Name: Elektrochemische detectie van Deuterium kinetisch-isotoopeffect op extracellulaire elektronentransport in Shewanella oneidensis heer-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Ontdek elektrochemische detectie van het deuterium kinetisch-isotoopeffect bij extracellulaire elektronentransport in levende Shewanella oneidensis MR-1 cellen. Deze methode onthult de rol van protontransport in bacteriële elektronoverdracht.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door een Grant-in-Aid voor speciaal bevorderd onderzoek van de vereniging van Japan voor promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHI Grant nummer 24000010, 17H 04969, en JP17J02602, de ons kantoor van Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. is een JSPS Research Fellow en ondersteund door JSPS via het programma voor toonaangevende gediplomeerde scholen (MERIT).

1. de vorming van een Biofilm Monolayer van S. oneidensis heer-1 op een ITO elektrode (Figuur 1)
Opmerking: Om te voorkomen dat de besmetting van de elektrochemische reactor met andere microben, alle media, werktuigen, en onderdelen van de elektrochemische reactor moeten worden gesteriliseerd bij voorbaat. Wanneer cuvetten van S. oneidensis heer-1 en de bouw van de elektrochemische reactoren, alle procedures moeten worden uitgevoerd op een schone bankje.
<ol><li>Teelt van S. oneidensis heer-1 cellen Opmerking: Een enkelgelaagde biofilm van S. oneidensis heer-1 ontstond op een ITO elektrode de volgendevoorwaarden gemeld eerder4.<ol>
<li>Toevoegen om te groeien S. oneidensis heer-1 cellen, een kolonie van S. oneidensis heer-1 geteeld op een bestaande uit Luria Bertani (LB) (20 g/L) en bacto agar (15 g/L) in 15 mL van LB medium (20 g/L) bij 30 ° C gedurende 24 uur in aërobe omstandigheden met schudden bij 160 rpm agarplaat.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 6.000 × g gedurende 10 min, en resuspendeer de pellet van de resulterende cel in 15 mL beschreven medium (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0.08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L], en 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic zuur [HEPES; 7.2 g/L]), aangevuld met 10 mM lactaat en 0,5 g/L gistextract als de bron van koolstof, en sporenelementen voor S. oneidensis heer-1 , respectievelijk.</li>
		<li>Verder cultiveren van de celsuspensie aëroob bij 30 ° C gedurende 12 h met schudden bij 160 t/min en Centrifugeer nogmaals bij 6.000 × g voor 10 min. Wash de resulterende cel pellet tweemaal met DM medium door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 6.000 × g vóór de elektrochemische experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouw van een drie-elektrode elektrochemische reactor (Figuur 1)<ol>
<li>Zet een ITO substraat als de werkende elektrode aan de onderkant van de reactor.</li>
		<li>Een glazen cilinder (diameter van 2 cm) en een cover van polytetrafluorethyleen (PTFE) vervolgens invoegen. Vervolgens invoegen Ag/AgCl (KCl verzadigd) en een platina-draad in de reactor als de referentie- en teller elektroden, respectievelijk. Opmerking: Om te voorkomen dat de lekkage van lucht en oplossing, plaatst u een vel butyl rubber tussen elk onderdeel.</li>
		<li>Voeg 4,0 mL DM aangevuld met 10 mM lactaat en 0,5 g/L gistextract in de elektrochemische reactor.</li>
		<li>Nadat u hebt bevestigd dat er geen lekkage van de elektrochemische reactor is, vloeien de stikstofgas in de elektrochemische reactor meer dan 20 min anaërobe voorwaarden binnen de elektrochemische reactor te handhaven. Opmerking: Om te voorkomen dat besmetting met andere microben, het gas moet worden gefilterd voordat hij mondt uit in de elektrochemische reactor.</li>
		<li>De elektrochemische reactor verbinden met een potentiostaat en toepassing van de +0.4 V (ten opzichte van de standaard-waterstofelektrode, ze) naar de ITO-elektrode, houden de temperatuur van de elektrochemische reactor bij 30 ° C met behulp van een externe watersysteem in het verkeer. Opmerking: Om te voorkomen dat het effect van een extern elektrisch veld, de elektrochemische reactor moet worden geplaatst in een kooi van Faraday.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektrochemische teelt van S. oneidensis heer-1 cellen (Figuur 1 en Figuur 2)<ol>
<li>Aanpassen van de celdichtheid van de schorsing verkregen in stap 1.1 aan een optische dichtheid van 1,43 op 600 nm (OD600) met DM aangevuld met 10 mM lactaat en 0,5 g/L gist extract. Opmerking: Voor het verkrijgen van de juiste OD600, toepassen op de celsuspensie van OD600 ≤ 0.8 een UV-vis-spectrometer voorafgaand aan de aanpassing van de OD600 tot 1,43.</li>
		<li>Voeg 0.3 mL van de celsuspensie in de elektrochemische reactor via de poort van de injectie met behulp van een injectiespuit: de OD600 in de reactor verandert tot 0,1. Opmerking: De toevoeging van 0,3 mL celsuspensie met OD600 = 1,43 in elektrochemische reactor met 4,0 mL middellange resultaten in 4.3 mL van oplossing met een OD600 = 0,1. Als u andere reactoren met verschillende volumes, is de berekening van de celdichtheid vereist.</li>
		<li>De potentiële toepassing op +0.4 V (in tegenstelling tot zij) naar de ITO-elektrode voor 25 h worden voortgezet. Opmerking: Voor de vorming van een biofilm enkelgelaagde op een ITO-elektrode, zorgen dat de geproduceerde stroom een afwijking van minder dan 50% uit Figuur 2 vertoont.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vervanging van het supernatans dat met verse DM Medium met 10 mM lactaat (Figuur 3)
