Name: Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer trans-plasma membraan elektronentransport meten in C2C12-myotubes via spectrofotometrische assays. Deze real-time methode helpt onderzoekers de mechanismen van celredoxbalans te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij wil Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino en Neej Patel Dank voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door de Verenigde Staten Public Health Service award R15DK102122 van het nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en ziekten van de nier (NIDDK) aan Jonathan Fisher. De inhoud van het manuscript is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIDDK of de National Institutes of Health.

Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen.
1. WST-1 vermindering Assay
<ol><li>Groeien en differentiëren C2C12 Adherente cellen gebruik standaard cel cultuur procedures7 in een 96-wells-plaat met behulp van rijen A-F.<ol>
<li>Het gebruik van een medium van de differentiatie van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 2% paard serum, 100 U/mL penicilline en 0,1 mg/mL streptomycine bestaande. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
		<li>Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, een aanvulling op differentiatie media met 100 µM ascorbinezuur. Toestaan dat cellen te broeden in differentiatie media voor ~ 24-48 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van stamoplossingen van WST-1 en PMS.<ol>
<li>Om een voorraad 10 mM van WST-1, Los 0.033 g WST-1 (formule gewicht (FW): 651.34 g/mol) in 5 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Om een 5 mM voorraad van PMS, Los 0.0023 g van PMS (FW: 306.34 g/mol) in 1,5 mL gedeïoniseerd H2O (diH2van O). Bewaren bij-20 ° C en beschermen tegen licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toevoegen van 0.0108 g van glucose voor een eindconcentratie van 5 mM tot 11.4 mL PBS of HEPES zoutoplossing gebufferde (HBS; 20 mM HEPES natrium zout, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). Voeg 480 µL van 10 mM WST-1 voor een eindconcentratie van 400 µM en 48 µL van 5 mM PMS voor een eindconcentratie van 20 µM.</li>
	<li>Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 6 µL diH2O en het andere monster toevoegen 6 µL van 2 kU/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL.</li>
	<li>Bij het toezicht op superoxide betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 55 µL van 0,1 M KPO4 buffer en het andere monster toevoegen 55 µL van 6.5 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL.</li>
	<li>Wassen van de cellen met PBS. De media gecombineerd en voeg 150 µL PBS. Vervolgens gecombineerd de PBS. Opmerking: De test wordt gedaan met vergulde, gekoppelde cellen. Dus, is er geen centrifugeren of het gebruik van tripsine in het wasproces.</li>
	<li>Voeg 100 µL van WST-1 oplossing (-) SOD of (-) AO naar kolommen 1-6 en voeg 100 µL van WST-1 oplossing (+) SOD of AO (+) op 7-12 kolommen in de 96-wells-plaat. Gebruik rijen G en H als achtergrond controles (dat wil zeggen, om te controleren wijziging in absorptie in het reagens alleen in putten zonder cellen).</li>
	<li>Meten van de extinctie waarden met behulp van de spectrofotometer elke 10 min voor 1 h op 438 nm.</li>
	<li>Na lezing gecombineerd van de media en elk spoelen met 150 µL van PBS. Vervolgens gecombineerd de PBS.</li>
	<li>Bereken de verandering in absorptie voor elk putje door af te trekken van de aanvankelijke extinctie voor een goed van de extinctie op elk punt van de tijd voor dat goed. Het corrigeren van deze wijziging voor de verandering in de extinctie (indien aanwezig) in de achtergrond putten (d.i., putjes met assay oplossing, maar geen cellen) waargenomen.</li>
	<li>P.a., normaliseren van de gegevens van de extinctie aan de 60 min controle meting of was putjes met PBS of HBS en voer een bicinchoninic zuur (BCA) eiwit bepaling.</li>
	<li>Toevoegen van 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) standaard (variëren van 0,5-2 µL voor de standaard curve, afhankelijk van de mate van de samenvloeiing van de cellen) de lege putjes (rijen G en H), voegt u de BCA reagens aan alle putjes.</li>
	<li>Kwantificeren van de gegevens via nmol van WST-1 vermindering per µg voor eiwit. 37 mM-1 cm-1 22 gebruiken als de coëfficiënt uitsterven voor verminderde WST-1 438 nm.</li>
</ol>2. DPIP vermindering Assay
<ol><li>Groeien en differentiëren C2C12 Adherente cellen met dezelfde procedure als stap 1.1.</li>
	<li>Voorraad 10 mM DPIP oplossing als volgt voorbereiden. Los 0.029 g DPIP (FW: 290.08 g/mol) in 10 mL diH2O. bevestigen de concentratie van DPIP door het meten van de absorptie bij 600 nm met een spectrofotometer. 1 mM-1 cm-1 23 gebruiken als de coëfficiënt uitsterven voor verminderde DPIP op 600 nm. Bewaren bij 4 ° C.</li>
	<li>Voeg 0.0108 g glucose aan 11.880 mL PBS voor een eindconcentratie van 5 mM. Voeg 120 µL van 10 mM DPIP voor een eindconcentratie van 100 µM.</li>
	<li>Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 6 µL diH2O en het andere monster toevoegen 6 µL van 2 kU/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL.</li>
	<li>Bij het toezicht op superoxide betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 55 µL van 0,1 M KPO4 buffer en het andere monster toevoegen 55 µL van 6.5 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL.</li>
	<li>De media gecombineerd en wassen van cellen in 150 µL van PBS. De PBS gecombineerd en voeg 100 µL van DPIP oplossing (-) SOD of (-) AO naar kolommen 1-6 en voeg 100 µL van DPIP oplossing (+) SOD of AO (+) op 7-12 kolommen in de 96-wells-plaat. Rijen G en H wil gebruiken als achtergrond controles (dat wil zeggen, om te controleren wijziging in absorptie in het reagens alleen in putten zonder cellen).</li>
	<li>Meet de extinctie bij het gebruiken van 600 nm spectrofotometer elke 10 min voor 1 h. kwantificeren van de verandering in de extinctie ten opzichte van de controle op 60 min stappen 1.9-1.13 vergelijkbaar.</li>
</ol>3. bepaling van of verminderde elektronen acceptoren substraten voor AO of SOD zijn
<ol><li>Voeg aan 5.436 mL PBS of HBS, 240 µL van 10 mM WST-1 voor een eindconcentratie van 400 µM en 24 µL van 5 mM PMS voor een eindconcentratie van 20 µM.<ol>
<li>Meng voor DPIP, 60 µL van 10 mM DPIP, voor een eindconcentratie van 100 µM, 5.940 mL PBS of HBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 100 µL van de oplossing voor elk goed in een flat-96-Wells bodemplaat bij gebrek aan cellen en meet de extinctie in een spectrofotometer op 438 nm, voor WST-1 of 600 nm, voor DPIP.</li>
	<li>Voeg 1 µL van 10 mM ascorbaat tot de helft van de putten voor een eindconcentratie van 100 μM. Volgen de extinctie totdat het stabiliseert.</li>
	<li>Na stabilisatie, voeg 1 µL van 200 U/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL aan elk putje of Voeg 1 µL van 6 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL tot elk goed en controleren van de extinctie gedurende 1 uur.</li>
</ol>

