Name: Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor endotheel-mesenchymale overgang in MS-1-cellen met TGF-β2. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar celplasticiteit en microRNA-functie in vasculaire biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Zea Borok en Kohei Miyazono voor suggesties ter voorbereiding van manuscript. H.I.S. en M.H. worden ondersteund door de Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, en H.I.S. wordt ondersteund door de Osamu Hayaishi Memorial Scholarship voor studie in het buitenland. Dit werk werd gesteund door een subsidie van Takeda Science Foundation (A.S.).

1. EndMT-inductie
<ol><li>MS-1 cellen in standaard kweekomstandigheden handhaven en Vermijd confluentie. Een bron van cellen van de MS-1 wordt beschreven in de Tabel van materialen. Voor MS-1 cellen, gebruikt u Minimum essentiële Medium-α (MEM-α) met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 50 U/mL penicilline en 50 μg/mL streptomycine.</li>
	<li>Wassen MS-1 cellen op 10 cm schotel met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1,0 mL trypsine toevoegen aan de plaat. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Loskoppelen van de cellen met behulp van 9 mL van voedingsbodems. Verzamelen celsuspensie in een tube van 15 mL.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 – 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Zorgvuldig Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet cel in voorverwarmde voedingsbodems.</li>
	<li>Levensvatbare cellen tellen met Trypan blauw oplossing en een standaard hemocytometer of een automatische cel teller.</li>
	<li>Plaat MS-1 cellen op ongecoate standaard cultuur platen op 0,5 x 103 cellen per cm,2 voor de lange termijn cultuur. Bijvoorbeeld, cultuur plaat 5.0 x 103 cellen per putje in een 6 goed plaat. Gebruik dezelfde cultuur media met inbegrip van dezelfde concentratie van FCS. In MS-1 cellen induceert TGF-β EndMT in lange termijn cultuur (ten minste 48-72 uur) met het gebruik van FCS.</li>
	<li>Stimuleren endotheliale cellen met TGF-β2 (een eindconcentratie van 1 ng/mL) na 24 h.</li>
	<li>De cellen van de cultuur in een bevochtigde incubator (5% CO2, 37 ° C). Cellen worden dagelijks controleren bij het scherpstellen op morfologische veranderingen.</li>
	<li>De media vervangen door verse voorverwarmde voedingsbodems met TGF-β2 na 48u van behandeling met TGF-β in lange termijn cultuur.</li>
	<li>Ga naar de downstream analyses. Doorgaans actine reorganisatie wordt waargenomen na 24 h behandeling en Downregulatie van endothelial markers en opregulatie van mesenchymale markers worden waargenomen na 48-72 uur van een behandeling met TGF-β.</li>
</ol>2. immunocytochemische analyse
<ol><li>MS-1 cellen in standaard kweekomstandigheden handhaven.</li>
	<li>Plaat MS-1 cellen op 4 cel goed cultuur kamer dia's op 1.0 x 103 cellen per putje (1,7 cm2). Dia's zijn vooraf gecoat met gelatine. Gebruik 0.5 – 1.0 van voedingsbodems per putje mL.</li>
	<li>Stimuleren endotheliale cellen met TGF-β2 (een eindconcentratie van 1 ng/mL) na 24 h. Bij het analyseren van de betrokkenheid van ROCK in EndMT, voeg toe een ROCK-remmer Y-27632 (10 μM) 1 h voorafgaande aan TGF-β behandeling. Bij de beoordeling van het effect van TGF-β signalering remming, kunnen TGF-β receptor kinase-remmers worden gebruikt.</li>
	<li>De cellen van de cultuur in een bevochtigde incubator (5% CO2, 37 ° C). Actin reorganisatie wordt waargenomen in MS-1 cellen na 24 h behandeling met TGF-β. Andere veranderingen duidelijk geworden na 48-72 uur behandeling. Voor 72 h cultuur, door de media te vervangen door verse medium met TGF-β na 48u van behandeling met TGF-β.</li>
	<li>
F-actine kleuring
	<ol>
<li>Na 24u van TGF-β behandeling, media verwijderen, herstellen van cellen met 4% paraformaldehyde in 1 x PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en spoel de cellen met 1 x PBS.</li>
		<li>Incubeer met 0,2% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Spoel driemaal met PBS 1 x cellen.</li>
		<li>Incubeer met phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanaat van Amanita phalloides 150-fold verdund met een blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Spoel driemaal met PBS 1 x cellen.</li>
		<li>Vlek de kernen met cyanine nucleïnezuur bindende kleurstoffen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Spoelen dia's en mount coverslips naar beneden op een dia met behulp van dia montage media.</li>
