Name: Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer dorsale wortelganglia isolatie en primaire cultuur om neurotransmittervrijgave in sensorische neuronen te bestuderen. Deze methode biedt inzicht in perifere nociceptie en pijnmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. M. Calkins voor Engelse bewerken. Dit werk werd gesteund door de Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung Universiteit, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) en Ministerie van wetenschap en technologie (105-2320-B-182-012-MY2).

Alle hierin beschreven methoden die gebruikmaken van proefdieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruiken Comité (IACUC) van Chang Gung Universiteit (CGU 13-014).
1. Verzamel lumbale DRG van experimentele ratten
<ol><li>2 tot 3 weken oude Sprague-Dawley (SD) ratten voor lumbale DRG-collectie gebruiken Opmerking: DRG neuronen van ratten verzameld van meer dan 4 weken oud groeien niet goed onder de voorwaarden van de cultuur die hierin worden beschreven.</li>
	<li>Alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf steriliseren.</li>
	<li>Anesthetize van de rat met een 1:1 mengsel van tiletamine en zolazepam (20 mg/kg; intraperitoneale injectie (IP)) en wacht totdat het dier geen reactie van voet-intrekking in een teen-snuifje-test toont. Opmerking: Verschillende verdoving strategieën kunnen worden gebruikt met succes in dit protocol.</li>
	<li>Offeren de rat door onthoofding met een commerciële guillotine.</li>
	<li>Gebruik de guillotine te isoleren van de romp van het lichaam van de rat tussen de voorpoot en dijbeen. Zie figuur 1A voor een diagram van de regio te verzamelen. Opmerking: De caudal gesneden regel moet gewoon rostraal van het dijbeen. De lumbale L6-DRG zal worden verwijderd als de gesneden site te hoog in de wervelkolom is.</li>
	<li>Snij langs het borstbeen en verwijder alle organen/weefsels met een dissectie schaar (figuur 2A-a).</li>
	<li>U snijdt langs de kant van de kofferbak te verzamelen van het dorsale deel van de rat en het verwijderen van de huid. Zie figuur 1B voor een foto van de ontleed dorsale stam.</li>
	<li>Het weefsel op ijs bereiden vóór het verzamelen van de Deutsche Reichsbahn. Reinig de bont en bloed van handschoenen en steriliseren hen met 75% ethanol voordat u verdergaat met de volgende stap.</li>
	<li>Verwijder de spieren die betrekking hebben op de lumbale wervelkolom. Controleer eerst twee sneden langs de zijkanten van de wervelkolom (links en rechts) en een laterale knippen ter gelegenheid van de rostraal omvang van de lumbale wervelkolom. Verwijder vervolgens de dorsale spieren van de wervelkolom met een bot snijden Tang (figuur 2A-b).</li>
	<li>Verwijder het dorsale gedeelte van de wervels met bot snijden pincet en bloot van het ruggenmerg.</li>
	<li>Het verwijderen van het ruggenmerg met een dissectie schaar (figuur 2A-c) en pincet (figuur 2A-d).</li>
	<li>De lumbale DRG identificeren door te tellen vanaf de laatste rib (Thoracic Vertebra 13) wervels. Zie Figuur 1 c voor een diagram van de posities van de wervels.</li>
	<li>De bilaterale lumbale DRG (L1-L6) met micro-schaar (figuur 2A-f) in een 35-mm cultuur schotel met 2 mL ijskoud serumvrij medium verzamelen. Verwijder de neuronale vezels (zoals aangegeven in Figuur 1 c) uit het aansluiten van de Deutsche Reichsbahn en breng dit in de cultuur-schotel ter verbetering van de zuiverheid van de culturen. Opmerking: De verzamelde DRG kan worden gehouden in medium op het ijs gedurende ongeveer 1 uur. Ondertussen kunnen meerdere ratten worden euthanized om te maken een grotere pool van de Deutsche Reichsbahn.</li>
</ol>2. primair cultuur van Rat Lumber DRG
Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
<ol><li>Bereiden kweekmedium dat 10% foetale runderserum, 100 mM natrium pyruvaat en 1 x penicilline/streptomycine in 1 x DMEM-F12.</li>