<ol><li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li>
<li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li>
<li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US8239207">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li>
<li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li>
<li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma-membrane+redox+systems+in+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transplasma-membrane redox systems in growth and development.</a> Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01279296">Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1.</a> Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).</li>
<li>Eccardt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89(2017).</li>
<li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li>
<li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li>
<li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li>
<li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehrlich+cell+plasma+membrane+redox+system+is+modulated+through+signal+transduction+pathways+involving+cGMP+and+Ca2%2B+as+second+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+plasma+membrane+redox+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Multifunctional plasma membrane redox systems.</a> Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li>
<li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho%280%29HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).</li>
<li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li>
<li>Herst, P. M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+oxygen+consumption%3A+a+major+contributor+to+cellular+oxygen+consumption+in+glycolytic+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).</li>
<li>Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li>
<li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li>
<li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+in+mammals%3A+functional+significance+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Capacity+Redox+Control+at+the+Plasma+Membrane+of+Mammalian+Cells+Trans-Membrane%2C+Cell+Surface%2C+and+Serum+NADH-Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).</li>
<li>Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/cpb1958/41/6/41_6_1118/_article">A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye.</a> Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+New+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Gurtoo, H. L., Johns, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2%2C6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).</li>
<li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+%28WST-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li>
<li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li>
<li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+%28phenazine+methosulfate%29+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li>
<li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li>
<li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0,22&cluster=5895405450791166684">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt%2C+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan%3A+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li>
<li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+%28PI3K%29+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li>
<li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+%28B-CPAP%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thyroid+research%22%5BJournal%5D)">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li>
<li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li>
<li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li>
<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben twee methoden voor het gebruik van extracellulaire elektronen acceptoren, WST-1 en DPIP, in spectrofotometrische testen om te controleren van de tPMET in C2C12 myotubes gepresenteerd. Met de groei van de cellijnen in standaard cultuur procedures en een afleesapparaat spectrofotometer is het mogelijk om te controleren tPMET met deze elektronen acceptoren in een eenvoudige microplate-assay. WST-1 vermindering van goed-te-goed binnen een bepaling reproduceerbaar is, maar er is dagelijkse variabiliteit. De dagelijk...

