Name: Adeno-Associated Virus-gemedieerde levering van CRISPR voor cardiale Gene bewerken in muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer in vivo cardiale genbewerking met CRISPR en recombinant adeno-associated virus in muizen. Deze methode herstelt dystrofine-expressie en biedt een veelbelovende therapeutische strategie voor dystrofische cardiomyopathie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.H. wordt ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health grants (R01HL116546 en R01 AR064241).

De dieren die worden gebruikt in dit protocol werden op The Ohio University Laboratory Animal staatsmiddelen gehouden overeenkomstig de richtsnoeren voor het gebruik van de dierlijke. Alle dierlijke studies werden toegestaan door de institutionele Animal Care gebruik en de Commissie ter beoordeling van de Ohio State University.
1. ontwerp en klonen van gRNAs in de CRISPR-Vector
<ol><li>Selecteer 2 gRNAs richtend Dystrofine intron 20 en intron 23 (i20 en i23) voor SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT en i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (de volgorde van de PAM is onderstreept en cursief). Opmerking: De doel-sites voor i20 en i23 zijn ongeveer 23 kilo basenpaar (kbp) weg. Verstoort of een codering gen, twee gRNAs, gericht op de gemeenschappelijke exons met de NNGRRT PAM volgnummer voor SaCas9 (bij voorkeur NNGAAT, NNGGGT en NNGAGT) en afstand binnen 20 kbp worden aanbevolen.</li>
	<li>Kunt de volgende parameters van de PCR ontharden de gRNA oligos (100 µmol/L) in 1 x gloeien buffer (de 5 x gloeien buffervoorraad bevat 0,5 mol/L K-acetaat, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetaat, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 cycli van 95 tot en met 59 ° C met een 0.4 ° C dalen cyclus voor 20 s, 90 cycli van 59 tot en met 32 ° C met een daling van 0,3 ° C per cyclus voor 20 s, 20 cycli van 32 tot en met 26 ° C met een daling van 0,3 ° C per cyclus voor 20 s.</li>
	<li>Afbinden van oligos van de ontharde gRNA in de pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA met behulp van BsaI en T4 DNA ligase in een reactie (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 1 µL gegloeid oligos 1.5 µL 10 x T4 DNA ligase buffer, 0,5 µL T4 DNA ligase, 1 µL BsaI, 10 µL ddH2O ), met de volgende reactie voorwaarde in een PCR-cycler: 5 cycli van [37 ° C 5 min en 16 ° C 10 min]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.</li>
	<li>Het product van de afbinding 15 µL omvormen 30 µL bevoegde cellen, plaat van de cellen in agarplaat met 100 µg/mL ampicilline en cultuur bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
	<li>Pick-up de kolonies en de cultuur in LB opslagmedium met 100 µg/mL ampicilline bij 37 ° C, 250 rpm in een shaker incubator voor 3-4 h 5-10.</li>
	<li>Het scherm van de kolonies door PCR: 10 µL 2 x PCR master mix 8 µL ddH2O, 1 µL E. Coli cultuur, 1 µL 10 µmol/L U6-forward primer, 1 µL i20 of i23 gRNA reverse primer. De PCR fietsen parameters: 95 ° C 5 min, 35 cycli van 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.</li>
	<li>Bereiden 5 mL cultuur van de positieve klonen door toevoegen 4 mL verse LB middellange containing100 µg/mL ampicilline, en cultuur 's nachts bij 37 ° C, 250 rpm.</li>
	<li>Zuiveren van de plasmide DNA met behulp van de juiste plasmide extractie kit en controleer of de plasmide door Sanger sequencing met de U6-forward-primer.</li>
	<li>Cultuur van de C2C12 cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% Pen-Strep tot het bereiken van ~ 70% confluentie voor het testen van het bewerken van de werkzaamheid van de plasmiden gen.</li>
	<li>Electroporate een totaal van 5 µg SaCas9/gRNA plasmide mengsel in de molaire verhouding 1:1 in 1 x 106 C2C12 cellen volgens protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Na 48u na transfectie, oogsten van de cellen van de C2C12 en haal genomic DNA.</li>
	<li>Gebruik 100 ng genomic DNA als sjabloon voor het uitvoeren van de PCR reactie voor muis Dystrofine locus: toekomen primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), omkeren primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL van 10 µmol/L), 10 µL 2 x de groene PCR master mix, 7 µL ddH2O, 1 µL genomic DNA () 100 ng). Gebruik van PCR fietsen voorwaarden als 95 ° C 5 min, 35 cycli van [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.</li>