	<li>Jas de celcultuur behandeld 24-well plaat met 200 µg/mL poly-L-lysine voor 2 h dan wassen met gesteriliseerd water.</li>
	<li>De cultuur-schotel met 1 mL gestolde voedingsbodem in een 37 ° C CO2 incubator vóór gebruik gedurende ten minste 30 minuten vooraf uit te broeden.</li>
	<li>De DRG-bevattende 35 mm schotel overboeken naar een laminaire kap, en wassen van de DRG met serumvrij medium 3 keer Pipetteer. Opmerking: De buitenkant van de schotel moet worden gereinigd met 75% ethanol voordat overgeplaatst naar de kap. De 35 mm-schotel kan DRG uit een aantal ratten (dit zal afhangen van de eisen van de proefopzet) bevatten.</li>
	<li>Verplaatsen van de Deutsche Reichsbahn (uit een enkele rat of gecombineerd uit meerdere ratten) naar een nieuwe schotel voor de cultuur van de 35 mm, waarin 2 mL van collagenase type IA (1 mg/mL in serumvrij medium) met een steriel pincet (figuur 2A-e). Opmerking: De collagenase oplossing moet worden gesteriliseerd door het passeren van een 0,22 µm spuit filter.</li>
	<li>Het verteren van de DRG in de collagenase oplossing in een 37 ° C CO2 incubator voor 30 min.</li>
	<li>Verwijder de collagenase oplossing en wassen de DRG 3 keer in 2 mL Hank evenwichtig zoutoplossing (HBSS). Opmerking: Kan er resterende vezels of weefsels die uit de DRG in de oplossing komen. Pipetteer met het wassen-oplossing verwijderen.</li>
	<li>Voeg toe 2 mL opgewarmd vooraf trypsine-EDTA 0,05% in de DRG-bevattende 35 mm schotel en verteren de DRG in een 37 ° C CO2 incubator voor 30 min.</li>
	<li>De 2 mL van oplossing DRG-bevattende overbrengen in een centrifugebuis 15 mL door glazen pipet. Opmerking: De DRG zou vasthouden aan de glazen pipet dus deze stap moet met zorg worden uitgevoerd. Deutsche Reichsbahn verlies kan worden vermeden door het bijhouden van de DRG-bevattende oplossing in de taps toelopende einde van een glazen pipet (ongeveer 0,5 mL) en het overbrengen van de oplossing in de centrifugebuis langzaam maar zonder pauze.</li>
	<li>Centrifugeer de oplossing bij 290 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en een ander 2-mL serumvrij medium om resuspendeer de DRG toevoegen.</li>
	<li>Herhaal stap 2.10 2 keer maar verandering de middellange serumvrij cultuurmedium voorverwarmde op de laatste tijd.</li>
	<li>Handmatig triturate de DRG ongeveer 60 keer met behulp van een pipet Pasteur vlam-gepolijst (lengte 230 mm en tip hoofd inwendige diameter 1 mm). Zie figuur 2B voor een foto van de opening van een vlam-gepolijst Pasteur pipet om een niet-gepolijst pipet te vergelijken. Opmerking: De binnen diameter van de vlam-gepolijst Pasteur Pipet is ongeveer 10% kleiner dan de controle pipet en de binnenkant van het tapse einde moet soepeler. Wees voorzichtig niet te maken bellen wanneer de cellen triturating.</li>
	<li>Verwijder de poly-L-lysine-coated schotel uit de CO2 incubator. Gecombineerd bebroede voedingsbodem van de schotel en zaad van de gedissocieerde cellen op de gecoate schotel.</li>
	<li>Zaad van de DRG cellen van een rat (bilaterale collectie van L1-L6, voor 12 totale DRG) in vier putjes van de plaat van een 24-well; Er zijn ongeveer 5 x 104 cellen in één putje van de plaat van een 24-well. Opmerking: Deze dichtheid is geschikt voor de opsporing van de vrijgegeven CGRP of SP en ook geschikt voor immunokleuring. Beënt de DRG cellen van een rat (bilaterale L1-L6) in één putje van de plaat van een 6-well voor westelijke vlek of RNA extractie.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium op de volgende dag met de toevoeging van 10 µM cytarabine (Ara-C) en 100 ng/mL NGF en vernieuwen van het medium daarna om de twee dagen. Opmerking: De thoracale DRG ook kan ook worden gekweekt door dit protocol, als zij verzameld van de thoracale wervelkolom zijn.</li>
</ol>3. de transfectie van NPFFR2 siRNA in DRG cellen
<ol><li>Uitvoeren van de transfectie van NPFFR2 siRNA en controle van siRNA volgens protocol van de fabrikant. Opmerking: Het protocol moet worden aangepast als de gekozen transfectiereagens is anders dan degene die we gebruikt (Zie de Tabel van de materialen).</li>