Het vermogen van gezuiverde plasma membranen te beperken van elektronen acceptoren heeft geleid tot de mening dat het plasma-membraan een inherente redox capaciteit1 heeft. Eerder gezien in schimmels, planten en dieren, is tPMET een proces voor meerdere organismen2,3,4,5. Specifiek, heeft dit proces aangetoond in Saccharomyces cerevisiae, wortel cellen, erytrocyten, lymfocyten, Osteosarcoom, melanoom, macrofagen, skeletspieren en neutrofielen2,3, 4 , 5 , 6 , 7. in een proces dat de elektronen in het plasma-membraan om extracellulaire oxidanten vervoert, tPMET is betrokken bij veel cellulaire functies waaronder:5,8van de groei van de cel, cel levensvatbaarheid9, ijzer metabolisme10, cel11,12,13, en bescherming van reactieve zuurstof soorten12,14,15-signalering. Als gevolg van de tPMET de betrokkenheid in veel cellulaire functies, een verstoring van de tPMET heeft zijn hypothetische om bij te dragen aan de ontwikkeling van sommige ernstige hygiënische omstandigheden, met inbegrip van kanker16, hart-en vaatziekten17, en metabole Syndroom van18.
Er zijn meerdere manieren om te controleren van de overdracht van elektronen in het plasma-membraan, maar de meest gebruikte techniek is om te beoordelen van de vermindering van de extracellulaire elektronen acceptoren via colorimetrische testen. Veelgebruikte extracellulaire elektronen acceptoren zijn tetrazolium zouten, DPIP en FeCN20c19,ferricytochrome. De meest gebruikte tetrazolium zout is een tweede generatie zout bekend als WST-119. Deze compound is makkelijker te gebruiken in de colorimetrische testen in vergelijking met eerste generatie tetrazolium zouten als gevolg van twee sulfonaat groepen, die haar water oplosbaarheid21te verhogen. WST-1, is in samenhang met de tussenliggende elektron acceptor 1-methoxy-fenazine methosulfate (mPMS), verminderd in twee single-electron transfer gebeurtenissen. Deze verlaging verandert de geoxideerde vorm van zwak-gekleurde van WST-1 tot en met een meer intense, gele formazan20,22. WST-1 heeft een hoge molaire extinctie coëfficiënt van 37 x 103 M-1cm-1, wat leidt tot een hoge assay gevoeligheid21,22. DPIP wordt ook gebruikt als een accepteerder extracellulaire elektron te controleren tPMET. Het is aangetoond dat DPIP extracellularly kan worden verminderd door tPMET zonder de hulp van tussenliggende elektronen acceptoren23,24. Als gevolg van het ontbreken van tussenliggende elektronen acceptoren, DPIP kan rechtstreeks pick-up elektronen uit het plasma-membraan, in tegenstelling tot WST-124. Gelijkaardig aan DPIP, FeCN heeft aangetoond dat op tPMET zonder de hulp van tussenliggende elektronen acceptoren19,24extracellularly tot ferrocyanide worden verminderd. In tegenstelling tot WST-1 en DPIP heeft FeCN een lage molaire extinctie coëfficiënt leidt tot een lagere assay gevoeligheid9. Een andere veelgebruikte extracellulaire elektron acceptor te controleren van de tPMET is ferricytochrome c. vergelijkbaar met WST-1, ferricytochrome c vermindering neemt toe met het gebruik van tussentijdse elektron acceptor, mPMS22. In tegenstelling tot WST-1 echter is de ferricytochrome c methode minder gevoelig als gevolg van een achtergrond van hoge en een lage molaire extinctie coëfficiënt22.
Hier presenteren we een methode voor real-time analyse van tPMET via spectrofotometrische testen. De methode gebruikt de extracellulaire elektronen acceptoren WST-1 en DPIP, zoals ze allebei een hoge molaire extinctie coëfficiënt hebben terwijl zijn minder duur in vergelijking met de andere vaak extracellulaire elektronen acceptoren zoals ferricytochrome c gebruikte. We fenazine methosulfate (PMS) gebruikt in plaats van mPMS hebben ze een vergelijkbare chemische make-up en PMS is veel minder duur. mPMS is een fotochemisch stabiel die is een belangrijk kenmerk voor een commerciële kit die een lange houdbaarheid moet. Echter maken we PMS vers voor elke assay, dus stabiliteit niet een probleem moet. Ook presenteren we een methode voor het evalueren van mogelijke enzymatische interacties (Zie Figuur 1) tussen de extracellulaire elektron acceptor en enzymen die kunnen worden gebruikt om verder het karakteriseren van het proces van tPMET. In het bijzonder bepalen de enzymen AO en SOD kunnen worden gebruikt welk gedeelte van de tPMET is te wijten aan ascorbaat vervoer of extracellulaire superoxide release, twee veelgebruikte methoden voor elektronen worden vervoerd over het plasma-membraan.