</ol>2. rAAV productie
<ol><li>Om de cultuur van de cellen, zaad AD293 cellen op 20 tot 40 van 15 cm schotels en onderhouden in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% Pen-Strep tot het bereiken van ~ 90% confluentie voor Transfectie.</li>
	<li>Verdun 3 plasmiden met 200 µL verminderd serum medium (per schotel): 1) 10 µg pHelper; 2) 5 µg pXR (rh.74 of andere serotypen) en 3) een totaal van 5 µg pX601-i20 en pX601-i23 mengsel (verhouding 1:1). Het uitvoeren van polyethylenimine (PEI) transfectie door het te mengen met 80 µL PEI en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten toevoegen het mengsel op de celculturen AD293 op een dropwise manier.</li>
	<li>Voor AAV virus productie, na 72 h post transfectie, gebruikt u een cel schraper om te verzamelen van zowel de media als de AD293 cel pellets door centrifugeren bij 1100 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Resuspendeer de cel pellets in 15 mL rAAV lysis-buffermengsel (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5) gevolgd door 3 bevriezen-ontdooien cycli met afwisselende incubatie in vloeibare stikstof en een 42 ° C waterbad. Bewaar de cel lysates in-80 ° C voor de toekomstige verwerking als ze niet onmiddellijk worden verwerkt.</li>
	<li>De voedingsbodems filteren met een 0,45 µm filter en een 40% PEG8000 in 2,5 mol/L NaCl toevoegen om een eindconcentratie van 8%. Incubeer het mengsel bij 4 ° C gedurende 1 h en centrifuge op 1100 x g gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Resuspendeer de pellets in rAAV lysis-buffermengsel en combineren met de cel lysates uit stap 2.3, gevolgd door behandeling van de benzonase (50 U/mL) bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Centrifugeer het benzonase-behandeld rAAV met mengsel 1100 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C, en sla het supernatant (de voorbereiding van de ruwe rAAV).</li>
</ol>3. rAAV reiniging en concentratie
<ol><li>Laden van de ruwe rAAV voorbereiding op het verloop van een iodixanol in een buis van de ultracentrifuge in de volgende volgorde vanaf de top naar de onderkant: ruwe AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5 mL 40% Iodixanol, 5 mL 58% Iodixanol. Vul het resterende lege volume van de buis aan de bovenkant met 1 x DPBS.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 230.000 x g in een rotor ultracentrifuge gedurende 120 minuten bij 10 ° C en 3-4 mL van de 40% kleurovergang breuk met de rAAV deeltjes met een naald 18 G te verzamelen.</li>
	<li>Verdun de rAAV deeltjes met 1 x DPBS en centrifuge met behulp van de centrifugaal filter eenheid (MWCO 100 kDa). Herhaal deze stap voor 3 - 5 keer en ten slotte het concentreren van de voorbereiding van de rAAV aan 300-500 µL.</li>
</ol>4. rAAV Titering
<ol><li>Extract van de genomic DNA van 2 µL geconcentreerd rAAV, overhaaste met 3 M NaOAc in ethanol en resuspendeer in 20 µL ddH2O.</li>
	<li>De standaard curve voor rAAV kwantificatie verkrijgen door seriële verdunning van de plasmide pX601: 1 x 109, 1 x 10,8,1 x 10,7, 1 x 106, 1 x 105 exemplaren in elk 10 µL ddH2O. Dilute de DNAase-behandelde rAAV monsters als 1:10, 1:50, 1:100 en 1:1000.</li>
	<li>Bepalen van de titer van de rAAV door kwantitatieve PCR in real time (qPCR) met behulp van qPCR Kit volgens instructie van de fabrikant in een Real-Time PCR-systeem: 1 µL 10 µmol/L voor elke primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC en 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x PCR master mix, 1 µL verdund rAAV monsters en 2 µL ddH2O. de reactie worden uitgevoerd met de volgende fietsen parameters: 95 ° C 3 min, 45 cycles van [95 ° C 5 sec en 61 ° C 20 sec].</li>
</ol>5. intraveneuze en intraperitoneale injectie van rAAVrh.74-CRISPR in de neonatale mdx/utrophin+/- muizen
<ol><li>Immobiliseren de mdx/utrophin+/- muis pups (dag 3) door te plaatsen op het ijs voor 1 min en vervolgens beheren met 1 x 1012 virale deeltjes in 50 µL per muis systemisch via een retro-orbitaal aanpak of een intraperitoneale injectie.</li>
