepaste opnamekamer</td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm&nbsp;</td><td>Crisel Instrument</td><td>64-1309</td><td>Referentie-elektrode voor de aangepaste opnamekamer</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>Enzymatische reiniger</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The Mathworks</td><td></td><td>Programmaomgeving voor elektrodekaartlegging</td></tr><tr><td>VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td>Vibratoom</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td>Ag-AgCl elektrodepellet 1,0 mm (E205). Referentie-elektrode.</td></tr></tbody></table>

opname en moduleren van epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode arrays

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporale kwab epilepsie (TLE) is de meest voorkomende complexe partiële epileptische syndroom en de minste inspelen op medicijnen. Diepe hersenstimulatie (DBS) is een veelbelovende aanpak als farmacologische behandeling mislukt of Neurochirurgie wordt niet aanbevolen. Acute hersenen segmenten gekoppeld aan micro-elektrode matrices (MEA's) vormen een waardevol instrument om te bestuderen van neuronale netwerk interacties en hun modulatie door elektrische stimulatie. In vergelijking met conventionele extracellulaire opname technieken bieden ze de toegevoegde voordelen van een groter aantal waarnemingspunten en een bekende tussen elektrode afstand, waardoor het propagatie pad en de snelheid van elektrofysiologische studeren signalen. Weefsel oxygenatie kan echter worden sterk aangetast tijdens MEA opname, waarbij een hoge perfusie-tarief, dat ten koste van verminderde signal-to-noise verhouding en hogere trillingen in de experimentele temperatuur gaat. Elektrische stimulatie verder benadrukt het hersenweefsel, waardoor het moeilijk te voeren langdurige opname/stimulatie tijdperken. Bovendien moet de elektrische modulatie van hersenactiviteit segment te richten op specifieke structuren/studierichtingen binnen het segment van de hersenen, die vereisen dat toewijzing van de elektrode worden gemakkelijk en snel live uitgevoerd tijdens het experiment. Hier, we illustreren het uitvoeren van de opname en elektrische modulatie van 4-aminopyridine (4AP)-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes met behulp van vlakke multilaterale milieuovereenkomsten. We laten zien dat het hersenweefsel verkregen muizen rat hersenweefsel overtreft en dus beter voor MEA experimenten geschikt is. Dit protocol staat garant voor de generatie en het onderhoud van een stabiel epileptiform patroon dat getrouw reproduceert het elektrofysiologische functies waargenomen met conventionele veld potentiële opname, enkele uren of langer aanhoudt en outlasts opgelopen elektrische stimulatie voor langdurige tijdperken. Weefsel levensvatbaarheid gedurende het gehele experiment is bereikt dankzij het gebruik van een kleine-volume aangepaste opname kamer waardoor laminaire flow en snelle oplossing uitwisseling zelfs op lage (1 mL/min) perfusie tarieven. Snelle MEA toewijzing voor real-time bewaking en selectie van stimulerende elektroden wordt uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface (GUI).