	<li>Op dag 3 na cel plating, als u het medium op 0,5 mL pre warme serumvrij gemiddeld en de DRG in een 37 ° C CO2 incubator voor 1 h uit te broeden.</li>
	<li>Toevoegen van 50 nM van siRNA (in 1 µL RNase-gratis water) in 12,5 µL serumvrij middellange.</li>
	<li>2.5 µL transfectiereagens toevoegen tot 10 µL van de serum-vrij van het medium.</li>
	<li>Meng de oplossing van stap 3.3 en 3.4 door Pipetteer en incubeer deze gemengde transfectie oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg de transfectie oplossing in één DRG-bevattende 24-well plaat en meng de oplossing met medium door zacht te schudden. Opmerking: Meerdere oplossingen van de transfectie moeten worden ingezet op hetzelfde moment als meerdere wells nodig om te zijn transfected.</li>
	<li>Incubeer de DRG in een 37 ° C CO2 incubator voor 6 uur.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL/goed kweekmedium bevattende 20% foetale runderserum, 100 mM natrium pyruvaat en 1 x penicilline/streptomycine in 1 x DMEM-F12, met de toevoeging van 10 µM Ara-C en 100 ng/mL NGF, in de 24-well-plaat.</li>
	<li>Incubeer de DRG in een 37 ° C CO2 incubator voor een ander 66 h (refresh het medium bij 48 h).</li>
</ol>4. vrijlating van Neurotransmitters uit primaire DRG cellen
<ol><li>Op dag 6 na cellen werden verguld (72 uur na de siRNA transfectie), te wijzigen in het kweekmedium 200 µL serumvrij normaal en Incubeer de cellen in een 37 ° C CO2 incubator voor 30 min.</li>
	<li>Voeg 1 µL stimulatie chemical(s) en meng voorzichtig de media door pipetteren. Incubeer de schotel in een 37 ° C CO2 incubator voor de aangewezen tijd. Opmerking: In dit artikel de gekweekte cellen werden gestimuleerd met de NPFFR2-agonist, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol), gedurende 1 uur.</li>
	<li>Het kweekmedium ophalen op de cultuur schotel en centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot een zwevende onzuiverheden te verwijderen.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof van het centrifugeren verzamelen en verdunnen van de monsters met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), zo nodig. -Test op het niveau van neurotransmitters met enzyme-immunoassay (EIA) kits. Opmerking: Hier, het supernatant waren verdunde 1:100 voor het analyseren van de hoeveelheid CGRP. De bovendrijvende substantie was niet verdund voor het analyseren van het niveau van de SP.</li>
</ol>5. CGRP en SP EIA
<ol><li>Analyseer de monsters onmiddellijk volgens protocol van de CGRP of SP EIA kit van de fabrikant. Opmerking: Het protocol zal variëren afhankelijk van de kit gebruikt.</li>
	<li>Spoel de CGRP EIA putten 5 keer met was buffer bij de kit geleverd.</li>
	<li>Voeg 100 µL monsters met 100 µL anti-CGRP acetylcholinesterase (AChE) tracer in de putjes CGRP EIA, en voeg 50 µL monsters, 50 µL anti-SP AChE tracer en 50 µL anti-SP antiserum in de SP EIA-putten.</li>
	<li>Verzegel de CGRP en SP putjes met plastic folie die bij de kits is geleverd.</li>
	<li>Incubeer de putjes 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Was de putjes goed 5 keer met CGRP of SP wassen buffer en verwijder alle de resterende oplossing uit de putten.</li>
	<li>Voeg 200 µL Ellman van reagens in de CGRP of SP putten die bij de overeenkomstige EIA-kits is geleverd.</li>
	<li>Incubeer de CGRP putten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, en de SP putten gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur incuberen. De putjes beschermen tegen licht voor beide testen.</li>
	<li>Lees de platen bij golflengte 414 nm en de resultaten volgens de overeenkomstige EIA-instrument te berekenen. Opmerking: Raak de bodem van de putten met de hand de allertijden en schoon het water vlekken van goed onder door lens schoonmaak doekjes voor het toevoegen van de Ellman reagens.</li>
</ol>