		<li>Observeren met een confocal microscoop. Gebruik een 543 nm laser en een filter van de emissie van 560-615 nm voor detectie van fluorescentie van phalloidin. Gebruik een 633 nm laser en een emissie filter meer dan 650 nm voor nucleaire kleuring. Bij behandeling met TGF-β, wordt vorming van dik stress vezels geobserveerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VE-cadherine en α-SMA kleuring
	<ol>
<li>Na 72 uur van TGF-β behandeling media verwijderen, herstellen van cellen met koude 50% methanol en 50% aceton (0,5-1,0 mL per putje) gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Spoel driemaal met PBS 1 x cellen (0,5-1,0 mL per putje).</li>
		<li>Incubeer met primaire antilichamen in blokkeerbuffer 's nachts bij 4 ° C in het donker volgens de fabrikant aanbevolen concentratie. Gebruik VE-cadherine monoklonaal antilichaam (BV13, 1:100 verdunning) en α-SMA Cy3-geconjugeerde monoklonaal antilichaam (1A4, 1:200 verdunning)20.</li>
		<li>Spoel driemaal met PBS 1 x cellen.</li>
		<li>Incubeer de cellen met een groene kleurstof-geconjugeerde secundair antilichaam aan antilichaam van de VE-cadherine in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker volgens de fabrikant aanbevolen concentratie.</li>
		<li>Spoel driemaal met PBS 1 x cellen.</li>
		<li>Vlek de kernen met cyanine nucleïnezuur bindende kleurstoffen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Spoelen dia's en mount coverslips naar beneden op een dia met behulp van dia montage media.</li>
		<li>Observeren met een confocal microscoop. Gebruik een 543 nm laser en een filter van de emissie van 560-615 nm voor detectie van α-SMA (Cy3). Gebruik een 488 nm laser en een filter van de emissie van 505 – 550 nm voor detectie van VE-cadherine. Meestal op een behandeling met TGF-β behandeling, afname VE-cadherine signalen en toename van de α-SMA signalen zou worden waargenomen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. drie-dimensionale collageen Gel contractie Assay
<ol><li>Cultuur van MS-1 cellen met/zonder TGF-β voor 72 uur vóór collageen gel contractie assay uitvoeren.</li>
	<li>Voorbereiden van het type I collageen gel op ijs. Meng koude collageen oplossing, 10 x geconcentreerd MEM gemiddeld en collageen verdunning buffer met 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3en 200 mM HEPES pH 7.4 een 8:1:1 verhouding.</li>
	<li>Meng 200 mL van besturingselement of endothelial cel TGF-β-testgroep schorsingen (1.0 x 106 cellen/200 μl) en 800 μl van de collageen gel oplossing. Voor TGF-β behandelde monsters, TGF-β2 toevoegen (1 ng/mL) aan de celsuspensie.</li>
	<li>1,0 mL van het mengsel toevoegen aan elk putje van 12-well cultuur platen en laat stollen in de incubator bij 37 ° C gedurende 30-60 minuten.</li>
	<li>Na gelatinization, overlay 1,0 mL MEM-α met 10% FCS, 50 U/mL penicilline en 50 μg/mL streptomycine te zweven van de gel. Voor TGF-β behandelde monsters, TGF-β2 toevoegen (1 ng/mL) tot de media. Opmerking: Voor TGF-β behandelde monsters, TGF-β toevoegen aan zowel de gel en de voedingsbodems.</li>
	<li>Incubeer de zwevende gels bij 37 ° C gedurende 48 uur.</li>
	<li>De afbeeldingen van gelen vanaf de onderkant van de platen met behulp van een scanner scannen. U kunt ook de beelden van gelen met behulp van een digitale camera op een vaste afstand boven de gels registreren.</li>
	<li>De oppervlakte van gel op basis van het aantal pixels met behulp van ImageJ te kwantificeren. Selecteer de gel met een freehand selectie of verwante selectiegereedschappen, of met behulp van de gel "afbeelding | Aanpassen | Kleur drempel"tool, en controleer op het gebied van het gebruik van de gel" Analyze | Maatregel"commando.</li>
</ol>4. de remming van de miRNA activiteiten door op basis van nucleïnezuur vergrendeld miRNA remmers
<ol><li>MS-1 cellen in standaard kweekomstandigheden handhaven.</li>
	<li>Transfect vergrendeld Nucleic Acid (LNA) miRNA remmers, synthetische miRNA duplexen of siRNAs (20 of 50 nM) met behulp van lipofection reagentia volgens de instructie van de fabrikant. Details en bronnen van LNA miRNA remmers, synthetische miRNA duplexen, en siRNAs werden beschreven in onze eerdere verslagen26,27. In MS-1 cellen, standaard transfectie procedures gebaseerd op instructie van de fabrikant werken goed voor invoering van LNA miRNA remmers, synthetische miRNA duplexen of siRNAs.</li>
	<li>Na 16 – 48 h, stimuleren endotheliale cellen met TGF-β2 (een eindconcentratie van 1 ng/mL).</li>
	<li>Ga naar verschillende downstream analyses, met inbegrip van RNA expressie analyse (kwantitatieve RT-PCR en RNA-sequencing (RNA-seq) analyses), immunocytochemische, en verslaggever assay. Stroomafwaarts analyses zijn beschreven in onze eerdere verslagen20,26,27.</li>
</ol>

