Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere
2 mei 2018
Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.
Het algemene doel van dit experiment is om drie compartimenten van het wortelmicrobioom te karakteriseren, bodem, rhizosfeer en wortelendosphere, met behulp van community profiling van het 16S ribosomale RNA-gen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in microbiële ecologie, zoals de biotische en abiotische factoren die de belangrijkste drijfveren zijn van de microbioomstructuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat het elke stap standaardiseert, van de scheiding van wortel en rhizosfeer tot DNA-extractie tot het voorbereiden van een sequencingbibliotheek.
Het demonstreren van deze procedure zal worden uitgevoerd door Tuesday Simmons, een afgestudeerde student in het Coleman-Derr Laboratorium. Om het protocol te beginnen, verzamel bulkbodemmonsters met een met ethanol gesteriliseerde bodemkerncollector om bodem te verkrijgen die vrij is van plantenwortels. Verzamel een kern ongeveer 23 tot 30 centimeter vanaf de basis van de plant.
Breng vervolgens de bodem over in een plastic zak, homogeniseer de bodem door voorzichtig te schudden in de zak, breng een aliquot van 600 milligram van het bodemmonster over in één twee-milliliterbuis en plaats de twee-milliliterbuis onmiddellijk op droogijs tot DNA-extractie. Om de wortel en rhizosfeer te verzamelen, gebruik een met ethanol gesteriliseerde schop om de plant op te graven, en zorg ervoor dat u zoveel mogelijk wortel verkrijgt. Schud voorzichtig overtollig bodem van de wortels af tot er ongeveer twee millimeter bodem aan de wortelopvlak hecht.
Voor grote planten, gebruik steriele schaar om een representatieve subsectie van wortels te snijden, en plaats minimaal 500 milligram wortelweefsel in een 50-milliliter conische fles. Voeg voldoende epifytverwijderingsbuffer toe om de wortels te bedekken, en plaats het monster onmiddellijk op droogijs. Om de rhizosfeer van de wortels te scheiden, ontdooi het wortelmonster op ijs, en soniceer vervolgens de wortelmonsters.
Breng de wortels over in een gekoelde, schone 50-milliliterbuis met behulp van steriele forceps. Gooi de originele buis met buffer en bodem niet weg. Dit bevat de rhizosfeerfractie.
Centrifugeer vervolgens de buis met buffer en rhizosfeer. Decanteer het supernatant en plaats de rhizosfeerfractie op droogijs. Om de wortels te wassen, voeg ongeveer 20 milliliter steriel water van vier graden Celsius toe aan de wortelfractie.
Was de wortel door krachtig te schudden gedurende 15 tot 30 seconden, en laat het water weglopen. Gebruik een steriele spatel om snel 250 milligram bodem en rhizosfeer over te brengen in afzonderlijke verzamelbuizen die worden geleverd in een commercieel DNA-isolatiekit voor bodemextractie, en ga vervolgens verder volgens het protocol van de kitleverancier. Na elutie, bewaar het DNA bij min 20 graden Celsius totdat u klaar bent om door te gaan naar de ampliconbibliotheekvoorbereiding, en extraheer DNA uit de wortelmonsters.
Koel een gesteriliseerde mortel en stamper met behulp van vloeibare stikstof. Meet 600 tot 700 milligram wortelweefsel af en plaats het weefsel in de mortel en voeg voorzichtig voldoende vloeibare stikstof toe om de wortels te bedekken. Maal de wortels in kleine stukjes.
Ga door met het proces van het toevoegen van vloeibare stikstof en malen minstens twee keer, consistent tussen monsters, totdat de wortels een fijn poeder zijn. Snel, voordat het wortelpoeder begint te ontdooien, gebruik een steriele spatel om het wortelpoeder over te brengen in vooraf gewogen 1,5-milliliterbuizen op ijs. Noteer het gewicht van de buis en het poeder.