<table><tbody><tr><td>C2C12 myoblasts</td><td>American Type Culture Collection&nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's aangepast arendsmedium - lage glucose</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Plex dierenserumcomplex</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>penicilline-streptomycine</td><td>Sigma</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>paardenserum</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>trypsine-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>15 cm kweekschalen</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>96-well kweekplaten</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-Iodofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazoliunatriumzout (WST-1)</td><td>Accela ChemBio&nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>fenazinemethosulfaat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>ascorbaatoksidase&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>superoxide dismutase&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>2,6-dichioroindofenol natriumzout&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES natriumzout</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>kaliumchloride</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>calciumchloride dihydraat</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>kaliumfosfaat</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Eiwit Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Powerwave X-I spectrofotometer</td><td>Biotek Insturments</td><td>discontinued&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5 Spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>PureGrade 96-well microplate, F-bodem, helder, onbehandeld, niet-steriel</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>IJzer (II) chloride tetrahydraat</td><td>Sigma</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>IJzer (II) sulfaat heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>hypoxanthine</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>xanthine oxidase</td><td>Sigma</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr><tr><td>KC4</td><td>Biotek Insturments</td><td>discontinued&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

meten van trans-plasma membraan elektronentransport door c2c12 myotubes

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membraan elektronentransport (tPMET) speelt een rol in de bescherming van de cellen van intracellulaire reductieve stress, alsmede bescherming tegen schade door extracellulaire oxidanten. Dit proces van het vervoer van elektronen van intracellulaire reductants naar extracellulaire oxidanten is niet goed gedefinieerd. Hier presenteren we spectrofotometrische tests door C2C12 myotubes om te controleren met behulp van de extracellulaire elektronen acceptoren tPMET: wateroplosbare tetrazolium zout-1 (WST-1) en 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP of DCIP). Door middel van vermindering van deze elektronen acceptoren kunnen we controleren dit proces in een real-time analyse. Met de toevoeging van enzymen zoals ascorbaat oxidase (AO) en superoxide dismutase (SOD) aan het testen, kunnen we bepalen welk gedeelte van de tPMET is te wijten aan ascorbaat export of superoxide productie, respectievelijk. Terwijl WST-1 werd getoond aan stabiele resultaten met lage achtergrond, kon DPIP worden opnieuw geoxideerde na toevoeging van AO en SOD, die werd aangetoond met spectrofotometrische analyse. Deze methode geeft aan een real-time, multi goed, snelle spectrofotometrische bepaling met voordelen ten opzichte van andere methoden gebruikt voor het controleren van tPMET, zoals Hexacyanoferraat (FeCN) en c vermindering van de ferricytochrome.