<ol><li>Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%3A+Developmental+signaling+pathways+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry.</a> Developmental Dynamics. , (2017).</li>
<li>Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0012160675903218">Structural analysis of endocardial cytodifferentiation.</a> Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).</li>
<li>Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+atrioventricular+valvuloseptal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis.</a> Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+progenitors+of+cardiac+pericytes+and+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells.</a> Nature Communications. 7, 12422(2016).</li>
<li>DeRuiter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+endothelial+cells+transdifferentiate+into+mesenchymal+cells+expressing+smooth+muscle+actins+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro.</a> Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).</li>
<li>Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+occurs+during+embryonic+pulmonary+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endothelium%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development.</a> Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).</li>
<li>Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+partial+endothelial-mesenchymal+transitions+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).</li>
<li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+drives+atherosclerosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).</li>
<li>Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+atherosclerotic+lesion+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification.</a> Atherosclerosis. , 124-127 (2016).</li>
<li>Qiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fate+mapping+in+mice+with+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).</li>
<li>Ranchoux, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25593290">Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+fibroblasts+and+mechanism+of+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis.</a> Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).</li>
<li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+%28EndMT%29+during+vein+graft+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234(2014).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+Growth+Factor-beta1+Induces+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition+via+Akt+Signaling+Pathway+in+Renal+Transplant+Recipients+with+Chronic+Allograft+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction.</a> Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).</li>
<li>Xu-Dubois, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%3A+Evidence+for+Antibody-Endothelium+Interaction+during+Antibody-Mediated+Rejection+in+Kidney+Recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+endothelial+to+mesenchymal+transition+as+a+source+for+carcinoma-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts.</a> Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).</li>
<li>Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-Induced+Endothelial-Mesenchymal+Transition+in+Fibrotic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li>
<li>Mihira, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+mesenchymal+transition+of+MS-1+endothelial+cells+requires+Smad-dependent+cooperative+activation+of+Rho+signals+and+MRTF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A.</a> Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).</li>
<li>Hashimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microRNA+biogenesis%3A+crosstalk+between+p53+network+and+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway.</a> Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+complexity+of+microRNA+generation+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging complexity of microRNA generation cascades.</a> Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).</li>
<li>Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19262572">MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).</li>
<li>Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-23+restricts+cardiac+valve+formation+by+inhibiting+Has2+and+extracellular+hyaluronic+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production.</a> Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).</li>
<li>Katsura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-31+is+a+positive+modulator+of+endothelial-mesenchymal+transition+and+associated+secretory+phenotype+induced+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta.</a> Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).</li>
<li>Suzuki, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TGF-beta-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+by+microRNA-27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27.</a> Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+distinct+TGFbeta+ligand+requirements+during+mouse+and+avian+endocardial+cushion+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis.</a> Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).</li>
<li>Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+for+use+in+vascular+tissue+engineering+obtained+by+endothelial-to-mesenchymal+transdifferentiation+%28EnMT%29+on+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices.</a> Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).</li>
<li>Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta2+promotes+Snail-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+through+convergence+of+Smad-dependent+and+Smad-independent+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling.</a> Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).</li>
<li>Krizbai, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+of+brain+endothelial+cells%3A+possible+role+during+metastatic+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation.</a> PLoS One. 10 (3), e0119655(2015).</li>
<li>Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+promotes+the+differentiation+of+endothelial+cells+into+smooth+muscle-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro.</a> Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).</li>
<li>Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+induces+transdifferentiation+of+iBREC+to+alphaSMA-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).</li>
<li>Paranya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Maleszewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+and+TGFbeta2+synergistically+induce+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+an+NFkappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner.</a> Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-endothelial+transition+contributes+to+cardiac+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization.</a> Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+balance+of+aberrant+Rasal1+promoter+methylation+and+hydroxymethylation+regulates+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis.</a> Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Endothelial+Cells+with+Distinct+Patterns+of+TGFbeta-Driven+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er werd gemeld dat geactiveerde Ras en TGF-β behandeling gedurende 24 uur EndMT in cellen van de MS-1, geïnduceerde terwijl TGF-β alleen mislukte voor het opwekken van EndMT in deze korte periode21. Consequent, vastgesteld we hebben dat TGF-β aanzienlijk EndMT na langere behandeling (48-72 uur) in MS-1 cellen20 geïnduceerde. EndMT herhaaldelijk geconstateerd na langdurige behandeling met TGF-β (2-6 dagen) in verschillende endotheliale cellen zoals menselijke navelstreng ade...

