Een familiale hypercholesterolemie menselijke lever chimeer muismodel met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten

Deze methode heeft beantwoord belangrijke vragen in het veld, zoals hoe je een menselijke lever chimeric muis model te genereren, familiale hypercholesterolemie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt het uitvoeren van drugstests in vivo. Deze techniek heeft syndicatie voor de behandelingen van familiale hypercholesterolemie.

Als een nieuwe therapie voor deze ziekte, het kan worden getest met behulp van dergelijke chimeric dier modellen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in familiale hypercholesterolemie, kan het ook worden toegepast op andere erfelijke leverziekten. 24 uur voor engraftment ontdooit u 40 microliter extracellulaire matrix per muis, door in een koelbox in een koude ruimte te plaatsen.

Chill een insulinespuit voor elke muis te worden geïnjecteerd en een doos van 200 microliter tips in een vier graden Celsius koelkast. Een uur voor engraftment, verwarm de cel dissociatie enzym, aangevuld met 50 microgram per milliliter van DNAase 1, op kamertemperatuur en plaats RPMI 1640 medium, aangevuld met 20 procent serum vervanging op ijs. Neem fasecontrastbeelden van iHeps om hun status vast te leggen, inclusief celmorfologie, groei en celdichtheid.

Was vervolgens twee maal elke put van iHeps met 2 milliliter calcium- en magnesiumionnenvrije PBS en voeg vervolgens een milliliter van het voorverwarmde celdissociatieenzym aan elke put toe. Breng de cellen acht tot tien minuten terug naar de couveuse. Controleer de celmorfologie onder de microscoop.

Wanneer de meeste van de cellen rond worden, voeg in gelijke volume van koud medium per put, pipette de cellen voorzichtig los te maken van de plaat, en breng de cel suspensie naar een nieuwe 15 milliliter buis. Deze stap is van cruciaal belang voor de betrouwbaarheid van hepatocyten. Als de cellen moeilijk los te maken van de plaat, kunnen sommige worden overgelaten op de plaat.

En als de cellen loskomen, dan pipet voorzichtig na centrifugatie, om een eencellige suspensie te verkrijgen. Herhaal de cel-detachement procedure voor elke put totdat bijna alle bijgevoegde cellen worden verzameld. Dan centrifugeren op 200 g gedurende drie minuten op vier graden Celsius.

Na centrifugatie, verwijder de supernatant en opnieuw opschorten van de cellen met twee milliliter koude PBS in de vijftien milliliter buis. Pipette de cellen voorzichtig om een eencellige suspensie te verkrijgen. Vervolgens, geef de cellen door een 40 micron cel zeef om aggregaten te verwijderen.

Normaal gesproken kunnen een tot twee miljoen cellen over worden geoogst na weinig-ter-ing. Voeg vervolgens microliters van 0,4 procent Trypan blauwe oplossing toe aan 20 microliter celsuspensie. Tel de cellen en noteer de concentratie van celsuspensie als C.Bereken het vereiste volume van celsuspensie om een miljoen cellen per muis te injecteren.

Wijs vervolgens het vereiste volume van de celsuspensie toe in buizen van 15 milliliter en centrifuge op 200 g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van de supernatant, opnieuw opschorten van de cellen in 27,5 microliter koude PBS per muis. En voeg dan een gelijk volume extracellulaire matrix toe voor een eindvolume van 55 microliter per muis.

Zet nu een van de koude insulinespuiten op ijs. Trek de zuiger los, breng 55 microliter celsuspensie in de spuit en zet de zuiger terug. Ontlaad bubbels zorgvuldig, en zet de spuit weer op ijs.

Zorg ervoor dat LRG-muizen goed verdoofd zijn voordat u met de injectieprocedure begint. Breng veterinaire zalf over de ogen om droogte te voorkomen tijdens de anesthesie procedure. Zodra de muis heeft verloren spierreflex aan stimulatie, plaats het in de juiste, laterale, decubitus positie.

Breng een dikke laag ontharingscrème aan op het incisiegebied in de linkerflank en laat vijf tot acht minuten staan. Verwijder de ontharingscrème en het haar door het gebied af te vegen met een met water bevochtigd gaaskussen. Schrob de linkerflank drie keer met 70 procent ethanol.

Zoek dan de milt, die kan worden gezien in de linkerflank. Gevolgd door een laatste weken met betadine voor desinfectie. Na het gebruik van een schaar om een 0,5 tot een centimeter incisie in de huid en buikwand te maken, gebruik tangen om de milt te exterioriseren door zachtjes te trekken het omliggende vetweefsel.