We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuromodulatie voor epilepsiebehandeling, zoals welk hersengebied en welk stimulatieprotocol het meest geschikt zijn. Het grote voordeel van deze techniek is dat hersenslices van knaagdieren een vereenvoudigd, realistisch model van hersencircuits vertegenwoordigen, terwijl micro-elektrode-arrays meerdere observatiepunten met bekende inter-elektrodeafstand toestaan. Om de MEA voor te bereiden, spreidt u het elastomeer afdichtmiddel gelijkmatig uit over het onderoppervlak van de opnamekamer en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.Monteer vervolgens de opnamekamer met behulp van een pincet op de MEA en oefen lichte druk uit. Verspreid een afdichtlaag rond de buitenrand van de opnamekamer. Plaats vervolgens de MEA/kamer-assemblage in een gesloten, vochtige omgeving en laat deze overnacht op kamertemperatuur uitharden.Om de opnamebank voor te bereiden, stel de warme bad op 32 graden Celsius. Giet vervolgens de holding ACSF in de holding- en voorverwarmingskamers. Laat de oplossingen borrelen met een mengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide en verwijder eventuele vastgelopen luchtbellen met behulp van een omgekeerde Pasteur-pipet.Houd de holdingkamer op kamertemperatuur en plaats de voorverwarmingskamer in het warme bad. Bereid volgens standaardprocedures horizontale hippocampus-cortex hersenslices voor en laat ze minstens 60 minuten herstellen in de holdingkamer op kamertemperatuur. Giet 4AP ACSF in een incubatiekamer.Laat het vervolgens borrelen met een mengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide en verwijder eventuele vastgelopen luchtbellen met behulp van een omgekeerde Pasteur-pipet. Bedek vervolgens de kamer en breng deze over naar het warme bad. Zorg ervoor dat de voorverwarming ACSF en de 4AP ACSF temperaturen 30 tot 32 graden Celsius zijn.Gebruik een omgekeerde glazen Pasteur-pipet om een hersenslice over te brengen naar de voorverwarmingskamer en laat het weefsel 25 tot 30 minuten rusten. Breng vervolgens de hersenslice over naar de 4AP ACSF incubatiekamer en laat deze 60 minuten rusten. Laat de 4AP ACSF door de perfusieslang in een beker stromen tot er geen lucht meer in zit.Stop vervolgens de oplossingstroom. Plaats de droge MEA-chip in de MEA-versterker en bevestig het hoofd van de versterker. Gebruik vervolgens een plastic Pasteur-pipet om 4AP ACSF over te brengen naar het inlaat- en uitlaatreservoir van de opnamekamer.Bevestig de verwarmingskatheter aan een magnetische houder en plaats de punt ervan in de inlaatpoort van de opnamekamer. Bevestig vervolgens de magnetische houder aan een magnetische strip op het hoofd van de MEA-versterker. Verbind de perfusieslang met de katheter en de katheter met de thermostaat.Plaats vervolgens de zuignaald in het uitlaatreservoir. Controleer of er negatieve druk is door de zuignaald onder te dompelen in de ACSF en controleer op een constant laagfrequent zuiggeluid. Stel vervolgens de stroomregelaar in om een stroomsnelheid van één milliliter per minuut mogelijk te maken en begin met perfuseren.Zodra de 4AP ACSF door de katheter stroomt, zet de thermostaat aan. Stel de verwarmingskatheter in op 37 graden Celsius en de MEA-basis op 32 graden Celsius om een temperatuur van 32 tot 34 graden Celsius in de opnamekamer te bereiken. Plaats vervolgens de externe referentie-elektrode in het inlaatreservoir van de opnamekamer.Zodra het 4AP ACSF-niveau en de opnametemperatuur zijn gestabiliseerd zoals gewenst, draai de perfusie en de zuigstopkraan naar de uit-stand om ze tijdelijk te stoppen. Breng snel een hersenslice over naar de opnamekamer van de MEA met behulp van een omgekeerde glazen Pasteur-pipet. Pas de positie op het opnamegebied van de MEA aan zoals nodig met behulp van een gebrand polijst, gekrulde Pasteur-pipet of een zachte, compacte, kleine borstel.Plaats de houder op de hersenslice. Start de perfusie en de zuiging opnieuw door de stopkranen terug te draaien naar de aan-stand. Maak een foto van de hersenslice met een camera gemonteerd op een omgekeerde microscoopstandaard.Voer vervolgens de script mapMEA uit op de computersoftware om de GUI te starten om de elektroden in kaart te brengen. Klik op de knop Bladeren om de foto van de hersenslice te laden. Zorg ervoor dat de referentie-elektrode in de bovenste kolom van de linkerhelft van de MEA verschijnt.Klik vervolgens op de knop Aanwijzer activeren. Selecteer de bovenste en onderste elektroden in de linkerkolom van de array om de XY-coördinaten voor beelduitlijning en elektrodenkaart aan te geven. Selecteer in het vervolgkeuzemenu van het plaktype Horizontaal.Vink het selectievakje Standaardstructuren aan. Selecteer met behulp van de genummerde drukknoppen onder de foto van de hersenslice de elektroden die overeenkomen met de ROI en klik op de overeenkomstige drukknoppen in het structuurpaneel om ze toe te wijzen. Herhaal deze stap voor elke ROI.Druk vervolgens op de knop Opslaan. De software genereert een resultatenmap met een tabel met de geselecteerde elektroden en ROI's. Voor elektrofysiologisch onderzoek zet u de stimuluseenheid ten minste 10 minuten voorafgaand aan het stimulatieprotocol aan om zelfkalibratie en stabilisatie mogelijk te maken.Start vervolgens de stimuluscontrolesoftware en controleer of de stimulator en MEA-versterker correct zijn aangesloten, zoals aangegeven door een groene LED in het hoofdpaneel van de stimuluscontrolesoftware. Stel de stimulatie in in bipolaire configuratie. Sluit de stimuluseenheid aan op de grond.Verbind vervolgens de elektrodeparen in contact met de piramidale cellage van het CA1/proximale subiculum onder degenen die met het script mapMEA zijn gekarteerd. Om gegevens te verzamelen, drukt u op de afspeelknop in het hoofdpaneel van de opnamesoftware. Neem ten minste vier ictale ontladingen op.Voer vervolgens een snelle input/output-test uit om de beste stimulusintensiteit te identificeren. Gebruik hiervoor het hoofdpaneel om een vierkante bifasische positief-negatieve stroompuls te ontwerpen met een duur van 100 microseconden per fase. Vo

recording-modulation-epileptiform-activity-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video describes the technique for recording the epileptiform activity of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices ex vivo using electrophysiology or EEG set-up. This helps to study the dynamics and progression of epileptogenesis and screen potential therapeutic targets to treat epilepsy.

