Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere
May 2nd, 2018
Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.
Het algemene doel van dit experiment is om drie compartimenten van het wortelmicrobioom te karakteriseren, bodem, rhizosfeer en wortelendosphere, met behulp van community profiling van het 16S ribosomale RNA-gen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in microbiële ecologie, zoals de biotische en abiotische factoren die de belangrijkste drijfveren zijn van de microbioomstructuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat het elke stap standaardiseert, van de scheiding van wortel en rhizosfeer tot DNA-extractie tot het voorbereiden van een sequencingbibliotheek.
Het demonstreren van deze procedure zal worden uitgevoerd door Tuesday Simmons, een afgestudeerde student in het Coleman-Derr Laboratorium. Om het protocol te beginnen, verzamel bulkbodemmonsters met een met ethanol gesteriliseerde bodemkerncollector om bodem te verkrijgen die vrij is van plantenwortels. Verzamel een kern ongeveer 23 tot 30 centimeter vanaf de basis van de plant.
Breng vervolgens de bodem over in een plastic zak, homogeniseer de bodem door voorzichtig te schudden in de zak, breng een aliquot van 600 milligram van het bodemmonster over in één twee-milliliterbuis en plaats de twee-milliliterbuis onmiddellijk op droogijs tot DNA-extractie. Om de wortel en rhizosfeer te verzamelen, gebruik een met ethanol gesteriliseerde schop om de plant op te graven, en zorg ervoor dat u zoveel mogelijk wortel verkrijgt. Schud voorzichtig overtollig bodem van de wortels af tot er ongeveer twee millimeter bodem aan de wortelopvlak hecht.
Voor grote planten, gebruik steriele schaar om een representatieve subsectie van wortels te snijden, en plaats minimaal 500 milligram wortelweefsel in een 50-milliliter conische fles. Voeg voldoende epifytverwijderingsbuffer toe om de wortels te bedekken, en plaats het monster onmiddellijk op droogijs. Om de rhizosfeer van de wortels te scheiden, ontdooi het wortelmonster op ijs, en soniceer vervolgens de wortelmonsters.
Breng de wortels over in een gekoelde, schone 50-milliliterbuis met behulp van steriele forceps. Gooi de originele buis met buffer en bodem niet weg. Dit bevat de rhizosfeerfractie.
Centrifugeer vervolgens de buis met buffer en rhizosfeer. Decanteer het supernatant en plaats de rhizosfeerfractie op droogijs. Om de wortels te wassen, voeg ongeveer 20 milliliter steriel water van vier graden Celsius toe aan de wortelfractie.
Was de wortel door krachtig te schudden gedurende 15 tot 30 seconden, en laat het water weglopen. Gebruik een steriele spatel om snel 250 milligram bodem en rhizosfeer over te brengen in afzonderlijke verzamelbuizen die worden geleverd in een commercieel DNA-isolatiekit voor bodemextractie, en ga vervolgens verder volgens het protocol van de kitleverancier. Na elutie, bewaar het DNA bij min 20 graden Celsius totdat u klaar bent om door te gaan naar de ampliconbibliotheekvoorbereiding, en extraheer DNA uit de wortelmonsters.
Koel een gesteriliseerde mortel en stamper met behulp van vloeibare stikstof. Meet 600 tot 700 milligram wortelweefsel af en plaats het weefsel in de mortel en voeg voorzichtig voldoende vloeibare stikstof toe om de wortels te bedekken. Maal de wortels in kleine stukjes.
Ga door met het proces van het toevoegen van vloeibare stikstof en malen minstens twee keer, consistent tussen monsters, totdat de wortels een fijn poeder zijn. Snel, voordat het wortelpoeder begint te ontdooien, gebruik een steriele spatel om het wortelpoeder over te brengen in vooraf gewogen 1,5-milliliterbuizen op ijs. Noteer het gewicht van de buis en het poeder.
Gebruik een steriele spatel om snel 150 milligram wortelpoeder over te brengen in de verzamelbuis die wordt geleverd in de commerciële DNA-isolatiekit die is ontworpen voor extractie uit bodem, en ga vervolgens verder met DNA-isolatie volgens het protocol van de kitleverancier. Bereid voldoende PCR master mix voor om elke DNA-monster in drievoud te versterken. Giet de master mix in een steriele, 25-milliliter multichannel pipet reservoir en verdeel 66 microliters master mix in elke well van een nieuwe 96-well PCR-plaat.
Voeg vervolgens zes microliters van vijf nanogram per microliter DNA van de genormaliseerde DNA-plaat toe aan de master mix-plaat. Voeg vervolgens aan de masterplaat 1,5 microliter van 10 micromolair voorwaarts primer toe, zodat elke kolom een andere voorwaartse barcode heeft, en 1,5 microliter van 10 micromolair achterwaarts primer, zodat elke rij een andere achterwaartse barcode heeft. Bedek de plaat met film en centrifugeer de plaat kort bij 3.000 RCF.
Gebruik een multichannel pipet om de inhoud voorzichtig te mengen, verdeel ze vervolgens in drie platen met 25 microliter reactiemengsel en bedek de platen met PCR-film. Versterk het DNA in elke plaat met behulp van een thermocycler. Na de versterking, pool de drie replicaatplaten in een enkele 96-well plaat.