	<li>Laat de muizen te herstellen en plaats terug in hun huis kooien. Euthanaseren op tien weken na toediening van de rAAV, de muizen door CO2 blootstelling voor weefsel collectie.</li>
	<li>Module-freeze weefsels voor genomic DNA en RNA extractie en gebruik koeling van tolueen in vloeibare stikstof te bevriezen weefsels met optimale scherpe temperatuur samengestelde voor cryosectioning.</li>
</ol>6. analyse van Target-gen bewerken van resultaten
<ol><li>
Genomic DNA PCR analyse
	<ol>
<li>Isoleren van de totale genomic DNA van het hart weefsels van mdx/utrophin+/- muizen behandeld met of zonder rAAV.</li>
		<li>Hetzelfde protocol gebruiken in stap 1.12 voor PCR analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RT-PCR analyse van Dystrofine expressie
	<ol>
<li>Uittreksel totaal RNA van het hart weefsels met de RNA extractie kit na de handleiding van de fabrikant.</li>
		<li>Uitvoeren van omgekeerde transcriptie, vooraf behandelen de totale RNA met een RNase-vrije DNase en 5 µg behandelde RNA gebruiken als sjabloon voor eerste-strand cDNA synthese met de omgekeerde transcriptie kit.</li>
		<li>Gebruik van het product reverse transcriptie voor RT-PCR analyse van Dystrofine expressie met het Dystrofine cDNA inleidingen: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT en 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Schatten van de gene werkzaamheid bewerken door qPCR analyse
	<ol>
<li>Schatten van het gen bewerken werkzaamheid door kwantitatieve RT-PCR te sporen van de vermindering van de exon 22-bevattende afschriften met behulp van de voorwaartse primer (exon 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA en de omgekeerde primer (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Gebruik Gapdh als een referentie-gen met de voorwaartse primer: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC en de omgekeerde primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>Uitvoeren van de kwantitatieve PCR in real time (qPCR) met behulp van de qPCR Kit volgens instructie van de fabrikant in een Real-Time PCR-systeem en de reactie van 2-step-voorwaarden: 95 ° C 3 min, 45 cycles van 95 ° C 5 sec en 61 ° C 30 sec.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunofluorescentie kleuring voor het analyseren van Dystrofine expressie
	<ol>
<li>Snijd het bevroren weefsels met behulp van een cryostaat bij een dikte van 10 µm. Fix de bevroren secties met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Wassen 2 x met PBS en incubeer met oplossing (10% paard serum) blokkeren voor 1 h.</li>
		<li>Incubeer de anti-Dystrofine primair antilichaam, bij 4 ° C's nachts.</li>
		<li>Wassen van de dia's met PBS 3 x 5 min en incubeer met fluorescerende secundaire antilichamen (1:500) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
		<li>Monteer de dia's met behulp van het montage-medium met DAPI en beeldbewerking met een omgekeerde confocal microscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. off-target analyse met behulp van de T7E1 van
<ol><li>Voorspellen de potentiële uit doelsoort zijn sites die gebruik maken van de online CRISPR ontwerp tools zoals < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>Versterken van de genomic regio's die betrekking hebben op de top 5-10 potentiële af-target sites door PCR: genomic DNA 200 ng 1 µL HiFi-polymerase van DNA, 5 µL 10 x PCR Buffer mix, 1.5 µL 10 µmol/L site-specific voorwaartse en omgekeerde inleidingen, aanpassing van het totale volume aan 50 µL met ddH2O.</li>
	<li>De PCR-producten worden uitgevoerd door elektroforese, uittreksel en zuiveren van het DNA met behulp van een gel extractie kit. Het meten van de concentratie met behulp van spectrofotometers.</li>
	<li>Heteroduplex-vorming te bevorderen door denaturering en opnieuw gloeien de gezuiverde waarbij langzaam in de Buffer 2.1 met behulp van een PCR-cycler. Gebruik dezelfde fietsen voorwaarden zoals beschreven in stap 1,2.</li>
	<li>De opnieuw ontharde producten gedurende 30 minuten bij 37 ° C met 0,5 µL T7E1 enzym verteren, en analyseren van de reactie door elektroforese met behulp van 1-2% agarose gel. Opmerking: De waarbij kunnen ook worden geanalyseerd door gerichte diepe sequentiebepaling.</li>
</ol>