Electroencephalography-Based Recording Technique to Record the Epileptiform Activity

This protocol involves using a microelectrode array (MEA) to record electrical activity in a brain slice exposed to a seizure-inducing drug. The procedure includes positioning the brain slice in an MEA recording chamber, applying electrical stimulation to induce artificial seizures, and analyzing the resulting signals.

Monitoring Seizure-Induced Neural Electrical Activity in Brain Slices Using Microelectrode Arrays

This video demonstrates a method for high-resolution EEG recording in a rat model of focal epilepsy. It outlines the steps involved in preparing the rat, connecting a multichannel EEG mini-cap to the rat's scalp, and recording the EEG to identify seizure-related events characteristic of the epilepsy model.

Electroencephalography Recording in a Rat Model of Focal Epilepsy

This video demonstrates electroencephalographic (EEG) recording of epileptic seizures in epilepsy-induced rats. A rat with electrodes implanted in the ventral hippocampus is connected to the EEG recording system and placed in a plexiglass chamber. The rat is allowed to move freely while the brain activity is recorded to monitor the occurrence of seizures.

Electroencephalographic Recording of Epileptic Seizures in Epilepsy-Induced Rats

This video demonstrates the induction of ictal events in coronal cortical slices from a transgenic mouse expressing light-activated cation channels in cortical excitatory pyramidal neurons. The slice is placed in a recording chamber, and a recording electrode is inserted into the superficial cortical layer. Upon perfusion with a seizure-inducing drug that blocks potassium channels, the neurons become hyperexcitable and generate spontaneous ictal events. To generate on-demand ictal events, a...

Generation of Spontaneous and On-Demand Ictal Events in Mouse Brain Cortical Slices

We beschrijven hier hoe je multi-electrode matrix recordings van menselijke epileptische corticale weefsel uit te voeren. Epileptische weefsel resectie, slice voorbereiding en multi-electrode matrix recordings van interictale en ictal gebeurtenissen worden gedemonstreerd in detail.

Multi-electrode array Opnamen van Human Epileptische Postoperatieve Cortical Tissue

Studies hebben aangetoond dat cathodale transcraniële gelijkstroom-stimulatie onderdrukkende effecten kan hebben op geneesmiddelresistente epileptische aanvallen. In deze studie werd een in vitro experimentele opstelling bedacht waarin de gelijkstroom-stimulatie en de multi-elektrode array-registratie van aanvallen-achtige activiteit werden geëvalueerd in een herfsnede-preparaat van muizen. De parameters van de gelijkstroom-stimulatie werden geëvalueerd.

Direct-current stimulatie en multi-elektrode Array Registratie van Inbeslagneming-achtige activiteit in de muizen Brain Slice Voorbereiding

Het protocol beschrijft de methodologie van extracellulaire opname in de motorische cortex (MC) om extracellulaire elektrofysiologische eigenschappen te onthullen bij vrij bewegende bewuste muizen, evenals de gegevensanalyse van lokale veldpotentialen (LFP's) en spikes, wat nuttig is voor het evalueren van de neurale activiteit van het netwerk die ten grondslag ligt aan interessant gedrag.

Meerkanaals extracellulaire opname in vrij bewegende muizen

Hier schetsen we een protocol voor het gebruik van complementaire metaaloxide-halfgeleider high-density micro-elektrode array-systemen (CMOS-HD-MEA's) om aanvalsachtige activiteit van ex vivo hersenplakjes vast te leggen.

Hoogwaardige aanvalsachtige activiteit van acute hersenplakjes met behulp van een complementair metaaloxide-halfgeleider micro-elektrode-array-systeem met hoge dichtheid

Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.

Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden

Dit protocol is ontwikkeld om een betrouwbaar en gemakkelijk toegankelijk systeem te creëren voor het registreren van vrij bewegende EEG van knaagdieren.

Een kosteneffectief en minimaal invasief protocol voor chronische multi-site elektro-encefalografie-opname bij vrij bewegende muizen

Leer epileptiforme activiteit opnemen en moduleren in knaagdier hersenenplakjes met micro-elektrode arrays. Deze methode optimaliseert stimulatieprotocollen voor epilepsieonderzoek en verbetert inzicht in neurale circuitdynamiek.

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Meer video's verkennen