Gebruik een steriele spatel om snel 150 milligram wortelpoeder over te brengen in de verzamelbuis die wordt geleverd in de commerciële DNA-isolatiekit die is ontworpen voor extractie uit bodem, en ga vervolgens verder met DNA-isolatie volgens het protocol van de kitleverancier. Bereid voldoende PCR master mix voor om elke DNA-monster in drievoud te versterken. Giet de master mix in een steriele, 25-milliliter multichannel pipet reservoir en verdeel 66 microliters master mix in elke well van een nieuwe 96-well PCR-plaat.
Voeg vervolgens zes microliters van vijf nanogram per microliter DNA van de genormaliseerde DNA-plaat toe aan de master mix-plaat. Voeg vervolgens aan de masterplaat 1,5 microliter van 10 micromolair voorwaarts primer toe, zodat elke kolom een andere voorwaartse barcode heeft, en 1,5 microliter van 10 micromolair achterwaarts primer, zodat elke rij een andere achterwaartse barcode heeft. Bedek de plaat met film en centrifugeer de plaat kort bij 3.000 RCF.
Gebruik een multichannel pipet om de inhoud voorzichtig te mengen, verdeel ze vervolgens in drie platen met 25 microliter reactiemengsel en bedek de platen met PCR-film. Versterk het DNA in elke plaat met behulp van een thermocycler. Na de versterking, pool de drie replicaatplaten in een enkele 96-well plaat.
Gebruik een computerspreadsheet om het volume van 100 nanogram van elk monster te berekenen, evenals het gemiddelde volume voor alle monsters. Voeg voor elk leeg PCR-product het berekende gemiddelde volume toe aan een enkele 1,5-milliliterbuis. Voor de succesvol versterkte monsters, pool 100 nanogram van elk monster in dezelfde buis, meet vervolgens de concentratie van het gepoolde product met behulp van een tafeltop fluorometer en elueer 600 nanogram DNA in moleculair gegradeerde water tot een eindvolume van 100 microliter in een 1,5-milliliterbuis.
Bewaar het resterende gepoolde product bij min 20 graden Celsius. Voorafgaand aan de zuivering van de 600-nanogram DNA-aliquot, bereid 600 microliter vers 70% ethanol voor. Volg het gevestigde PCR-zuiveringsproces met behulp van paramagnetische kralen.
Schud de buis met magnetische kralen om de kralen die zich op de bodem hebben gesetteld opnieuw te suspenderen. Voeg 1x volume, 100 microliter, van bead-oplossing toe aan de 600-nanogram aliquot van DNA. Meng de oplossing en kralen grondig door tien keer te pipe
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het verkrijgen van amplicon-sequentiegegevens van microbiomen in de bodem, de rhizosfeer en de wortelendosfeer. De methode is erop gericht de compositie en diversiteit van plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen te karakteriseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiële ecologie
- Planten-microbe interacties
- Community profiling
Achtergrond
- Het wortelmicrobioom bestaat uit verschillende compartimenten, waaronder de bodem, de rhizosfeer en de wortelendosfeer.
- Inzicht in deze compartimenten kan de factoren onthullen die de structuur van het microbioom beïnvloeden.
- 16S ribosomaal RNA-genprofilering is een standaardmethode voor het bestuderen van microbiële gemeenschappen.
- Dit protocol standaardiseert het proces van monstername tot de voorbereiding van de sequencing-bibliotheek.
Doel van de studie
- Om het wortelmicrobioom in verschillende compartimenten te karakteriseren.
- Om de drijfveren van de structuur van het microbioom te onderzoeken.
- Om een gestandaardiseerd protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van bulkbodemmonsters met een met ethanol gesteriliseerde bodemkernboeor.
- Bemonstering op een diepte van 23 tot 30 centimeter vanaf de basis van de plant.
- Scheiding van wortel en rhizosfeer voor analyse.
- DNA-extractie en voorbereiding van sequencing-libraries.
Belangrijkste resultaten
- Een gestandaardiseerd protocol faciliteert een consistente microbiome-analyse.
- Biedt inzicht in de samenstelling van door planten geassocieerde microbiële gemeenschappen.
- Maakt onderzoek mogelijk naar biotische en abiotische factoren die de structuur van het microbiome beïnvloeden.