<ol><li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBear%2C+MF+%22Neuroscience%3A+exploring+the+brain%22">Neuroscience: exploring the brain</a>. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).</li>
<li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+dynamics+of+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+neural+science%22">Principles of neural science</a>. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).</li>
<li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11557989">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li>
<li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li>
<li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperalgesia+and+allodynia%3A+peripheral+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Joint+Bone+Spine%22%5BJournal%5D)">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+from+form+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li>
<li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li>
<li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Anestesiol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain%3A+an+in+vivo+and+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126(2011).</li>
<li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Reg+Anesth+Pain+Med%22%5BJournal%5D)">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li>
<li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li>
<li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li>
<li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures%3A+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li>
<li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+A+transcriptomic+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li>
<li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li>
<li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670(2015).</li>
<li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li>
<li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li>
<li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel, tonen we de collectie enzym-dissociatie en de cultuur van rat lumbale DRG. Met de steun van de neurotrophic van de NGF uitgebreid de axonen van neuronen van de DRG binnen 3 dagen na het zaaien van de cel. De uitgebreide axonen waren duidelijk waarneembare nadat cellen werden gekleurd voor CGRP eiwit, die wordt gesynthetiseerd in de cel soma en vervoerd worden langs de axon vezels. De processen van satelliet cellen ook uitgebreid, waardoor deze scheidslijn gliale cellen te omringen de neuronen binnen dagen...