<ol><li>De potentiële toepassing stoppen en de elektrochemische reactor verbreken met de potentiostaat en het watersysteem van de omloop.</li>
	<li>Vervanging van het supernatans dat met verse DM medium met 10 mM lactaat<ol>
<li>Stroom het stikstofgas in een fles met DM met 10 mM lactaat meer dan 20 min om zuurstof van het medium.</li>
		<li>Verwijder alle het supernatant binnen de elektrochemische reactor met behulp van een injectiespuit, onder stroomt langzaam stikstofgas (Figuur 3a, b). Opmerking: Om te voorkomen breken de biofilm op de ITO-elektrode door stikstofgas, moet het gas boven het vloeistofoppervlak stromen.</li>
		<li>Voeg 4,0 mL verse DM met 10 mM lactaat met behulp van een injectiespuit (Figuur 3 c). Opmerking: Om te voorkomen breken de biofilm op de ITO-elektrode, injecteren langzaam het medium langs de muur van de elektrochemische reactor. Om te houden de biofilm NAT, moet het medium worden toegevoegd onmiddellijk na de verwijdering van de bovendrijvende substantie. Injectie van de middellange upto 1 min na de verwijdering van supernatant beïnvloedt niet de huidige productie van de biofilm van S. oneidensis heer-1.</li>
		<li>Hellen de elektrochemische reactor om alle van het supernatans dat is gekoppeld aan de muur van de elektrochemische reactor te verwijderen.</li>
		<li>Herhaal de stappen 2.2.2-2.2.4 drie keer in totaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sluit de gasstroom en de elektrochemische reactor verbinden met de potentiostaat weer, +0.4 V (in tegenstelling tot zij) toe te passen op de elektrode ITO op 303 K.</li>
</ol>3. de toevoeging van Deuterium Water voor het meten van het KIE op het EET-proces (Figuur 4)
<ol><li>Bevestigen dat de huidige productie van een biofilm enkelgelaagde van S. oneidensis heer-1 stabiel is en niet snel toeneemt. Als de huidige steil stijgt, wachten totdat de huidige binnen een stijging van 5% meer dan 10 min stabiliseert. Opmerking: De vorming van een biofilm enkelgelaagde op een elektrode ITO zonder besmetting van andere microbiële stammen werd bevestigd door rDNA sequenties en een scanning elektronen microscopische opname van de biofilm op een ITO-elektrode, zoals gemeld eerder4. Bevestiging van de tarief-beperking door het proces van EET, worden gecontroleerd door het effect van het toevoegen van pendelen elektron bemiddelaars zoals 100 µM Anthrachinon-1-sulfonaat (α-AQS). Zie de sectie Vertegenwoordiger resultaten en verwijst naar15 voor verdere details.</li>
	<li>Voeg 40 µL van zuurstofvrije 50% (v/v) D2O in de elektrochemische reactor met behulp van een injectiespuit zodanig zijn dat de concentratie 0,5% (v/v) D2O in de reactor is. Opmerking: Om te voorkomen dat schade aan de biofilm door D2O toevoeging, injecteren de D2O drop-wise.</li>
	<li>Wacht tot de huidige te stabiliseren en de D2O alsnog tot 4,0% (v/v). Opmerking: Voor het verkrijgen van de KIE-waarde (de verhouding tussen de huidige productie in aanwezigheid van D2O en H2O), het effect van de dezelfde hoeveelheid H2O toevoeging op de huidige productie controleren.</li>
</ol>

<ol><li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Manganese+in+Anaerobic+Respiration+-+Environmental+Significance%2C+Physiology%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation.</a> Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).</li>
<li>Bretschger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+production+and+metal+oxide+reduction+by+Shewanella+oneidensis+MR-1+wild+type+and+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants.</a> Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).</li>
<li>Richter, H., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/EE/B816647A">Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer.</a> Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611004543">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li>
<li>Strycharz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/ee/c0ee00260g">Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400.</a> Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).</li>
<li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bug+juice%3A+harvesting+electricity+with+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).</li>
<li>Coursolle, D., Gralnick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+extracellular+respiratory+pathways+for+iron%28III%29+reduction+in+Shewanella+oneidensis+strain+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1.</a> Front. Microbiol. 3, (2012).</li>
<li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlehtml/2009/ee/b816445b">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).</li>
<li>McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+biofilm+imaging%2C+transport+and+metabolism+measurements+via+combined+nuclear+magnetic+resonance+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy.</a> ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).</li>
<li>Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+cytochromes+wire+electricity-producing+bacteria+to+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).</li>
<li>Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+Absorption+Spectra+and+Redox+Properties+of+C+Type+Cytochromes+in+Living+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).</li>