- Gedemonstreerd door een promovendus in het Coleman-Derr Laboratory.
Conclusies
- Het protocol is geschikt voor een breed scala aan plantensoorten.
- Het bevordert het begrip van de microbiële diversiteit in plantenomgevingen.
- Toekomstige toepassingen kunnen de kennis over microbiële ecologie uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Gestandaardiseerde microbiome-profilering maakt een consistente karakterisering mogelijk van plant-geassocieerde bacteriële gemeenschappen in de compartimenten bodem, rhizosfeer en wortel-endosfeer. Deze benadering ondersteunt doelwitvalidatie bij agrochemische ontdekking door mechanistische hypothesen over microbiome-gemedieerde stresstolerantie en ziekteresistentie te stroomlijnen. De methode levert kwantitatieve, reproduceerbare gegevens voor vroege screening van verbindingen of biologische middelen die plant-microbe-interacties moduleren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te verduidelijken welke microbiële taxa verrijkt zijn in specifieke plantcompartimenten onder stressomstandigheden.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicovermindering mogelijk via gestandaardiseerde isolatie van bodem-, rhizosfeer- en wortelendosfeerfracties voor comparatieve analyse.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid bij de prioritering van targets door microbiomeverschuivingen te koppelen aan resultaten voor de plantfitness.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door hoogwaardig, vervuilingsarm DNA te leveren uit gedefinieerde microbioomcompartimenten.
- Operationele waarde: Pakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays aan via een gevalideerde 16S rRNA amplicon sequencing-pipeline die aanpasbaar is voor meerdere plantensoorten.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de screeningstreadiness en het hergebruik van het platform door schaalbare, gebarcodeerde multiplexing van monsters mogelijk te maken voor vergelijkende compound-screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door de samenstelling van het microbioom te koppelen aan fenotypes van abiotische stresstolerantie en pathogeenresistentie.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door een overdraagbare methode te bieden voor longitudinale monitoring van het microbioom.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang door mechanistische risicoreductie van interventies gericht op het microbioom mogelijk te maken.
Integratie van pipeline en workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van vroege ontdekking (Early Discovery) tot lead-identificatie door compartiment-opgeloste microbioomgegevens te leveren die de selectie van targets en strategieën voor compound-screening informeren.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking ondersteunt door vergelijking mogelijk te maken van de structuur van microbiële gemeenschappen in de bodem, de rhizosfeer en de wortelendosfeer.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid en reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde stappen voor DNA-extractie en library-preparatie die technische bias minimaliseren.
- Analytics: Benadrukt kwantitatieve outputs, zoals genormaliseerde DNA-pooling en fluorometer-gebaseerde kwantificering, die een vergelijkbare sequencing-diepte over verschillende monsters mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door longitudinale tracking van microbiome-responsen op experimentele behandelingen te ondersteunen.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit door validatie in sorghum, maïs, tarwe, aardbei en agave, wat standaardisatie over projecten heen mogelijk maakt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie en vermindering van mechanistische ambiguïteit in studies naar plant-microbe-interacties.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van microbiome-compartimentisolatie en DNA-extractie.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium van agrobiotische ontwikkeling.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van door het microbiome gemedieerde fenotypische resultaten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in moleculaire biologie, microbiële ecologie en steriele technieken voor het hanteren van vloeibare stikstof en het voorkomen van contaminatie.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten centrifuges, thermocyclers, fluorometers, magnetische rekken en toegang tot 16S rRNA amplicon sequencing.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams omvatten het harmoniseren van het tijdstip van monstername, wortelwasprotocollen en DNA-normalisatieprocedures over verschillende locaties.
- Overwegingen voor aanpassing tussen modelsystemen omvatten het aanpassen van de massa van het wortelweefsel en de volumes van de buffer voor het verwijderen van epifyten op basis van de plantensoort en de wortelarchitectuur.
- Praktische beperkingen op basis van het bronmateriaal omvatten de noodzaak van een consistente experimentele uitvoering om bias door variaties in DNA-extractie of PCR master mix te vermijden.