<ol><li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+Classification+of+CRISPR-Cas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems.</a> Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163, 759-771 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).</li>
<li>Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+discovery%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell discovery. 3, 17018(2017).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+Effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy.+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264(2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+genome+editing+restores+dystrophin+expression+and+function+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice.</a> Mol Ther. 24, 564-569 (2015).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351, 400-403 (2016).</li>
<li>Long, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+germline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345, 1184-1188 (2014).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351, 403-407 (2016).</li>
<li>Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244(2015).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li>
<li>Bengtsson, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+CRISPR%2FCas9+dystrophin+gene+editing+ameliorates+pathophysiology+in+a+mouse+model+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 8, 14454(2017).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li>
<li>Nowak, K. J., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy+and+dystrophin%3A+pathogenesis+and+opportunities+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment.</a> EMBO reports. 5, 872-876 (2004).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).</li>
<li>Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+of+MDA+muscle+disease+symposium+on+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).</li>
<li>Spurney, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+understanding+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions.</a> Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).</li>
<li>Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8211986">Autopsy analyses of the muscular dystrophies.</a> Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).</li>
<li>McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+in+the+therapy+of+cardiomyopathy+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy.</a> Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).</li>
<li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approvals%2C+Submission%2C+and+Important+Labeling+Changes+for+US+Marketed+Pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp+Pharm%22%5BJournal%5D)">Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals.</a> Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).</li>
<li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28515510">Eteplirsen.</a> Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse%3A+a+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Function+in+mdx+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).</li>
<li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circ Res. 121, 923-929 (2017).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li>
<li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li>
</ol>