De organen van de cel van de sensorische neuronen bevinden zich in de Deutsche Reichsbahn. Deze neuronen zijn pseudo-unipolaire en innervate zowel perifere weefsels en het centrale zenuwstelsel. De perifere zenuwuiteinden van de sensorische neuronen zijn gevonden in de spier, huid, viscerale organen en bot, onder andere weefsels. Zij zenden perifere sensatie signalen aan de zenuw uitgangen in de spinale dorsale hoorn en de signalen worden vervolgens doorgestuurd naar de hersenen via verschillende oplopende trajecten voor somatische sensatie1,2. Somatische sensatie maakt het lichaam te voelen (dat wil zeggen, aanraking, pijn en thermische gewaarwordingen) en het waarnemen van verkeer en ruimtelijke oriëntatie (proprioceptief sensaties)1,3. Er zijn vier subklassen van primaire afferent axonen, met inbegrip van groep I (Aα) vezels die inspelen op de proprioceptie van skeletspieren, groep II (Aβ) vezels die inspelen op de mechanoreceptors van de huid, en groep III (Aδ) en groep V C vezels die inspelen op de pijn en temperatuur. Alleen de C vezels zijn unmyelinated, terwijl de rest zijn myelinated op verschillende graden.
Nociceptors zijn de primaire sensorische neuronen, die worden geactiveerd door schadelijke stimuli (mechanische, thermische en chemische stimulatie) die potentieel voor weefselschade dragen. Deze neuronen zijn samengesteld uit myelinated Aδ vezels en unmyelinated C vezels1,4. De vezels van de Aδ express de receptoren voor zenuw groeifactor (NGF, trkA receptor), CGRP en SP. De C-vezels worden geclassificeerd als ofwel peptidergic en niet-peptidergic C-vezels. Aan de andere kant, express de niet-peptidergic C vezels de receptoren voor gliale-afgeleide neurotrophic factor (GDNF, RET en GFR-receptoren), isolectin IB4 en ATP-gated ion kanaal subtype (P2X3)5,6,7. Nociceptors kan onderscheiden door de expressie van ionenkanalen en geactiveerd door neurotrophic factoren, cytokines, neuropeptides, ATP of andere chemische verbindingen8. Bij stimulatie, worden neurotransmitters, waaronder CGRP, SP en glutamaat vrijgesteld van sensorisch neuron terminals in de spinale dorsale hoorn voor het verzenden van Nociceptieve signalen2. Deutsche Reichsbahn zijn niet alleen bestaat uit neuronen, maar bevatten ook satelliet gliacellen. Satelliet cellen rondom de sensorische neuronen en bieden ondersteuning voor mechanische en metabole9,10. Interessant, is er een groeiend lichaam van aanwijzingen waaruit blijkt dat satelliet gliale cellen in de DRG kunnen worden betrokken bij de regulering van pijn sensatie11.
Sensorische neuronen zijn bij de meest vaak gebruikte primaire neuronale cellen12 en hebben gebruikt voor electrofysiologie, signaaltransductie en neurotransmitter release studies gemeld. Ze worden ook vaak gebruikt om te verkennen van de cellulaire mechanismen van neuronale ontwikkeling, inflammatoire pijn, neuropathische pijn, gevoel van de huid (zoals jeuk) en axon uitgroei12,13,14,15. Deutsche Reichsbahn primaire culturen kunnen worden gekweekt als gedissocieerde neuronen te beoordelen van biochemische veranderingen in één of meerdere cellen, zodat wetenschappers voor het uitvoeren van studies die in experimentele onderwerpen kunnen niet worden uitgevoerd. Onlangs, DRG werden met succes gekweekt uit menselijke orgaandonoren die misschien veel profijt hebben van translationeel onderzoek16. Aan de andere kant, kunnen sensorische neuronen ook worden gekweekt zoals DRG explants. De DRG explantaten behouden de oorspronkelijke architectuur van het weefsel van de neuronen, met inbegrip van cellen van Schwann en satelliet gliale cellen, en zijn met name nuttig zijn te onderzoeken van interacties tussen neuronale en non-neuronale cellen17. Deutsche Reichsbahn primaire culturen kunnen gemakkelijk worden voorbereid binnen 2,5 uur. De cel samenstelling en eigenschappen zijn weerspiegelend van de bron van de Deutsche Reichsbahn, en als zodanig, specifieke DRG (lumbale of thoracale DRG) kan worden verzameld volgens experimentele eisen. Culturen van embryonale en neonatale DRG neuronen vereist NGF om te overleven en induceren axon uitgroei, maar culturen van volwassen neuronen vereisen niet de toevoeging van neurotrophic factoren de media12,17. Er zijn ook commercieel beschikbare DRG-hybridoma cellijnen zoals ND7/23 en F11, die niet dat het gebruik van proefdieren eisen. Echter het gebrek aan de potentiële catie van voorbijgaande receptor onderfamilie V lid 1 (TRPV1) kanaal expressie (een belangrijke marker voor kleine zintuiglijke Nociceptieve neuronen) en elkaar gene expressieprofielen beperken hun toepassingen-18. Onlangs, vereeuwigd DRG neuronale cel lijnen zijn afgeleid van de rat (50B11)19 en muis (MED17.11)20, die geschikt zijn voor gebruik in high-throughput schermen voor drug targeting studies. Genexpressie profilering voor deze cellijnen moet echter nog worden uitgevoerd. De experimenten van de validatie vergelijken deze vereeuwigd cellen te sensorische neuronen zijn dus nog aan de gang.
NPFFR2 wordt gesynthetiseerd in de DRG en translocated aan op de ingangen van de sensorische zenuw in de spinale dorsale hoorn21. In dit artikel bieden wij een protocol voor het kweken van lumbale DRG-cellen en hen te behandelen met een agonist van NPFFR2 voor het opwekken van de vrijlating van neurotransmitters, CGRP en SP. De afhankelijkheid van NPFFR2 is verder getest met behulp van NPFFR2 Klein Mengend RNA (siRNA), die kan zijn transfected in de gekweekte cellen van de Deutsche Reichsbahn.