Gebruik een computerspreadsheet om het volume van 100 nanogram van elk monster te berekenen, evenals het gemiddelde volume voor alle monsters. Voeg voor elk leeg PCR-product het berekende gemiddelde volume toe aan een enkele 1,5-milliliterbuis. Voor de succesvol versterkte monsters, pool 100 nanogram van elk monster in dezelfde buis, meet vervolgens de concentratie van het gepoolde product met behulp van een tafeltop fluorometer en elueer 600 nanogram DNA in moleculair gegradeerde water tot een eindvolume van 100 microliter in een 1,5-milliliterbuis.
Bewaar het resterende gepoolde product bij min 20 graden Celsius. Voorafgaand aan de zuivering van de 600-nanogram DNA-aliquot, bereid 600 microliter vers 70% ethanol voor. Volg het gevestigde PCR-zuiveringsproces met behulp van paramagnetische kralen.
Schud de buis met magnetische kralen om de kralen die zich op de bodem hebben gesetteld opnieuw te suspenderen. Voeg 1x volume, 100 microliter, van bead-oplossing toe aan de 600-nanogram aliquot van DNA. Meng de oplossing en kralen grondig door tien keer te pipe
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het verkrijgen van ampliconsequentiegegevens uit bodem-, rhizosfeer- en wortel-endosfeer-microbiomen. De methode heeft tot doel de samenstelling en diversiteit van plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen te karakteriseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijke vakgebied
- Microbiële Ecologie
- Plant-Microbe Interacties
- Gemeenschapsprofilering
Achtergrond
- Het wortelmicrobioom bestaat uit verschillende compartimenten, waaronder bodem, rhizosfeer en wortel-endosfeer.
- Het begrijpen van deze compartimenten kan de factoren die de microbioomstructuur beïnvloeden, onthullen.
- 16S ribosomale RNA-genprofilering is een standaardmethode voor het bestuderen van microbiële gemeenschappen.
- Dit protocol standaardiseert het proces van monsterverzameling tot voorbereiding van de sequencingbibliotheek.
Doel van de studie
- Om het wortelmicrobioom in verschillende compartimenten te karakteriseren.
- Om de drijfveren van de microbioomstructuur te onderzoeken.
- Om een gestandaardiseerd protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Verzameling van bulkbodemmonsters met behulp van een ethanol-gesteriliseerd bodemkernmonsterapparaat.
- Bemonstering op een diepte van 23 tot 30 centimeter vanaf de basis van de plant.
- Scheiding van wortel en rhizosfeer voor analyse.
- DNA-extractie en voorbereiding van sequencingbibliotheekjes.
Belangrijkste resultaten
- Gestandaardiseerd protocol vergemakkelijkt consistente microbioomanalyse.
- Biedt inzichten in de samenstelling van plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen.
- Maakt onderzoek naar biotische en abiotische factoren die de microbioomstructuur beïnvloeden mogelijk.
- Gedemonstreerd door een afgestudeerde student in het Coleman-Derr Laboratorium.
Conclusies
- Het protocol is geschikt voor een breed scala aan plantensoorten.
- Het vergroot het begrip van microbiële diversiteit in plantenomgevingen.
- Toekomstige toepassingen kunnen de kennis in microbiële ecologie uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standardized microbiome profiling enables consistent characterization of plant-associated bacterial communities across soil, rhizosphere, and root endosphere compartments. This approach supports target validation in agrochemical discovery by de-risking mechanistic hypotheses about microbiome-mediated stress tolerance and disease resistance. The method provides quantitative, reproducible data for early-stage screening of compounds or biologics that modulate plant-microbe interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying which microbial taxa are enriched in specific plant compartments under stress conditions.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized isolation of soil, rhizosphere, and root endosphere fractions for comparative analysis.
- Scientific Value: Supports predictive confidence in target prioritization by linking microbiome shifts to plant fitness outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering high-quality, contaminant-reduced DNA from defined microbiome compartments.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through a validated 16S rRNA amplicon sequencing pipeline adaptable to multiple plant species.
- Scientific Value: Highlights screening readiness and platform reuse by enabling scalable, barcoded multiplexing of samples for comparative compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by connecting microbiome composition to abiotic stress tolerance and pathogen resistance phenotypes.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by providing a transferable method for longitudinal microbiome monitoring.
- Scientific Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling mechanistic de-risking of microbiome-targeted interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing compartment-resolved microbiome data that informs target selection and compound screening strategies.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling comparison of microbial community structure across soil, rhizosphere, and root endosphere.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through standardized DNA extraction and library preparation steps that minimize technical bias.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as normalized DNA pooling and fluorometer-based quantification that enable comparable sequencing depth across samples.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by supporting longitudinal tracking of microbiome responses to experimental treatments.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through its validation across sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, enabling cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in plant-microbe interaction studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of microbiome compartment isolation and DNA extraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in agrobiotic development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on microbiome-mediated phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in molecular biology, microbial ecology, and sterile technique for handling liquid nitrogen and preventing contamination.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include centrifuges, thermocyclers, fluorometers, magnetic stands, and access to 16S rRNA amplicon sequencing.
- Cross-team standardization requirements involve harmonizing sample collection timing, root washing protocols, and DNA normalization procedures across sites.
- Adaptation considerations across model systems include adjusting root tissue mass and epiphyte removal buffer volumes based on plant species and root architecture.
- Practical limitations supported by source material include the need for consistent experimental execution to avoid bias from variations in DNA extraction or PCR master mix.