Endotheliale-mesenchymale overgang (EndMT) is het proces waarmee een gedifferentieerde endothelial cel een verscheidenheid van moleculaire veranderingen ondergaat, wat resulteert in een fibroblast-achtige mesenchymale cel1. EndMT werd in eerste instantie beschreven als een Celtransformatie endothelial tijdens de ontwikkeling van het hart2,3. In de vroege ontwikkeling van het hart bestaat de hart-buis uit een binnenste endocard en een buitenste myocard. Deze twee lagen zijn gescheiden door een laag van extracellulaire matrix genaamd de cardiale gelei. De embryonale endocardial cellen, die endothelial cel markeringen verwerven, doorvoer in mesenchymale cellen, de onderliggende cardiale gelei binnenvallen en bevordering van de vorming van de cardiale kussens, de Stichting voorziet in de atrioventriculaire kleppen en tussenschot en de halvemaanvormige kleppen. EndMT is bovendien gesuggereerd als bronnen van pericytes en vasculaire zachte spiercellen in andere embryonale vasculaire systemen met inbegrip van de coronaire bloedvaten, abdominale aorta en longslagader4,5,6. Daarnaast is EndMT betrokken bij de fysiologische angiogenic7kiemen.
Vergaren van bewijs heeft voorgesteld dat de EndMT ook bij meerdere cardiovasculaire aandoeningen en andere ziekten1,8 betrokken is. EndMT-geassocieerde voorwaarden omvatten vasculaire verkalking, atherosclerose, pulmonale arteriële hypertensie, cavernous malformatie, orgel fibrose, ader graft remodelleren, allograft dysfunctie in niertransplantatie en kanker8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. een recent rapport beschreven dat verschillende moleculaire merkers van de EndMT een instrument voor diagnose en prognose-voorspelling van graft renale dysfunctie in nier transplantatie17 zijn kunnen. Modulatie van cellulaire signaalroutes EndMT-gerelateerde is aangetoond dat het verbeteren van de verschillende ziekten met inbegrip van cardiale fibrose en8,15ader graft remodelleren in dierlijke modellen. Daarom is inzicht in de mechanismen onderliggende EndMT belangrijk voor de ontwikkeling van diagnostische en therapeutische strategieën gericht op EndMT.
EndMT wordt gekenmerkt door verlies van cel-cel kruispunten, toename van de trekkende potentieel, Downregulatie van endotheel-specifieke genen zoals VE-cadherine en opregulatie van mesenchymale genen met inbegrip van α-gladde spier actine (α-SMA). Bovendien, EndMT en epitheliale-mesenchymale overgang (EMT), een soortgelijk proces dat epitheliale cellen naar mesenchymale cellen converteert, worden geassocieerd met gewijzigde productie van verschillende componenten van de extracellulaire matrix, die tot de ontwikkeling bijdragen kan van weefsel fibrose8,19.
Onlangs, hebben verscheidene in vitro studies van EndMT details van moleculaire mechanismen van EndMT15,20toegelicht. EndMT wordt veroorzaakt door verschillende signaalroutes inclusief transformeren groeifactor (TGF)-β, Wnt, en Notch1. Onder hen speelt TGF-β cruciaal rollen in de inductie van zowel de EMT en de EndMT. In EndMT, langdurige blootstelling aan TGF-β resultaten in EndMT in verschillende endotheliale cellen, terwijl korte blootstelling lijkt onvoldoende21. We beschreven hier een eenvoudig protocol voor EndMT inductie, waar mijl SVEN 1 (MS-1) muis alvleesklier microvasculaire endotheliale cellen ondergaan EndMT in vitro na langdurige blootstelling aan TGF-β20. In dit model kunnen meerdere stroomafwaartse analyses worden uitgevoerd om te onderzoeken van hallmark kenmerken van EndMT, met inbegrip van morfologische veranderingen, Downregulatie van endothelial markers, opregulatie van mesenchymale merkers en inflammatoire genen, cytoskeletal herschikkingen en collageen gel contractie.
MicroRNAs (miRNAs) zijn ~ 22 nt kleine regelgevende RNAs dat posttranscriptional onderdrukking van verschillende mRNA-doelstellingen-22,23 directe. Door zaad sequentie-gemedieerde doel erkenning, miRNAs onderdrukken van honderden doelgenen en moduleren van diverse cellulaire functies zoals celdifferentiatie, proliferatie en beweeglijkheid. Dit geldt ook voor de verordening van de EMT en EndMT en verschillende miRNAs zijn gemeld als regelgevers van EMT en EndMT24,25. Het model van de EndMT gepresenteerd in dit overzicht kan gemakkelijk worden gecombineerd met miRNA modulatie procedures voor het testen van de rol van miRNAs in EndMT. De huidige herziening bevat een overzicht van onze experimentele procedures om te onderzoeken TGF-β-geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen en omvat ook een vergelijking van de voorwaarden van EndMT inductie door TGF-β in andere endotheliale cellen.