Geen belangenconflict bestaat.

In dit protocol detailleren wij alle noodzakelijke stappen voor het bereiken van de in vivo cardiale gene bewerken in postnatale muizen met behulp van rAAVrh.74-gemedieerde levering van SaCas9 en twee gRNAs. Zoals eerder opgemerkt, deze benadering kan worden gebruikt om te herstellen van Dystrofine expressie in dystrophique muizen, zoals beschreven in onze werk-27, maar het kunnen ook snelle reverse genetics studies van cardiale-gerelateerde genen in muizen zonder het langdurige proces va...

De geclusterde, regelmatig interspaced, korte palindromische herhalen (CRISPR) technologie is de meest recente vooruitgang in genoom engineering en heeft een revolutie teweeggebracht in de huidige praktijk van genetica in cellen en organismen. CRISPR gebaseerde genoom bewerken maakt gebruik van een enkele gids RNA (gRNA) om een CRISPR-geassocieerde endonuclease zoals CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) en Cpf1 aan de genomic DNA doel dat is een aanvulling in de juiste volgorde op de protospacer gecodeerd door de gRNA met een specifieke protospacer aangrenzende motief (PAM)1,2. De PAM is afhankelijk van de bacteriële soorten het Cas9 of Cpf1 gen. De meest gebruikte Cas9 nuclease afgeleid van Streptococcus pyogenes (SpCas9) herkent een reeks PAM NGG dat in de genomic DNA, op de doelsoort onderdeel direct stroomafwaarts van de doel-reeks schuilt. Op de doelsite, de Cas9 en Cpf1 eiwitten genereren een pauze met dubbel-strand (DSB), die vervolgens via de intrinsieke cellulaire DNA herstelmechanismes, met inbegrip van niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) en homologie geleide reparatie (HDR) trajecten3is hersteld, 4. Bij gebrek aan een DNA-sjabloon voor homologe recombinatie, wordt de DSB voornamelijk hersteld door de vergissing-geneigd NHEJ traject, die in invoegingen of verwijderingen (microdeleties resulteren kan) van nucleotiden frameshift mutaties veroorzaken als de DSB in de codering ontstonden regio van een gen5,6. Dus, het CRISPR-systeem is wijd verbeid gebruikt om ingenieur verlies-van-functie mutaties in diverse cellulaire modellen en hele organismen, om te onderzoeken van de functie van een gen. Bovendien, de catalytically inactief Cas9 en Cpf1 zijn ontwikkeld om transcriptionally en epigenetically het moduleren van de expressie van doel genen7,8.
Meer recentelijk, zowel SpCas9 als SaCas9 (afgeleid van Staphylococcus aureus) zijn verpakt in recombinante adeno-associated virus (rAAV) vectoren voor postnatale gene correctie in de diermodel van ziekten bij de mens, met name, Duchenne muscular dystrophy (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD is een dodelijke X-gebonden recessieve ziekte veroorzaakt door mutaties in het DMD -gen, dat Dystrofine-eiwit16,17 codeert, die ongeveer één in 3500 mannelijke geboorten volgens pasgeboren screening18 , 19. het wordt gekenmerkt door progressieve spierzwakte en verspillen. De DMD-patiënten verliezen meestal het vermogen om te lopen tussen 10 en 12 jaar oud en sterven van de luchtwegen en/of cardiale mislukking door de leeftijd van 20-30 jaar20. Met name, cardiomyopathie ontwikkelt > 90% van de patiënten DMD en vertegenwoordigt de toonaangevende veroorzaken van de dood in DMD patiënten21,22. Hoewel Deflazacort (een anti-ontsteking drug) en Eteplirsen (een exon skipping geneeskunde voor het overslaan van de exon 51) zijn onlangs goedgekeurd voor DMD door de Food and Drug Administration (FDA)23,24, geen van deze behandelingen Corrigeer het genetische gebrek aan de genomic DNA-niveau. De MDX-muis, die een punt mutatie bij exon 23 van het Dystrofine-gen draagt, is wijd verbeid gebruikt als een DMD model25. Bovendien, we eerder aangetoond dat de expressie van functionele Dystrofine werd gerestaureerd door-frame schrapping van de genomic DNA die betrekking hebben op exons 21, 22 en 23 in de skeletspieren van mdx muizen met behulp van intramusculaire Ad-SpCas9/gRNA levering9 , en in de spieren van het hart van mdx/utrophin+/- muizen met behulp van intraveneuze en intraperitoneaal levering van rAAVrh.74-SaCas9/gRNA26.
In dit protocol beschrijven we in detail elke stap in de postnatale cardiale gene bewerken om te herstellen van Dystrofine in mdx/utrophin+/- muizen met behulp van rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vectoren, van gRNA ontwerp tot Dystrofine analyse in de secties van de spier hart.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Bio Safety Cabinets</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 Series A2 Class II, Type A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S</td><td></td></tr><tr><td>Competent cells</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, 150mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Dystrophin antibody</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit, 0.45&mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>High-speed plasmid mini kit</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 Water Bath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Heat Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 instrument</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 Instrument II</td></tr><tr><td>Large Capacity Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometers</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade; 2000/2000c</td></tr><tr><td>Oligos for i20-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC</td></tr><tr><td>Oligos for i20-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>Oligos for i23-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>Oligos for i23-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Seal centrifuge tube</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>337922</td><td>Type 70Ti</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>Ultra centrifugal filter unit</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

adeno-associated virus-gemedieerde levering van crispr voor cardiale gene bewerken in muizen

