Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren
11 augustus 2018
Hier bieden we een demonstratie van het model van de cutane terugroepen zuig blister. Het model biedt een eenvoudige toegang tot het bestuderen van de menselijke in vivo adaptieve immuunresponsen, bijvoorbeeld in het kader van de ontwikkeling van een vaccin.
Het algemene doel van deze video is om de cutane recall-methode van zuigblaasjes te demonstreren, waarmee we antigeenspecifieke T-cellen en cytokinen kunnen oogsten die representatief zijn voor de adaptieve immuunrespons in vivo. Deze methode kan worden gebruikt om cellulaire reacties en adaptieve immuniteit bij mensen te bestuderen. Het grote voordeel van deze technologie is dat het ons mogelijk maakt om antigeenspecifieke T-cellen rechtstreeks van de plaats van de immuunreactie te oogsten met behulp van een relatief niet-invasieve en veilige methode.
Het basisprincipe van cutane recall is het deponeren van antigeen in de dermale laag van de huid. Bij individuen met bestaande immunologische herinnering aan het antigeen, zullen T-cellen migreren naar de plaats van de reactie en een lokale immuunrespons induceren waar specifieke T-cellen klonaal worden uitgebreid en gedifferentieerd in situ. Inductie van zuigblaasjes over deze reactie stelt ons in staat om deze specifieke T-cellen evenals de in vivo geproduceerde cytokinen te oogsten.
In deze videodemonstratie gebruiken we PPD als ons recall-antigeen. PPD wordt vaak gebruikt voor de diagnose van mycobacterium tuberculosis-infectie. Maar het induceert ook huidreacties bij mensen die eerder zijn ingeënt met het BCG-vaccin, zoals u in deze video zult zien.
Materialen voor de tuberculinehuidtest omvatten alcoholdoekjes, een spuit van één milliliter met een korte naald van 27 tot 30 gauge, en een oplossing van PPD goedgekeurd voor menselijk gebruik. Gebruik een PPD-oplossing van 20 tuberculine-eenheden per milliliter. Desinfecteer het glaasje met een alcoholdoekje.
En let op, de samenstelling kan variëren tussen fabrikanten. Bepaal vervolgens de injectieplaats op de ventrale zijde van de onderarm van de vrijwilliger en desinfecteer het gebied met een alcoholdoekje. Gebruik een steriele spuit van één milliliter met een 29 gauge, 12 millimeter vaste naald.
Meng voorzichtig en zuig 0,1 milliliter van de PPD-oplossing aan. Zorg ervoor dat er geen zichtbare bubbels zijn. Streek de huid en richt de naald onder een hoek van vijf tot vijftien graden, met de snijkant naar boven.
Breng de punt van de naald in de dermale laag van de huid en zorg ervoor dat de punt bijna zichtbaar is door de epidermis. Injecteer langzaam 0,1 milliliter PPD-oplossing. Bij correcte toediening zal onmiddellijk een papule van zes tot tien millimeter verschijnen.
De papule verdwijnt na ongeveer tien minuten. Meerdere deposities van PPD zijn mogelijk, maar kunnen extra ethische goedkeuring vereisen. Als twee injecties worden toegediend, streef naar maximale scheiding terwijl u op een goede afstand van de elleboog en polsgebied blijft.
De klinische huidreactie verschijnt binnen de eerste 24 uur en gaat gepaard met een jeukende sensatie. Meet de grootte van de huidreactie 48 tot 72 uur na de injectie. Bij het evalueren van de respons is het belangrijk om de induratie te meten en niet het erythema.
Palpeer de zwelling van de hoed met uw vinger. Markeer vervolgens de randen van de induratie met een balpen. Gebruik tenslotte een zachte liniaal om de diameter van de induratie te meten en noteer de resultaten in millimeters.
Na zeven dagen is het tijd om de zuigblaasje te induceren. Voor inductie van het huidzuigblaasje, gebruik een vacuümpomp met een bevestigde zuigkamer. Gebruik een commercieel verkrijgbaar of een aangepast apparaat.