<table><tbody><tr><td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>anestheticum</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-033-1</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>12400024</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P9011</td><td>Schaalcoating</td></tr><tr><td>Collagenase IA</td><td>Sigma</td><td>9001-12-1</td><td>Enzymedigestie</td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-051-5</td><td>Enzymedigestie</td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td>Cell trituratie</td></tr><tr><td>Cytarabine (Ara-C)</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>NPFFR2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-099691-02-0005</td><td>Transfectie</td></tr><tr><td>Non-targeting siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-001810-10-05</td><td>Transfectie</td></tr><tr><td>NeuroPORTER Reagent</td><td>Genlantis</td><td>T400150</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>dNPA</td><td>Genemed Synthesis</td><td>N/A</td><td>NPFFR2-agonist</td></tr><tr><td>CGRP ELISA</td><td>Cayman</td><td>589001</td><td>EIA</td></tr><tr><td>SP ELISA</td><td>Cayman</td><td>583751</td><td>EIA</td></tr><tr><td>CGRP-antilichaam</td><td>Calbiochem</td><td>PC205L</td><td>IHC</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>IHC</td></tr></tbody></table>

dorsal root ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de neurotransmitter release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) bevatten cel organen van de sensorische neuronen. Dit type van neuron is pseudo-unipolaire, met twee axonen die perifere weefsels, zoals huid, spier en viscerale organen, alsmede de spinale dorsale Hoorn van het centrale zenuwstelsel innervate. Sensorische neuronen zenden somatische sensatie, met inbegrip van de aanraking, pijn, thermische en proprioceptieve sensaties. Daarom worden DRG primaire culturen veel gebruikt om te studeren de cellulaire mechanismen van Nociceptie, fysiologische functies van de sensorische neuronen, en neurale ontwikkeling. In studies waarbij electrofysiologie, signaaltransductie, neurotransmitter release of calcium beeldvorming kunnen de beschaafde neuronen worden toegepast. Met DRG primaire culturen, wetenschappers kunnen cultuur gedissocieerde DRG neuronen als u wilt controleren van biochemische veranderingen in één of meerdere cellen, het overwinnen van veel van de beperkingen die zijn gekoppeld aan in vivo experimenten. Ten opzichte van commercieel zijn beschikbare DRG-hybridoma cellijnen of vereeuwigd DRG neuronale cellijnen, de samenstelling en eigenschappen van de primaire cellen veel meer vergelijkbaar met de sensorische neuronen in weefsel. Vanwege het beperkt aantal gekweekte DRG primaire cellen die geïsoleerd uit een enkel dier worden kunnen, is het echter moeilijk uit te voeren van high-throughput schermen voor drug targeting studies. In het huidige artikel, worden procedures voor het verzamelen van de Deutsche Reichsbahn en cultuur beschreven. Daarnaast tonen we de behandeling van gekweekte DRG cellen met een agonist van neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) voor het opwekken van de release van peptide neurotransmitters (calcitonine-gen-gerelateerde peptide (CRGP) en stof P (SP)).

Rat lumbale DRG neuronen, gekweekt in een 24-well plaat, zijn geteeld in een kweekvloeistof met extra Ara-C voor de remming van gliale celproliferatie en NGF neuronale groei te ondersteunen. De morfologie van levende cellen van de DRG werd waargenomen. Zoals blijkt uit Figuur 3, was de cel lichaam van een enkel neuron aangesloten op de bodem van een schotel op dag 1 en geselecteerd voor observatie. Axon groei werd gecontroleerd vanaf dag 1 – 3. De gliacellen ...

Dorsal root ganglia (DRG) primaire culturen worden vaak gebruikt om te studeren fysiologische functies of pathologie-gerelateerde gebeurtenissen in de sensorische neuronen. Wij tonen hier, het gebruik van lumbale DRG culturen te detecteren het vrijkomen van neurotransmitters nadat neuropeptide FF receptor 2 stimulatie met een selectieve agonist.

Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van sensorisch onderzoek te beantwoorden, zoals perifere nociception. Het belangrijkste voordeel van deze technische is dat het onderzoeken van het cellulaire mechanisme van sensorische neuronen met het model dat de meeste simuleert tot fysiologische conditie. Verzamel de lendenen rugwortel ganglia uit de stam van een twee tot drie weken oude rat.Begin met het maken van twee sneden langs de zijkanten van de wervelkolom en een laterale snede om de rostrale omvang van de lumbale wervelkolom te markeren. Gebruik vervolgens botsnijdende tangen om de rugspieren van de wervelkolom te verwijderen. Verwijder vervolgens het dorsale gedeelte van de wervels en stel het ruggenmerg bloot.Gebruik vervolgens dissectie schaar en tangen om het ruggenmerg te verwijderen. Identificeer de lumbale DRG door wervels van de laatste rib te tellen. Dit diagram toont de wervelposities.Gebruik een microschaar om de 12 bilaterale lumbale DRG van L1 naar L6 te verzamelen. Verwijder alle bijgevoegde neuronale vezels om de zuiverheid van de cultuur te verbeteren. Breng elke lumbale DRG over op een 35 millimeter kweekschotel met twee milliliter ijskoud serumvrij medium. Breng de DRG-bevattende 35 millimeter schotel in een laminaire kap, en was de DRG met serum-vrij medium drie keer door pipet.Gebruik steriele pincetten om de DRGs te verplaatsen naar een nieuwe 35 millimeter kweekschotel met twee milliliter steriele collagenase type 1A. Plaats het weefsel in collagenase oplossing in de 37 graden Celsius weefsel cultuur incubator gedurende 30 minuten om te beginnen met dissociatie van de cellen. Na de incubatie, verwijder de collagenase oplossing en was de DRG drie keer in twee milliliter van evenwichtige zout hank's oplossing.Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde 0,05% trypsin EDTA toe aan de schotel en vert verteer de DRG in de couveuse 30 minuten zoals voorheen. Gebruik na de spijsvertering een glazen pipet om de twee milliliter DRG-bevattende oplossing over te brengen naar een 15 milliliter centrifugebuis. De DRG kan vasthouden aan de glazen pipet, zodat deze stap moet worden uitgevoerd met zorg.Het werkelijke verlies kan worden voorkomen door de DRG-bevattende oplossing in het tappeneinde van de glazen pipet te houden en de oplossing langzaam maar zonder pauze in de centrifugebuis te brengen. Vervolgens centrifuge de oplossing op 290 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Na het centrifugeren, verwijder de supernatant en voeg nog eens twee milliliter serumvrij medium toe om de DRG opnieuw op te hangen.Herhaal de was twee keer, met behulp van twee milliliter van voorverwarmde kweekmedium om het weefsel na de laatste centrifugatie opnieuw op te hangen. Gebruik de eerder voorbereide steriele vlam gepolijste pipet om de DRG ongeveer 60 keer handmatig te tritureren. Verwijder vervolgens een poly-L-lysine gecoate 24 putplaat met één milliliter kweekmedium per put uit de CO2-incubator.Aspirate de geïncubeerde cultuur medium uit het gerecht. Zaad de DRG cellen van een rat in vier van de putten. Dit geeft een zaaidichtheid van ongeveer 500.000 cellen per put.De volgende dag, vervang het kweekmedium met medium aangevuld met 10 micromolar AraC, en 100 nanogram per milliliter NGF. Verander op dag drie na celbeplating het medium tot 0,5 milliliter voorverwarmd serumvrij medium en broed gedurende een uur in. Voeg tijdens de incubatie 50 millimolar siRNA toe in één microliter RNase-vrij water tot 12,5 microliter serumvrij medium per transfectie.Dan pipette 2,5 microliter van transfectie reagens in 10 microliter van serum-vrij medium voor elke transfectie. Meng beide oplossingen door pipet, en uitbroed deze gemengde transfectie oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 10 minuten de transfectieoplossing toe aan de putten van de DRG-bevattende 24 putplaat en meng door zachtjes te schudden.Na een incubatie van zes uur voegt u 0,5 milliliter kweekmedium toe met 20%FBS, 10 micromolar AraC en 100 nanogram per milliliter NGF in elke put van cellen. Tot slot, inculbateren van de DRG in een 37 graden Celsius CO2 incubator voor nog eens 66 uur. Op dag zes na beplating, en 72 uur na siRNA transfection, verander het kweekmedium tot 200 microliters van serumvrij medium.Na een incubatie van 30 minuten, voeg een microliter van de stimulatie chemische stof en voorzichtig mengen door pipetten. De NPFFR2 agonist, dNPA, en bijbehorende voertuig worden hier gebruikt. Na het uitbroeden voor de vereiste periode, verzamel het cultuurmedium van de cultuurschotel, en centrifuge bij 5000 keer G vijf minuten bij vier graden Van Celsius om om het even welke opgeschorte onzuiverheden te verwijderen.Verzamel de supernatant uit de centrifugatie en verdun indien nodig met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Test de niveaus van neurotransmitters met commercieel beschikbare enzym immunoassay kits. Op dag één, het cellichaam van een enkel neuron aangegeven door de pijl werd bevestigd op de bodem van een schotel.Een gliacel aangegeven door een pijlpunt is ook aanwezig. De gliacellen gedupliceerd en uitgebreid processen om het cellichaam van het sensorische neuron te omringen op dag twee, een proces dat nog prominenter was op dag drie. In een andere cultuur werd CGRP-eiwit gekleurd om de vorm van neuronen te onthullen.CGRP eiwit kleuring verschijnt in het cytoplasma en axonen van zintuiglijke neuronen. De nucleaire morfologieën van neuronen en gliacellen zijn verschillend wanneer ze met DAPI worden gekleurd. De neuronen hebben een grotere en meer afgeronde kern dan gliacellen.Ter vergelijking, de kernen van glia zijn meer ovaal van vorm. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in twee en een half uur als het goed wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe te ontleden en cultuur van de dorsale wortel ganglion, en gebruik het als een instrument om onderliggende fysiologische functies te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met primaire cellen kan veel moeilijker zijn dan het werken met gewone cellijnen, en zacht is altijd de beste manier bij het uitvoeren van deze procedure.