<li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration-Linked+Proton+Translocation+Coupled+to+Anaerobic+Reduction+of+Manganese%28IV%29+and+Iron%28III%29+in+Shewanella+putrefaciens+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1.</a> J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.light.t.u-tokyo.ac.jp/e/2015/12/10/sp2015-9/">Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation-limited+kinetic+model+for+microbial+extracellular+electron+transport+via+an+outer+membrane+cytochrome+C+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+and+physicobiology%22%5BJournal%5D)">Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex.</a> Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+Transport+in+the+Outer-Membrane+Flavocytochrome+Complex+Limits+the+Rate+of+Extracellular+Electron+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).</li>
<li>Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+Coupled+Electron+and+Proton+Transfer+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions.</a> Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).</li>
<li>Cleland, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+isotope+effects+to+determine+enzyme+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms.</a> J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).</li>
<li>Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catabolic+and+regulatory+systems+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+involved+in+electricity+generation+in+microbial+fuel+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells.</a> Front. Microbiol. 6, (2015).</li>
<li>Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+uses+and+perspectives+of+heavy+water+and+deuterated+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J+Physiol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds.</a> Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).</li>
<li>Xie, X. S., Zubarev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Low-Level+Deuterium+Enrichment+on+Bacterial+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth.</a> Plos One. 9 (7), e102071(2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+enhancement+of+bacterial+extracellular+electron+transport+involves+bound+flavin+semiquinones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).</li>
<li>Edwards, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Linked+Flavin+Sites+in+Extracellular+Decaheme+Proteins+Involved+in+Microbe-Mineral+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11677(2015).</li>
<li>Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468616318898">Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).</li>
<li>Guo, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+Cr%28VI%29+by+Escherichia+coli+BL21+in+the+presence+of+redox+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators.</a> Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).</li>
<li>Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0167701294900051">A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions.</a> J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).</li>
<li>Myers, C. R., Myers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+the+outer+membrane+cytochromes+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).</li>
<li>Lower, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Recognition+Force+Microscopy+Shows+that+Outer+Membrane+Cytochromes+OmcA+and+MtrC+Are+Expressed+on+the+Exterior+Surface+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).</li>
<li>Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la0204794">Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation.</a> Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).</li>
<li>McMillan, D. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+enzyme+orientation+and+electrode+topology+on+the+catalytic+activity+of+adsorbed+redox+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes.</a> Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).</li>
<li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li>
<li>McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+activity+reveals+direct+electron+transfer+in+methanotrophic+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia.</a> Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/celc.201402151/abstract">Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter.</a> Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavin+Redox+Bifurcation+as+a+Mechanism+for+Controlling+the+Direction+of+Electron+Flow+during+Extracellular+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpcc.6b00349">Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1.</a> J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).</li>
<li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/14/116475">Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates.</a> bioRxiv. , 116475(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onze geheel-cel elektrochemische bepaling heeft een aantal technische voordelen vergeleken met eiwit elektrochemie. Hoewel eiwitreiniging vereist de multi-step tijdrovende procedures, neemt onze geheel-cell, methode een dag van zelf-georganiseerde biofilm vorming na celkweek. Om te bereiken van een stabiele interactie tussen OM c- Cyts en de elektrode, moeten we alleen sterilisatie en reiniging van het oppervlak van de elektrode; het vereist geen wijziging van de elektrode voor het organiseren van de richting va...