Belangrijk is dat de pomp instelbaar moet zijn binnen het bereik van min 20 tot min 40 kilopascal en een stabiele en betrouwbare negatieve druk moet leveren. Het onderste deel van de zuigkamer bestaat uit een plaat met een klein gat dat in contact staat met de huid. Platen kunnen enkelvoudige of meervoudige gaten hebben en verschillende maten kunnen worden toegepast om de huidreactie te passen.
De bovenkant van de kamer moet visueel controle van het blaasje mogelijk maken. Voorafgaand aan de inductie, desinfecteer de huid en de kamerplaat. Zorg ervoor dat de arm comfortabel rust.
Bevestig en zet de kamer vast, hier door het gebruik van verstelbare riemen. Het centrum van de huidreactie zou zichtbaar moeten zijn door het gat in de onderplaat. Zet het zuigapparaat aan en stel de negatieve druk in op min 20 kilopascal.
Na dertig minuten, verhoog de druk naar min 25 kilopascal. Na 60 minuten, verhoog de druk verder naar min 30 kilopascal. En houd de druk hier totdat een enkele blaas volledig gevormd is.
De blaasinductiefase duurt normaal gesproken ongeveer een tot drie uur. Met de feitelijke blaasvorming die geleidelijk binnen de laatste 30 minuten plaatsvindt, zoals hier gedemonstreerd in hoge snelheid. Als er tekenen zijn van blaasbreuk of bloeding, wordt geadviseerd om langzaam de druk vrij te geven en de inductie vroegtijdig te stoppen.
Blaasjes kunnen verschijnen als enkele of meerdere samensmeltende blaasjes. Het proces gaat vaak gepaard met een jeukende sensatie. Nadat het blaasje volledig is gevormd, laat de druk los en verwijder voorzichtig de zuigkamer.
In correct geïnduceerde blaasjes is de epidermale laag volledig gescheiden van de dermale laag van de huid, waardoor een holte ontstaat gevuld met vloeistof. Bescherm het blaasje door een zachte dressing op het omringende huidgebied aan te brengen en een harde dop over het blaasje te plaatsen, hier van een 15 milliliter plastic buis. Bevestig de dop met een niet-allergene tape gevolgd door een zachte, rekbare bandage.
Instrueer de vrijwilliger om het beschermende verband 's nachts te houden. Verwijder de volgende dag voorzichtig de dressing en desinfecteer het blaasje gebied met spray. Gebruik een steriele spuit van 2 milliliter met een naald van 23 gauge om de inhoud van het blaasje te oogsten.
Breng de naald in de bovenste laterale kant van het blaasje dak en zuig langzaam de vloeistof aan. Vermijd het aanraken van de bodem van de holte, maar zorg ervoor dat u alle vloeistof oogst, omdat het blaasjevolume laag kan zijn, zoals in dit voorbeeld. Het ingestorte blaasje zal genezen zonder lit
Overzicht
Deze video demonstreert de methode van cutane recall via zuigblaren, waarmee in vivo antigen-specifieke T-cellen en cytokines kunnen worden geoogst. Deze techniek is bijzonder nuttig voor het bestuderen van humane adaptieve immuunresponsen, zoals bij de ontwikkeling van vaccins.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Adaptieve immuunrespons
- Vaccinontwikkeling
Achtergrond
- De zuigblestermethode biedt een niet-invasieve manier om immuunresponsen te bestuderen.
- Het maakt het mogelijk om T-cellen direct te verzamelen van de plaats van de immuunreactie.
- PPD wordt gebruikt als recall-antigeen om het immuungeheugen te evalueren.
- Deze methode kan helpen bij het begrijpen van de cellulaire mechanismen van immuniteit.
Doel van de studie
- Om de zuigblaartechniek voor het oogsten van immuuncellen te demonstreren.
- Om antigeenspecifieke T-celresponsen bij mensen te analyseren.
- Om een praktische gids te bieden voor de implementatie van deze methode in onderzoek.
Gebruikte methoden
- Injectie van PPD in de dermale laag van de huid.
- Inductie van zuigblaren voor het verzamelen van T-cellen en cytokines.
- Meting van huidreacties na injectie.