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

De geclusterde regelmatig interspaced, korte, palindromische herhalen (CRISPR)-systeem heeft zeer genoom engineering in zowel de gekweekte cellen en de levende organismen van allerlei soorten vergemakkelijkt. De CRISPR-technologie is ook onderzocht als nieuwe therapieën voor een aantal ziekten bij de mens. Proof-of-concept gegevens zijn zeer bemoedigend, zoals wordt geïllustreerd door de recente studies die aantonen dat de haalbaarheid en de werkzaamheid van gene bewerken gebaseerde therapeutische benadering voor Duchenne muscular dystrophy (DMD) met behulp van een lymfkliertest model. Met name heeft intraveneuze en intraperitoneale injectie van de recombinante adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) ingeschakeld, efficiënte cardiale levering van de Staphylococcus aureus CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (SaCas9) en twee begeleiden RNAs (gRNA) als u wilt verwijderen van een genomic regio met een mutant codon in exon 23 van muis Dmd gen. Deze dezelfde benadering kan ook worden gebruikt voor knock-out de gen-of-interest en hun hartfunctie bij postnatale muizen bestuderen wanneer de gRNA is ontworpen om te richten van de codering regio van het gen. In dit protocol tonen we in detail hoe ingenieur rAAVrh.74-CRISPR-vector en hoe te bereiken hoogefficiënte cardiale levering in neonatale muizen.

De werkzaamheid van de gRNAs voor het opwekken van de schrapping van de target genomic DNA regio moet worden geëvalueerd in celculturen vóór verpakking in rAAV voor in vivo onderzoek. Te dien einde, de gRNAs en SaCas9-uiten constructies waren electroporated in C2C12 cellen en de genomic DNA door PCR werd geanalyseerd met de inleidingen flankerend de doelgroep sites (Figuur 1). Een PCR-product van ~ 500 bp geeft aan succesvolle schrapping van het doel genomic ...

Hier bieden we een gedetailleerd protocol te verrichten in vivo cardiale gene bewerken in muizen met behulp van recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-gemedieerde levering van CRISPR. Dit protocol biedt een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van Dystrofe cardiomyopathie in Duchenne spierdystrofie en kan worden gebruikt voor het genereren van cardiale-specifieke knock-out in de postnatale muizen.

Adeno-Associated Virus-gemedieerde levering van CRISPR voor cardiale Gene bewerken in muizen