dorsal-root-ganglia-isolation-primary-culture-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we de techniek van het opstellen en onderhouden van gecompartimenteerd kamers voor het kweken van sensorische neuronen van de achterwortelganglia.

Voorbereiding en onderhoud van achterwortelganglia Neuronen in Gecompartimenteerde culturen

In dit protocol beschrijven we een nieuwe methode om de invloed van de gliale cel heterogeniteit op axongroei studie met...

Studie gliale cel Heterogeniteit Invloed op Axon groei met een nieuwe methode Coculture

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

This video demonstrates a method to develop dorsal root ganglia or DRG explant culture and DRG-dissociated cell models using isolated mouse DRG tissues. These models help to study various mechanisms with neuron-glial interactions in a controlled environment.

Generating Dorsal Root Ganglion Explant and Dissociated Cell Culture

This video demonstrates a method for harvesting neurons from the dorsal root ganglia (DRG). DRG from a rat's spinal column is isolated, treated with enzymes, and then mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The neurons are separated from glial cells using density gradient centrifugation and cultured in a growth medium.

A Technique for Harvesting and Dissociating Dorsal Root Ganglia for Neuronal Cultures

This video demonstrates a technique for isolating and culturing dorsal root ganglia (DRG) cells from the rat spinal column. DRGs excised from the spinal column are treated with enzymes and mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The cells are cultured in a medium containing inhibitors and growth factors that limit glial cell proliferation and promote neuronal growth, respectively.

Establishing a Primary Dorsal Root Ganglia Cell Culture from a Rat Spinal Column

This video demonstrates the use of transfected dorsal root ganglion cells to study neurotransmitter release by stimulating them with a neuropeptide receptor agonist.

Stimulation of Dorsal Root Ganglion Sensory Neurons Using a Neuropeptide Receptor Agonist

Dit protocol biedt een techniek om geëxplanteerd dorsaal wortelganglion (DRG) van volwassen Sprague Dawley-ratten te oogsten en te kweken in een apparaat met meerdere compartimenten (MC).

Het oogsten, inbedden en cultiveren van dorsale wortelganglia in apparaten met meerdere compartimenten om perifere neuronale kenmerken te bestuderen

Dit protocol beschrijft methoden voor het vaststellen van hele berg en gedissocieerde culturen van muis Dorsal Root Ganglia (DRG) en hun gebruik om tumor-zenuwinteracties te beoordelen.

Opstellen van in-vitromodellen van dorsale wortelgangliacultuur: complementaire benaderingen voor het onderzoeken van overspraak tussen kanker en zenuw

Dorsale wortelganglia (DRG) bevatten primaire sensorische neuroncellen en geven perifere sensorische signalen door aan het ruggenmerg. Dit protocol beschrijft een methode voor de dissectie van de DRG bij muizen die gestandaardiseerde isolatie van structureel intacte ganglia, anatomische segmentale identificatie, intuïtieve begeleiding voor beginnende gebruikers en verminderde procedurele weefselbeschadiging ondersteunt.

Dissectie en isolatie van de dorsale wortelganglia van de muis

Leer dorsale wortelganglia isolatie en primaire cultuur om neurotransmittervrijgave in sensorische neuronen te bestuderen. Deze methode biedt inzicht in perifere nociceptie en pijnmechanismen.

Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Meer video's verkennen