Statistieken werden uitgevoerd met ANOVA met herhaalde maatregelen met behulp van RStudio statistische software25. Omvang van de steekproeven zijn aangegeven in de figuur legendes.
Voor het controleren van tPMET, werden C2C12 myotubes gebruikt samen met de extracellulaire elektronen acceptoren, WST-1 en DPIP. AO werd gebruikt om te bepalen welk gedeelte van WST-1 en DPIP vermindering was te wijten aan asc...

Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Het algemene doel van deze procedure is om het proces van trans-plasmamembraan elektronentransport in realtime te monitoren door middel van spectrofotometrische assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van redoxbiologie over de mechanismen van trans-plasmamembraan elektronentransport en hoe het redoxmilieu van een cel wordt gehandhaafd. Het grote voordeel van deze techniek is dat de assay een realtime, multi-well, snelle spectrofotometrische assay is.Om te beginnen, zet C2C-12 adhesiecellen in twee keer 10 tot de 4e cellen per vierkante centimeter in rijen A tot F van een 96-well plate, bedek de cellen met groeimedia. Incubeer de cellen in een 37 graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxide. Na 24 uur in cultuur, zuig het groeimedia op, was met 150 microliters PBS, vervang met differentiatiemedium en incubeer de cellen gedurende nog eens 24 tot 48 uur.Bereid vervolgens een stock WST-1 en PMS oplossingen. Maak een 10 millimolair stockoplossing van WST-1 door 0,033 gram WST-1 op te lossen in vijf milliliter PBS. Mix vervolgens de oplossing door te vortexen.Bereid vervolgens de stockoplossing van PMS voor door 0,023 gram PMS op te lossen in 1,5 milliliter geïoniseerd water. Mix de oplossing door te vortexen. Om de werkoplossing voor te bereiden, voeg glucose toe aan PBS om 11,4 milliliter van een vijf millimolair glucoseoplossing te maken.Voeg aan deze oplossing 480 microliters van de WST-1 stockoplossing toe voor een uiteindelijke concentratie van 400 micromolair WST-1 en 48 microliters van de PMS stockoplossing voor een uiteindelijke concentratie van 20 micromolair PMS. Mix de oplossingen door te vortexen. Verdeel vervolgens de oplossing in twee zes milliliter aliquots.Afhankelijk van de assay, voeg de relevante componenten toe die hier worden beschreven. Met de oplossingen nu bereid, zuig het differentiatiemedium uit de cellen en was ze eenmaal met 150 microliters PBS. Verwijder de PBS en voeg 100 microliters van aliquot een toe aan kolommen één tot zes.En voeg 100 microliters van aliquot twee toe aan kolommen zeven tot twaalf van de 96-well plate. Plaats de 96-well plate in een plate reader en meet de absorptiewaarden elke 10 minuten gedurende een uur bij 438 nanometer. Na de laatste meting, zuig het media op en was elke well met 150 microliters PBS.Zuig vervolgens de PBS op. Voor analyse, bereken de verandering in absorptie voor elke well door de initiële absorptie voor de well af te trekken van de absorptie op elk later tijdstip voor diezelfde well. Corrigeer deze verandering op basis van de verandering in absorptie die wordt waargenomen in de achtergrond wells.Eenmaal gecorrigeerd voor achtergrond, normaliseer de absorptiegegevens naar de 60 minuten controlemetingen. Als alternatief, normaliseer door het eiwitgehalte in elke well te gebruiken met een standaard BCA-eiwit assay. Ten slotte, kwantificeer de gegevens om de hoeveelheid WST-1 reductie per microgram eiwit te verkrijgen.Om de DPIP reductie assay te beginnen, kweek en differentieer C2C-12 adhesiecellen, zoals getoond voor de WST-1 reductie assay. Bereid vervolgens een stockoplossing voor die 10 millimolair DPIP bevat door 0,029 gram DPIP op te lossen in 10 milliliter geïoniseerd water. Mix vervolgens de oplossing door te vortexen.Bevestig de concentratie door de absorptie van de oplossing te meten bij 600 nanometer met behulp van een spectrofotometer. Om de werkoplossing te maken, voeg 120 microliters van de 10 millimolair DPIP stockoplossing toe aan 11,88 milliliter van een vijf millimolair oplossing van glucose en PBS voor een uiteindelijke DPIP werkconcentratie van 100 micromolair. Mix vervolgens de oplossing door te vortexen.Verdeel vervolgens de oplossing in twee zes milliliter aliquots. Afhankelijk van de assay, voeg de relevante componenten toe die hier worden beschreven. Met de oplossingen nu bereid, zuig het differentiatiemedium uit de cellen en was ze eenmaal met 150 microliters PBS.Verwijder de PBS en voeg 100 microliters van aliquot een toe aan kolommen één tot zes, en 100 microliters van aliquot twee toe aan kolommen zeven tot twaalf van de 96-well plate. Plaats de 96-well plate in een plate reader en meet de absorptiewaarden elke 10 minuten gedurende een uur bij 600 nanometer en analyseer de resulterende waarden zoals beschreven in de WST-1 reductie assay analyse. Om te beginnen, bereid twee oplossingen voor.Bereid eerst zes milliliter van 400 micromolair WST-1 en 20 micromolair PMS in PBS. Bereid vervolgens zes milliliter van een 100 micromolair oplossing van DPIP en PBS. Bereid de eerste 96-well plate voor door 100 microliters van een WST-1/PMS oplossing toe te voegen aan rijen A tot D in een platte bodem plate in afwezigheid van cellen, en meet de absorptie in een spectrofotometer bij 438 nanometer.Bereid vervolgens een tweede 96-well plate voor door 100 microliters van de DPIP oplossing toe te voegen aan rijen A tot D in een platte bodem plate in afwezigheid van cellen, en meet de absorptie in de spectrofotometer bij 600 nanometer. Voeg vervolgens één microliter van 10 millimolair ascorbaat toe aan de helft van de wells voor een uiteindelijke concentratie van 100 micromolair. Monitor de absorptie in de plate totdat deze stabiliseert.Na dit, herhaal met DPIP. Bij stabilisatie, bepaal of de geproduceerde elektronenacceptoren substraten zijn. Voor ascorbaat oxidase voor superoxide dismutase, door het toevoegen van ofwel ascorbaat oxidase of superoxide dismutase aan elke well en het monitoren van de absorptie verandering gedurende één uur.Om transplasmamembraan elektronentransport te monitoren, werd ascorbaat oxidase gebruikt om de effecten van ascorbaat gemedieerde reductie te blokkeren en superoxide dismutase werd gebruikt om superoxide gemedieerde reductie te blokkeren om te bepalen welk deel van WST-1 reductie door elk component werd