- Oogsten van blaarvloeistof voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van zuigblaren is aangetoond.
- Geoogste T-cellen en cytokinen kunnen in vitro worden geanalyseerd.
- Een heldere methodologie voor het meten van immuunresponsen is vastgesteld.
- De veiligheid en effectiviteit van de zuigblaartechniek zijn aangetoond.
Conclusies
- De zuigblestermethode is effectief voor het bestuderen van adaptieve immuniteit.
- Deze techniek kan helpen bij het onderzoek naar en de ontwikkeling van vaccins.
- Het biedt een waardevol instrument voor immunologische studies bij mensen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het bestuderen van humane T-cel recall-responsen in vivo biedt cruciale mechanistische inzichten voor de ontwikkeling van vaccins en de validatie van targets voor immunotherapie. De cutane recall-methode met zuigblaar maakt directe toegang mogelijk tot antigeenspecifieke T-cellen en cytokinemicro-omgevingen op de plaats van de immuunreactie, wat bijdraagt aan preklinische risicoreductie van T-cel-targetende middelen. Deze benadering vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door ex vivo bevindingen te koppelen aan de in vivo menselijke biologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door antigeenspecifieke polyfunctionele CD4+ T-cellen direct uit menselijk weefsel te isoleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele validatie van T-celdoelwitten in een ziekterelevant systeem.
- Strategische waarde: Faciliteert de identificatie van lead-moleculen door een hoog aandeel antigeenspecifieke cellen te leveren voor mechanistische screening.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream assay-standaardisatie met behulp van multiplex- en flowcytometrische read-outs.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van cytokineproductie en T-celfunctionaliteit ex vivo.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare herbruikbaarheid van het platform mogelijk voor het evalueren van effecten van verbindingen op menselijke geheugen-T-celresponsen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Toont de relevantie voor de ziekte aan via een BCG-gevaccineerd menselijk model van tuberculine-recall, wat aansluit bij translationele biomarkerstrategieën.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het vastleggen van in vivo-gegenereerde profielen van centrale en effector memory T-cellen.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door mechanistische ambiguïteit in studies naar cellulaire immuniteit te verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in de vroege ontdekkingsfase tot lead-identificatie en preklinische validatie, in het bijzonder voor T-celmodulerende therapieën en vaccinkandidaten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door het oogsten van klonaal uitgebreide, gedifferentieerde T-cellen op de plaats van de immuunreactie.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde protocollen voor blisterinductie en vloeistofextractie, wat resulteert in een consistente celviabiliteit voor downstream analyse.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van de frequentie van antigeenspecifieke T-cellen en polyfunctionele cytokineprofielen (bijv. IFN-γ, TNF-α, IL-2) voor de evaluatie van vergelijkende condities.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verband met preklinische continuïteit door aan te tonen hoe cellen afgeleid van zuigblesters langdurige geheugenresponsen weerspiegelen die in vivo zijn gegenereerd.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbare capaciteit voor het bestuderen van de menselijke adaptieve immuniteit binnen vaccin- en immunotherapieprogramma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit in menselijke immuunresponsen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de isolatie van antigeenspecifieke T-cellen uit menselijke huid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een late fase bij de ontwikkeling van immunotherapie.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en besluiten over verdere ontwikkeling op basis van mens-relevante gegevens over de immuunrespons.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in studies met menselijke vrijwilligers, cutane antigeenafgifte en technieken voor het opwekken van zuigblaren.
- Vereist een instelbare vacuümpomp (–20 tot –40 kPa), steriele spuiten, PPD-antigeen en centrifugatieapparatuur voor celverwerking.
- Vereist cross-team standaardisatie van protocollen voor het meten, oogsten en overbrengen van blaarvloeistof tussen immunologie- en klinische teams.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende antigeenmodellen en huidreactieplaatsen, terwijl consistente negatieve drukgradiënten worden gehandhaafd.
- Omvat praktische beperkingen zoals een variabele celopbrengst (15.000–200.000 cellen/blaar) en afhankelijkheid van het reeds bestaande immunologische geheugen bij vrijwilligers.
