Laser vangt Microdissection voor zeer zuivere Trabecular Zitschalen van muis ogen gen expressie p.a.

Het algemene doel van deze lasermicrodissectieprocedure is om een robuuste en reproduceerbare methode te ontwikkelen voor de isolatie van een sterk verrijkte trabeculair netwerk uit muizenogen met behulp van laser capture microscopie voor daaropvolgende RNA-isolatie en downstream expressieanalyse. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het oogheelkundig veld te beantwoorden, zoals welke belangrijke genen en signaalroutes, wanneer verkeerd gereguleerd, kunnen leiden tot oogziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat hoogwaardig RNA van het trabeculair netwerk van muizenogen reproduceerbaar kan worden geïsoleerd voor genexpressieanalyse.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat lasermicrodissectie een krachtige techniek is die verschillende stappen voor het oplossen van problemen door het hele protocol omvat. Begin deze procedure met optimale weefselcollectie voor lasermicrodissectie zoals beschreven in de tekstprotocol. Spuit RNase ontsmettingsoplossing op de borstel, pincetten, koppelpotten en montagepook.

Na grondig afvegen, spoel de apparatuur af met nuclease-vrij water en droog. Veeg de cryostat af met 100%ethanol om kruisbesmetting te voorkomen. Pers een kleine hoeveelheid O.C.T.op de montagepook, verwijder vervolgens het weefselblok uit de mal en plaats het blok voorzichtig op de montagepook.

Zodra het weefselblok op de montagepook vastgevroren is, plaats het op de monstershouder van de cryostat. Pas vervolgens de cryostat aan om acht-micronsecties te snijden en snij voorzichtig door de O.C.T.blok om het weefselmonster te bereiken. Zodra het weefsel wordt waargenomen, stop met snijden.

Trim de bevroren blokken aan alle kanten met een schone scheermes en laat drie tot vier millimeter O.C.T.rondom het weefsel om hantering met de verfborstel mogelijk te maken. Snijd door het oog en werk snel. Kleur elke derde sectie door de schuif onder te dompelen in een snelle een-staps H&E-kleuring gedurende 60 seconden.

Spoel de sectie af met kraanwater en laat drogen. Na het verduidelijken van de sectie met een verduidelijkingsmiddel, monteer de sectie op een geladen glazen schuif met een dekglas, bekijk onder de microscoop. Blijf snijden totdat de TM duidelijk zichtbaar wordt in de gekleurde secties.

Zodra de TM begint te verschijnen, snijd twee secties en monteer ze op een geladen glazen schuif voor routine H&E-kleuring om een ​​kaart te vormen voor snijden met laser capture microdissectie. Na de eerste H&E-kaartschuif, snijd en lijn zes seriële acht-micron-dikke secties in de cryostat uit en monteer ze tegelijkertijd op de PET-membraanschuif. Plak het weefsel door kort met een behandschoende duim langs de achterkant van het membraan te schuiven.

Na montage, plaats de PET-membraanschuif onmiddellijk in een schuifdoos op droog ijs. Blijf het oog snijden. Na elke twee PET-membraanschuiven met elk zes secties, verzamel twee secties op een geladen glazen schuif om een ​​andere kaartschuif voor H&E-kleuring te maken.

Blijf snijden ongeveer 100 seriële acht-micron-dikke secties totdat de TM niet meer zichtbaar is. Bevestig het ontbreken van TM door snel één sectie op een geladen glazen schuif te kleuren. Na het uitvoeren van de H&E-kaartschuifkleuring zoals beschreven in het tekstprotocol, bekijk H&E-schuiven visueel onder een microscoop.

Identificeer kaartschuiven met TM duidelijk zichtbaar en toegankelijk voor snijden. Gebruik de PET-membraanschuiven tussen deze kaartschuiven voor LCM. Verwijder de schuifdoos met bevroren weefselsecties uit de min-80 graden Celsius vriezer en plaats deze op droog ijs.

Verwerk de schuiven een voor een. Bevestig de secties door de schuif onmiddellijk in koud 75%ethanol te plaatsen dat RNase-remmers bevat gedurende 30 seconden. Dompel de schuif voorzichtig in nuclease-vrij water gedurende 10 tot 15 seconden om de O.C.T.op te lossen zonder de weefselsecties te verstoren.

Pipetteer voorzichtig 300 microliter 1,5% cresyl violet azijnzuur oplossing direct op de secties en incubeer gedurende 45 seconden bij kamertemperatuur. Was vervolgens de secties eenmaal door ze in een 75%ethanolbad gedurende 30 seconden te plaatsen. Pipetteer 200 microliter Eosin Y-oplossing op de secties en incubeer gedurende drie tot vijf seconden.

Dehydrateer het weefsel door de schuiven achtereenvolgens in 75%ethanol, 95%ethanol en ten slotte een 100%ethanolbad gedurende 30 seconden elk te plaatsen. Dep het uiteinde van de schuif met een tissuedoek tussen elke stap om overtollig vocht te verwijderen. Laat de schuif volledig drogen onder de kap gedurende vijf minuten.

Eenmaal droog, voer onmiddellijk LCM uit. Vermijd het gebruik van xyleen voor de laatste verduidelijkingsstap. Xyleenbehandeling zal ervoor zorgen dat de weefselsectie onvoldoende op de membraanschuif wordt gemonteerd.

Xyleen zal ook de efficiëntie van de weefselopname door LCM verminderen. Plaats de PET-membraanschuif met de gekleurde weefselzijde naar beneden direct op de bovenkant van een nieuwe glazen schuif die op het microscoopplatform is geladen. Zorg ervoor dat het membraan en de glazen schuif strak op het microscoopplatform zijn geplaatst.

Start LCM door eerst de schuiflimieten in te stellen. Kies de laagste 4X-vergroting in het Objectiefpaneel en definieer vervolgens het werkgebied van de membraanschuif door de microscoop's XY-trap te verplaatsen totdat de linkerbovenhoek, waar het metaal en het membraan samenkomen, zichtbaar is in de live videofeed. Op dit punt, druk op de Limit 1-knop en er zal een rood rechthoek verschijnen op de wegkaart.

Beweeg vervolgens de XY-trap naar de tegenoverliggende hoek en druk op de Limit 2-knop. Druk op de Scan-knop om een ​​wegkaartbeeld van het