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Het algemene doel van dit in vivo protocol voor cardiale genbewerking is om de expressie van dystrofine in het hart van dystrofische muizen te herstellen met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus rh. 74 met CRISPR SaCas9 en gids-RNA-vectoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van spierdystrofie, zoals of genbewerking een betrouwbare therapeutische strategie is om de worteloorzaak van de cardiomyopathie geassocieerd met Duchenne's spierdystrofie te behandelen.Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat de expressie van het gecorrigeerde dystrofine-gen onder zijn endogeen regulerende controle staat en dat dit reddingseffect permanent is. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de behandeling van andere genetische ziekten waarbij correctie van het mutante gen kan worden bereikt door CRISPR Cas9 genbewerkingstechnologie. Deze methode biedt niet alleen inzicht in dystrofine-restauratie in het dystrofische hart, maar kan ook worden gebruikt om het gen van belang uit te schakelen voor omgekeerde genetische studies.De procedure zal worden gedemonstreerd door Yandi Gao, een technicus uit ons laboratorium. De juiste ontwerp van de gids-RNA's, of gRNA's, is cruciaal voor het succes van dit protocol. Selecteer twee gRNA's die gericht zijn op dystrofine intron 20 en intron 23 voor het CRISPR-geassocieerde eiwit negen van Staphylococcus aureus.De protospacer-aangrenzende motiefsequentie voor elke gRNA is onderstreept en cursief weergegeven. Om de gRNA-oligonucleotiden te anneleren, zet een reactie op met 100 micromol per liter van de gRNA-oligonucleotiden in 1x annealing buffer. Gebruik de volgende PCR-parameters: 95 graden Celsius gedurende 10 minuten, 90 cycli van 95 tot 59 graden Celsius met een afname van 0,4 graden Celsius per cyclus gedurende 20 seconden, 90 cycli van 59 tot 32 graden Celsius met een afname van 0,3 graden Celsius per cyclus gedurende 20 seconden en 20 cycli van 32 tot 26 graden Celsius met een afname van 0,3 graden Celsius per cyclus gedurende 20 seconden.Bereid vervolgens de geanneleerde gRNA-oligonucleotiden voor op ligatie in de CRISP-vector in één reactie. Voeg het volgende toe aan een buis: één microliter van 50 nanogram per microliter CRISPR-vector, één microliter van geanneleerde oligonucleotiden, 1,5 microliters van 10x T4 DNA ligase-buffer, 0,5 microliters van T4 DNA ligase, één microliter van Bsal en 10 microliters dubbel gedestilleerd water. Voer de volgende reactie uit in een thermocycler: vijf cycli van 37 graden Celsius gedurende vijf minuten en 16 graden Celsius gedurende 10 minuten, 37 graden Celsius gedurende 20 minuten en 80 graden Celsius gedurende vijf minuten.Transformeer het 15-microliter ligatieproduct in 30 microliters competente cellen en plateer de cellen op een agarplaat met 100 microgram per milliliter ampicilline. Cultiveer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag plukt u vijf tot tien kolonies van de agarplaat en cultiveert u deze in LB-medium met 100 microgram per milliliter ampicilline bij 37 graden Celsius en 250 tpm gedurende drie tot vier uur.Om de kolonies door PCR te screenen, bereid reacties voor die elk 10 microliter PCR-mastermix, acht microliter dubbel gedestilleerd water, één microliter E.coli-cultuur, één microliter U6-forward-primer en één microliter i20 of i23 gRNA-reverse-primer bevatten. Gebruik de volgende PCR-cyclusparameters: 95 graden Celsius gedurende vijf minuten, gevolgd door 35 cycli van 95 graden Celsius gedurende 30 seconden, 61 graden Celsius gedurende 30 seconden en 72 graden Celsius gedurende 30 seconden. Zodra de positieve klonen zijn geïdentificeerd, bereidt u een vijf-millilitercultuur van elke positieve klon door vier milliliter vers LB-medium met 100 microgram per milliliter ampicilline toe te voegen en de klon te cultiveren bij 37 graden Celsius en 250 tpm gedurende de nacht.De volgende dag zuivert u het plasmide-DNA met behulp van de geschikte plasmide-extractiekit. Het plasmide wordt vervolgens geverifieerd door Sanger-sequencing met de U6-forward-primer. Om de genbewerkingseffectiviteit van de plasmiden te testen, cultiveert u C2C12-cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% Pen-Strep totdat de cellen ongeveer 70% confluency bereiken.Electroporeer een totaal van vijf microgram SaCas9/gRNA-plasmidemengsel in een een-op-een molaire verhouding in C2C12-cellen volgens het protocol van de fabrikant. 48 uur na transfectie oogst u de C2C12-cellen en extraheert u genomisch DNA zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik het genomische DNA als template om PCR uit te voeren voor het muisdystrofine-locus.Stel reacties op die de voorwaartse primer, de achterwaartse primer, de groene PCR-mastermix, dubbel gedestilleerd water en 100 nanogram genomisch DNA bevatten. Gebruik dezelfde PCR-condities als voor het screenen van positieve klonen. Voordat u met deze procedure begint, bereidt u het recombinante adeno-geassocieerde virus, of rAAV, voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Gebruik dag drie mdx-muispups viraalsysteemdeeltjes systemisch via een intraperitoneale injectie. Laat de muizen herstellen en plaats ze terug in hun thuiskooien. Verzamel de weefsels van de muizen 10 weken na rAAV-toediening.Snel bevriezen de weefsels voor genomisch DNA en RNA-extractie, en gebruik gekoelde isopentaan in vloeibare stikstof om weefsels te bevriezen met optimaal snijtemperatuurcompound voor cryosectio's. Begin de immunofluorescentiekleuringsprotocol door de bevroren weefselsecties 5 minuten te fixeren met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur. Na 15 minuten wast u de weefselsecties twee keer met PBS.Incubeer met blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende één uur. Incubeer vervolgens met het anti-dystrofine primaire antilichaam bij vier graden Celsius gedurende de nacht. De volgende ochtend wast u de slides met PBS en incubeert u vervolgens met fluorescerende secundaire antilichamen bij kam