<table><tbody><tr><td>MS-1 cellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R&amp;D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4 wel Lab-Tek II Chamber Slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>nacalai tesque</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3 jodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE cadherin monoklonaal antilichaam (BV13)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>alpha-SMA Cy3 monoklonaal antilichaam (1A4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>Collageen oplossing</td><td>Nitta gelatine Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>Collageen verdunning buffer</td><td>Nitta gelatine Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>LNA miRNA inhibitor</td><td>EXIQON&nbsp;</td><td>miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B en doel miRNA)</td><td></td></tr><tr><td>synthetisch miRNA duplex</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>miScript miRNA Mimic</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Fenotypische plasticiteit van endotheliale cellen ten grondslag ligt aan cardiovasculaire systeemontwikkeling, cardiovasculaire aandoeningen en verschillende voorwaarden in verband met orgel fibrose. In deze voorwaarden verwerven gedifferentieerde endotheliale cellen mesenchymale-achtige fenotypen. Dit proces heet endotheel-mesenchymale overgang (EndMT) en wordt gekenmerkt door Downregulatie van endothelial markers, opregulatie van mesenchymale markeringen en morfologische veranderingen. EndMT wordt veroorzaakt door verschillende signaalroutes, met inbegrip van transformeren groeifactor (TGF)-β, Wnt en Notch, en gereglementeerd door in de moleculaire mechanismen die vergelijkbaar zijn met die van epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) belangrijk zijn voor gastrulatie, weefsel fibrose, en uitzaaiing van kanker. Inzicht in de mechanismen van EndMT is belangrijk voor het ontwikkelen van diagnostische en therapeutische methoden gericht op EndMT. Robuuste inductie van EndMT in vitro is nuttig om de gemeenschappelijke gen expressie handtekeningen karakteriseren, druggable moleculaire mechanismen te identificeren en scherm voor modulatoren van EndMT. Hier beschrijven we een in vitro -methode voor de inductie van EndMT. MS-1 muis alvleesklier microvasculaire endotheliale cellen ondergaan EndMT na langdurige blootstelling aan TGF-β en opregulatie van mesenchymale markeringen en morfologische veranderingen als inductie van meerdere inflammatoire chemokines en cytokines tonen. Methoden voor de analyse van microRNA (miRNA) modulatie zijn ook opgenomen. Deze methoden bieden een platform voor het onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan de EndMT en de bijdrage van miRNAs aan EndMT.

