Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vaat- en kankerbiologie, zoals mechanismen van endotheliale plasticiteit in verschillende pathologische aandoeningen, inclusief kanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat robuuste inductie van in vitro EndMT wordt bereikt door behandeling met TGF-in MS-1 endotheelcellen. Kweek eerst de MS-1 cellen in standaard kweekomstandigheden en vermijd dat de cultuur confluent wordt.

Vervolgens, op een 10 cm schaal, was de MS-1 cellen met 1x fosfaat-gebufferd zoutoplossing. Voeg dan 1 mL trypsine toe aan de plaat en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg dan 9 mL kweekmedium toe aan de trypsineerde cellen om loslating te bewerkstelligen.

Verzamel vervolgens de trypsineerde celsuspensie in een 15 mL buisje. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 tot 400 x G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een automatische celteller om het aantal levensvatbare cellen te tellen.

Plaat vervolgens de MS-1 cellen op ongecoate standaard kweekplaten voor langdurige kweek. Stimuleer na 24 uur de endotheelcellen met een eindconcentratie van 1 ng per milliliter van TGF-2. Incubeer vervolgens de kweekplaat bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Na 48 uur behandeling, vervang het medium door vers, voorverwarmd kweekmedium dat TGF-2 bevat. Voor de downstream analyse, plaats de MS-1 cellen op een 8-well kweekkamerplaat die vooraf bedekt is met gelatine. Voeg na 24 uur 10 M van ROCK-remmer toe aan de celkweek. Na een uur, stimuleer de endotheelcellen met een eindconcentratie van 1 ng per milliliter van TGF-2.

Incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius. Voor een 72 uur durende kweek, vervang het oude medium na 48 uur door vers TGF-2-bevattend medium. Na een hele dag TGF-behandeling, verwijder het medium.

Fixeer vervolgens de cellen met 4% paraformaldehyd en fosfaat-gebufferd zoutoplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na het fixeren, spoel de cellen met fosfaat-gebufferd zoutoplossing. Incubeer vervolgens de cellen met 0,2% Triton X-100 gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Na vijf minuten, spoel de cellen opnieuw drie keer met 1x fosfaat-gebufferd zoutoplossing. Na drie wasbeurten, incubeer de cellen met verdunde fluorescente ftalotoxine bevattende blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na de incubatie, was de cellen drie keer met 1x fosfaat-gebufferd zoutoplossing.

Vervolgens kleuren de celkernen met cyanine nucleïnezuurbindend kleurmiddel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na vijf minuten, spoel de schaal en plaats een dekglas op de schaal met behulp van schaalmontagemedium. Observeer de cellen onder een confocale microscoop.

De cellen vertonen reorganisatie van de dikke stressvezels na TGF-2 behandeling. Dit geeft de potentie van TGF-2 aan om EndMT in endotheelcellen te induceren. Na 72 uur TGF-2 behandeling, gooi het medium weg en fixeer de cellen met 0,5 tot 1 ml van 50% koude methanol en 50% aceton gedurende vijf minuten.

Spoel vervolgens de cellen drie keer met 1x fosfaat-gebufferd zoutoplossing. Nadat de drie wasbeurten voltooid zijn, incubeer de cellen met primaire antilichamen in blokkeerbuffer gedurende een nacht bij 4 graden Celsius, in het donker. De volgende dag, was de cellen weer drie keer met 1x fosfaat-gebufferd zoutoplossing.

Incubeer vervolgens de cellen met groen geconjugeerd secundair antilichaam tegen VE-cadherin in blokkeerbuffer, gedurende een uur in het donker. Was opnieuw de cellen drie keer met 1x fosfaat-gebufferd zoutoplossing. Vervolgens kleuren de celkernen met cyanine nucleïnezuurbindend kleurmiddel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Na vijf minuten, spoel de schaal en plaats een dekglas op de schaal met behulp van schaalmontagemedium. Observeer vervolgens de cellen onder een confocale microscoop. De cellen vertonen verminderde expressie van VE-cadherin en verhoogde gladde spieractine expressie na TGF-2 behandeling gedurende 48 tot 72 uur.

Voor de collageen gelcontractietest, kweek de MS-1 cellen in aanwezigheid en afwezigheid van TGF-2 gedurende 72 uur. Bereid vervolgens het type 1 collageen gel op ijs. Meng vervolgens 800 l van de collageen geloplossing met 200 mL van de controle, of met TGF-2 behandelde endotheelcellen.

Voeg vervolgens 1 mL van dit mengsel toe aan elke put van een 12-well kweekplaat. Laat het gel stollen bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten. Na het stollen van het gel, voeg 1 mL MEM Alpha toe, bevattend 10% foetaal kalfsserum, 50 eenheden per milliliter penicilline en 50 g per milliliter streptomycine, om het gel te laten drijven.

Los vervolgens het gel los van de wand van de put en incubeer het drijvende gel bij 37 graden Celsius gedurende 48 uur. Na 48 uur incubatie, scan de beelden van het gel vanaf de bodem van de plaat met behulp van een scanner. Duidelijke morfologische veranderingen zijn zichtbaar, waarbij de cellen van de straatstenen naar de mesenchymale spindelvormige architectuur veranderen als gevolg van blootstelling aan TGF-2 behandeling gedurende 72 uur.

Interessant genoeg, toont TGF beta 2 behandeling gedurende 48 tot 72 uur een toename in zowel de mRNA- als de proteïne expressieniveaus van gladde spieractine in de MS-1 cellen. De gelcontractietest toont ook aan dat bij TGF-2 behandeling, het collageen type 1 gel significant contracteert. Interessant is dat onthouding van TGF-2 de gladde spieractine tot basale niveau verlaagt en de cellen de straatstenen morfologie hervatten, wat aangeeft dat EndMT een dynamisch proces is.

In feite, het remmen van micro RNA 31 door LNA micro RNA