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In this video, we demonstrate recombinant adeno associated virus-based gene delivery in the mouse pup. This method helps in studying gene expression in the targeted cells.

Recombinant Adeno Associated Virus Based Gene Delivery: A Technique for Transgene Delivery and Cardiac-Specific Expression in Rodent Model

De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.

Ontwerpen, Verpakkingen en Levering van hoge titer CRISPR Retro en Lentivirussen via Stereotaxische Injection

In dit manuscript wordt een methode beschreven om recombinant adeno-geassocieerd virus 9 (rAAV9) vectoren te bereiden voor het manipuleren van genexpressie in het muizenhart.

Voorbereiding van de rAAV9 tot overexpressie of Knockdown Genes in Mouse Hearts

De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) systeem biedt een veelbelovend instrument voor de gentechnologie, en opent de mogelijkheid van gerichte integratie van transgenen. We beschrijven een homologie-gemedieerde einde deelname aan (HMEJ)-gebaseerd strategie voor efficiënte DNA integratie in vivo gerichte en gerichte gentherapieën met behulp van CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

Hier presenteren we een protocol voor cardiale-specifieke genetische manipulatie in muizen. Onder verdoving, werden de muis harten externalized door de Vierde intercostale ruimte. Vervolgens blot adenovirussen coderen specifieke genen werden ingespoten met een injectiespuit in het myocardium, gevolgd door eiwit expressie meting via in vivo imaging en Western analyse.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor In Vivo Cardiac-specifieke genetische manipulatie door Intramyocardial injectie in muizen

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Ontwikkeling van Murine modellen met specifieke genen gemuleerd in hoofd-en nekkanker patiënten is nodig voor het begrijpen van neoplasie. Hier presenteren we een protocol voor in vitro transformatie van primaire muriene tong cellen met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem om Murine HNC cellijnen met specifieke genomische veranderingen te genereren.

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

In dit protocol beschrijven we de technische procedures om bruin vetweefsel (BAT)-specifieke knock-out muizen te genereren met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) systeem. De beschreven stappen omvatten het ontwerp van de sgRNA's, de bereiding van de AAV-sgRNA-deeltjes en de micro-injectie van AAV in de BBT-lobben.

Generatie van bruine vet-specifieke knock-out muizen met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en Adeno-geassocieerd virus single-guide RNA-systeem

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde aanpak voor het produceren van genetisch gemodificeerde rattenmodellen. Adeno-geassocieerd virus (AAV) wordt gebruikt om een DNA-reparatiesjabloon af te leveren, en elektroporatie wordt gebruikt om CRISPR-Cas9-reagentia af te leveren om het genoombewerkingsproces in een 2-cellig embryo te voltooien.

CRISPR-Cas9 Genoombewerking van rattenembryo's met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV) en elektroporatie van 2-celembryo's

Dit rapport beschrijft de gelokaliseerde injectiemethode van AAV-vectoren via het nierbekken voor effectieve en veilige genoverdracht naar de nier van de muis.

Effectieve en veilige genafgifte aan de nier van de muis via langzame retrograde injectie van nierbekken van adeno-geassocieerde virusvectoren

Leer in vivo cardiale genbewerking met CRISPR en recombinant adeno-associated virus in muizen. Deze methode herstelt dystrofine-expressie en biedt een veelbelovende therapeutische strategie voor dystrofische cardiomyopathie.

Adeno-Associated Virus-gemedieerde levering van CRISPR voor cardiale Gene bewerken in muizen

Meer video's verkennen