measuring-trans-plasma-membrane-electron-transport-by-c2c12-myotubes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

Een beschrijving van een methode voor het profileren van mitochondriale functie in cellen wordt verzorgd. De gegenereerde mitochondriale profiel biedt vier parameters van mitochondriële functie die kan worden gemeten in een experiment: basale ademhaling, ATP-linked ademhaling, proton lek, en reservecapaciteit.

Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca...

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Skeletspieren is essentieel voor de motoriek en is het lichaam 'belangrijkste eiwit store. Muscle gezondheid metingen binnen C. elegans beschreven. Prospectieve veranderingen in de spier structuur en functie worden beoordeeld met behulp van gelokaliseerde GFP en kationische kleurstoffen.

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen C. elegans

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van het moleculaire mechanisme van proton translocatie in verschillende lipide membranen van één liposomen, met behulp van cytochroom bo3  als voorbeeld. Het combineren van de elektrochemie en fluorescentie microscopie, pH-veranderingen in het lumen van enkele blaasjes, bevattende één of meerdere enzym, kan worden gedetecteerd en individueel geanalyseerd.

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

Mitochondriën zijn belangrijke metabole organellen die een hoog niveau van fenotypische plasticiteit in de skeletspieren vertonen. De import van eiwitten uit het cytosol is een kritieke route voor organelbiogenese, essentieel voor de uitbreiding van het reticulum en het behoud van de mitochondriale functie.  Daarom dient eiwitimport als een barometer van cellulaire gezondheid.

Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën

Dit protocol beschrijft een vergelijkende test, met behulp van mitochondriale complexe activiteiten CI+CIII en CII+CIII in de aan- of afwezigheid van Na+, om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te bestuderen.

Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na + onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools

Leer trans-plasma membraan elektronentransport meten in C2C12-myotubes via spectrofotometrische assays. Deze real-time methode helpt onderzoekers de mechanismen van celredoxbalans te begrijpen.

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Meer video's verkennen