Elektrochemische technieken te karakteriseren direct een redox-eiwit in een intact bacteriële cel onlangs naar voren zijn gekomen sinds de ontdekking van metaal-reducerende microbiële stammen, zoals S. oneidensis heer-1 of Geobacter sulfurreducens partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst, die hebben de buitenmembraan cytochroom c-type complexen (OM c-Cyts) blootgesteld aan de cel exterieur1,2,3,4,5. De OM- c- Cyts bemiddelen elektronentransport uit de luchtwegen keten aan vaste substraten gelegen extracellularly. Dit vervoer wordt hierna aangeduid als extracellulaire elektronentransport (EET)1,6 en is een kritiek proces voor opkomende biotechnologie, zoals microbiële brandstofcellen6. Daarom, om te begrijpen van de onderliggende EET-kinetiek en mechanismen, en haar link naar microbiële fysiologie, OM c -Cyts zijn onderzocht met behulp van geheel-cel elektrochemie4,7, gecombineerd met microscopie 8 , 9, spectroscopie10,11, en moleculaire biologie2,4. In tegenstelling, zijn methoden voor het onderzoeken van de effecten van het EET-geassocieerde catie vervoer, bijvoorbeeld protonen, op EET kinetiek in levende cellen nauwelijks vastgesteld, ondanks proton vervoer over bacteriële membranen hebben een cruciale rol signalering, homeostase en energie productie12,13,14. In de huidige studie, beschrijven we een techniek om de onderzoeken van het effect van het proton vervoer op EET kinetiek in de S. oneidensis heer-1 cel met behulp van geheel-cel Electrochemische metingen, waarvoor de identificatie van de snelheidslimieten stap in microbiële huidige productie15.
Een directe manier om de bijdrage van het proton vervoer op de bijbehorende EET is het deuterium kinetisch-isotoopeffect (KIE). De KIE is waarneembaar als de verandering in de elektronen overdracht kinetiek op de vervanging van protonen met deuterium ionen, die de impact van het proton vervoer op elektron overdracht kinetiek16aangeeft. De theorie van KIE zelf is goed opgezet Electrochemische metingen met gezuiverde enzymen17. Echter, aangezien huidige productie in S. oneidensis heer-1 wordt veroorzaakt door meerdere, divers, en schommelende processen18, niet één EET gewoon identificeren als de snelheidslimieten proces. Om te zien hoe de KIE op proton transportprocessen EET wordt gekoppeld, moeten we om te bevestigen dat de microbiële huidige productie wordt beperkt door elektronentransport via OM c- Cyts op de elektrode. Voor dit doel vervangen wij het supernatant oplossing met verse opslagmedium met een hoge concentratie van lactaat als een elektrondonor tegen de optimale pH en temperatuurvoorwaarden voor KIE meting; deze vervanging diende twee rollen: (1) het verbeterd het tarief van de upstream metabole processen ten opzichte van de EET, en (2) de cellen van het zwemmen in het supernatant vrijgelaten uit de biofilm enkelgelaagde van S. oneidensis heer-1 op de werkende elektrode (weggelaten indium tin-doped oxide (ITO) elektrode). De gepresenteerde gedetailleerd protocol is bedoeld om te helpen nieuwe beoefenaars handhaven en bevestigen dat het proces EET de tarief-bepalen stap is.