TGF-β is een potente inductor van EndMT in verschillende endotheliale cellen. Na 24 h behandeling met TGF-β in MS-1 cellen toont kleuring voor F-actine reorganisatie van actine stress vezels (figuur 1A)20. Voorbehandeling met een ROCK-remmer Y-27632 remt de inductie van actine reorganisatie20. MS-1 endotheliale cellen veranderen van een klassieke geplaveide-achtige morfologie naar een mesenchymale spindel-vormig...

Een protocol voor in vitro inductie van endotheel-mesenchymale overgang (EndMT), die nuttig is voor het onderzoeken van cellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij EndMT, wordt beschreven. In dit experimenteel model wordt EndMT veroorzaakt door behandeling met TGF-β in MS-1 endotheliale cellen.

Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vaat- en kankerbiologie, zoals mechanismen van endotheliale plasticiteit in verschillende pathologische aandoeningen, inclusief kanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat robuuste inductie van in vitro EndMT wordt bereikt door behandeling met TGF-in MS-1 endotheelcellen. Kweek eerst de MS-1 cellen in standaard kweekomstandigheden en vermijd dat de cultuur confluent wordt.Vervolgens, op een 10 cm schaal, was de MS-1 cellen met 1x fosfaat-gebufferd zoutoplossing. Voeg dan 1 mL trypsine toe aan de plaat en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg dan 9 mL kweekmedium toe aan de trypsineerde cellen om loslating te bewerkstelligen.Verzamel vervolgens de trypsineerde celsuspensie in een 15 mL buisje. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 tot 400 x G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een automatische celteller om het aantal levensvatbare cellen te tellen.Plaat vervolgens de MS-1 cellen op ongecoate standaard kweekplaten voor langdurige kweek. Stimuleer na 24 uur de endotheelcellen met een eindconcentratie van 1 ng per milliliter van TGF-2. Inc