Stabiliseer de milt voorzichtig met een uitstrijkje. Steek de naald van de insulinespuit drie tot vier millimeter in de parenchyma van de milt en injecteer voorzichtig ongeveer 50 microliter celsuspensie. Trek de naald in en plaats een wattenstaafje gedurende een minuut over de injectie om bloedingen en morsen van materiaal te voorkomen.

Breng de milt terug naar het buikvlies en sluit de wond met nylon hechtingen van vijf personen. Plaats de muis na het hechten in een schone kooi met gemakkelijke toegang tot voedsel en water. Begin met het verwijderen van de inwendige organen van de vers geëuthanaseerde muis, zodat de dalende aorta, parallel aan de wervelkolom, zichtbaar is.

Ontleed dan het aangrenzende weefsel en verwijder het hart. Gebruik fijne schaar om de aortae te ontleden, waarbij ze elk in koude, zuurstofrijk Krebs-oplossing worden gebracht. Breng na het verzamelen de aortae in Krebs-oplossing over op een petrischaal met siliconen bedekte schaaltje.

Pin het bindweefsel om de aortapositie te bevestigen zonder het uit te rekken. Gebruik onder een steriele microscoop fijne tangen en een veerschaar om de aorta vrij van het omringende vet- en adventitial weefsel te ontleden zonder de vaatwand te beschadigen. Snijd vervolgens elke aorta in anderhalve tot twee millimeter lengte segmenten.

Snijd vervolgens een twee centimeter lang stuk van 40 micron dikke roestvrijdraad en steek voorzichtig in het aortalumen. Houd de draad om het segment over te brengen naar de draad myograaf kamer, gevuld met zuurstofrijke Krebs oplossing. Om de lengte van de aortaesegmenten te meten bij het bestuderen van contractiliteit, plaatst u elk segment loodrecht tussen de kaken en registreert u de D1-meting op de micrometer.

Verwijder vervolgens het segment en beweeg de kaken samen. Noteer de D0-meting en bereken de lengte van het segment. Klem vervolgens de draad en zet deze vast met de schroevendraaier terwijl u het niet-gestrekte segment tussen de kaken plaatst.

Voor normalisatie vóór het experiment, stel de myograaf op nul in de niet-uitgestrekte positie. Beweeg vervolgens langzaam de kaken uit elkaar en observeer de aortaspanningsverandering tot het bereiken van drie millinewton. Na 15 minuten giet u de oplossing uit de myograafkamer en vervang u deze door een verse Krebs-oplossing.

Na het wachten voor nog eens 15 minuten, opnieuw aanpassen van de spanning tot drie millinewton. Verander vervolgens de standaard Krebs-oplossing naar Krebs-oplossing aangevuld met 60 millimolar kaliumchloride, om gedurende ten minste vijftien minuten contractie te veroorzaken. Spoel met verse Krebs-oplossing drie keer en voeg vervolgens steeds hogere concentraties fenylephrine toe.

Bijvoorbeeld, 10 nanomolar tot 100 micromolar. Voeg vervolgens, na het uitwassen met standaard Krebs-oplossing, een enkele concentratie fenylephrine toe, bij ongeveer 70 procent van de maximale contractie. Wanneer de contractie stabiel is, voeg dan met tussenpozen van twee minuten de concentraties acetylcholine toe.

Bijvoorbeeld, een tot drie nanomolar tot tien tot dertig micromolar om vasodilatatie te induceren. Dit beeld toont een representatief geheel-sectie gescand beeld van menselijke albumin het bevlekken in een muislever opnieuw bevolkt met low-density lipoprotein receptor-deficiënte iHeps. Pijlen geven clusters van menselijke iHeps gegraveerd in de muislever.

De clusters van geënteerde menselijke iHeps worden hier in meer detail gezien. Deze scatterplot grafiek toont het percentage van herbevolkte menselijke albumin positieve cellen die overeenkomen met iHep met gebieden in de muislever, van verschillende donor-iPSCs. Dit is een representatief beeld van immunohistochemische kleuring voor menselijke kernen in een muislever, met geënteerde familiale hypercholesterolemie iHeps.

De staafgrafiek toont het percentage herbevolkte menselijke kernen positieve iHeps van verschillende donor-iPSCs in LRG-muizenlevers. Dit zijn representatieve beelden van menselijke albumine en menselijke kernen vlekken op twee opeenvolgende delen van een muis lever, opnieuw bevolkt met wild-type iHeps. Ten slotte toont dit beeld endotheelafhankelijke vaatverwijding van de aorta in familiale hypercholesterolemie menselijke leverluismumerische muizen, in reactie op toenemende concentraties acetylcholine.

Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe de menselijke lever chimeric muizen te genereren, met behulp van menselijke iPSC-afgeleide hepatocyten.