molecular-analysis-endothelial-mesenchymal-transition-induced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige werkwijze beschreven voor de inductie van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) in verschillende celtypen. Methoden voor de analyse van cellen in EMT toestanden met immunocytochemie inbegrepen.

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Hier beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van een gelcontractie-assay voor het evalueren van contractiele functie in mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang hebben ondergaan.

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Dit manuscript beschrijft een buisvormingstest om de effecten van een bepaalde verbinding of omstandigheid op angiogenesis te kwantificeren door gebruik te maken van de vorming van endotheelcellen in een gecontroleerde omgeving.

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

We presenteren hier een celkweek werkwijze voor het induceren mesenchymale-epitheliale overgangen (MET) sarcoom cellen op basis van gecombineerde ectopische expressie van microRNA-200 familieleden en grainyhead-achtig 2 (GRHL2). Deze methode is geschikt voor een beter begrip van de biologische gevolgen van de fenotypische plasticiteit in de agressiviteit van kanker en behandelingen.

Inductie van mesenchymale-epitheliale Transities sarcoomcellen

miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.

Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese

We beschrijven een systematische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door de eiwit- en genexpressie te bestuderen die betrokken zijn bij deze signaleringsroute. De methoden omvatten western blotting, een luciferase reporter assay, qPCR, en immunofluorescentie vlekken.

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

We beschrijven methoden om TGF-β2-geïnduceerde EndMT in endotheelcellen te onderzoeken door celmorfologieveranderingen te observeren en de expressie EndMT-gerelateerde markerveranderingen te onderzoeken met behulp van immunofluorescentiekleuring. CRISPR/Cas9 genbewerking werd beschreven en gebruikt om het gen dat codeert voor Snail uit te putten om zijn rol in TGF-β2-geïnduceerde EndMT te onderzoeken.

TGF-β-gemedieerde Endotheel naar Mesenchymal Transition (EndMT) en de functionele beoordeling van EndMT-effectoren met crispr/cas9 genbewerking

Hier stellen we een protocol op om tegelijkertijd meerdere SMAD-complexen te visualiseren en te analyseren met behulp van proximity ligation assay (PLA) in endotheelcellen die worden blootgesteld aan pathologische en fysiologische vloeistofafschuifstressomstandigheden.

Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Dit werk presenteert een diermodel van endotheliale-naar-mesenchymale overgangsgeïnduceerde fibrose, zoals te zien is bij aangeboren hartafwijkingen zoals kritieke aortastenose of hypoplastisch linkerhartsyndroom, wat gedetailleerde histologische weefselevaluatie, de identificatie van regulerende signaalroutes en het testen van behandelingsopties mogelijk maakt.

Een neonataal heterotopisch rattenharttransplantatiemodel voor de studie van endotheel-naar-mesenchymale overgang

Het huidige protocol maakt het herstel mogelijk van buisachtige structuren die zijn gevormd in de klassieke in vitro angiogenese-buisvormingstest waarbij cellen, zoals trofoblastcellen, zich organiseren in capillaire structuren over een laag extracellulaire basaalmembraanmatrix. De teruggevonden structuren worden gebruikt voor RNA- en eiwitisolatie voor verschillende biochemische analyses.

Trofoblastcelherstel van angiogenese-buisvormingstest voor analyse van differentiatiemarkerexpressie

Leer een betrouwbare methode voor endotheel-mesenchymale overgang in MS-1-cellen met TGF-β2. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar celplasticiteit en microRNA-functie in vasculaire biologie.

Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Meer video's verkennen