<table><tbody><tr><td>Glascilinder</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt, gebruikt als elektrochemische reactor</td></tr><tr><td>PTFE-afdekking en basis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt, gebruikt als afdekking en fundering van de elektrochemische reactor</td></tr><tr><td>Butylrubber</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt, ingebracht tussen elk onderdeel van elektrochemische reactor</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Gebruikt als injectiepoort van elektrochemische reactor</td></tr><tr><td>Indium tin-doped oxide (ITO) elektrode</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>Gebruikt als werkende elektrode, 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl KCl-verzadigde elektrode</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Gebruikt als referentie-elektrode, &Phi;0.30mm</td></tr><tr><td>Platinedraad</td><td>The Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>Gebruikt als tegenelektrode</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Bouillon, Miller</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>Medium voor precultivatie van S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Anthraquinone-1-sulfonaat (&alpha;-AQS)</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>Flavine mononucleotide (FMN)</td><td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Gebruikt voor gedefinieerd medium (DM)</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>Gebruikt voor DM</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>Gebruikt voor DM</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Gebruikt voor DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Gebruikt voor DM</td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethaansulfonzuur (HEPES)</td><td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>Gebruikt voor DM</td></tr><tr><td>Natriumlactaat oplossing</td><td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Gist Extract</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxide (D, 99,9%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>Additief voor kinetische isotoopeffectexperimenten</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Gebruikt voor precultivatie</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>Gebruikt voor precultivatie</td></tr><tr><td>Autoclaafmachine</td><td>TOMY SEIKO CO. LTD.</td><td>LSX-500</td><td>Gebruikt voor sterilisatie van de elektrochemische reactor en het medium</td></tr><tr><td>Schone werkbank</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Gebruikt om de verontreiniging van de elektrochemische reactor en het medium met andere microben te voorkomen</td></tr><tr><td>Centrifugescheider</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Rotatiesnelheid tot 6000&times;g is vereist</td></tr><tr><td>Stikstofgasgenerator</td><td>Puequ CO. LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>Stikstofgascilinder kan ook worden gebruikt in plaats van gasgenerator</td></tr><tr><td>UV-vis-spectrometer</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Gebruikt voor optimalisatie van celdichtheid</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Gebruikt voor biofilmvorming en kinetische isotoopeffectexperimenten</td></tr><tr><td>Thermische watercirculator</td><td>AS ONE</td><td>TR-1A</td><td>Gebruikt voor het handhaven van de temperatuur van elektrochemische reactor</td></tr><tr><td>Faraday-kooi</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Gebruikt voor elektrochemische experimenten</td></tr></tbody></table>

elektrochemische detectie van deuterium kinetisch-isotoopeffect op extracellulaire elektronentransport in shewanella oneidensis heer-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Directe elektrochemische detectie van c-type cytochroom complexen ingebed in de bacteriële buitenmembraan (buitenmembraan c-Typ cytochroom complexen; OM c- Cyts) heeft onlangs naar voren gekomen als een roman geheel-cel analysemethode te karakteriseren de bacteriële elektronentransport uit de luchtwegen keten aan de buitenkant van de cel, hierna aangeduid als de extracellulaire elektronentransport (EET). Terwijl het traject en de kinetiek van de stroom van elektronen tijdens de EET-reactie zijn onderzocht, is een elektrochemische geheel-cell, methode te onderzoeken van de effecten van het vervoer van de catie gekoppeld EET nog niet vastgesteld. In de huidige studie, een voorbeeld van een biochemische techniek te onderzoeken het deuterium kinetisch-isotoopeffect (KIE) op EET t/m OM c- Cyts met behulp van een model-microbe, Shewanella oneidensis heer-1, wordt beschreven. De KIE op het EET-proces kan worden verkregen als de EET t/m OM c- Cyts als de snelheidslimieten stap in de microbiële huidige productie fungeert. Te dien einde, vóór de toevoeging van D2O, werd de bovenstaande oplossing vervangen door verse medium met een voldoende hoeveelheid van de elektronendonor ter ondersteuning van het tempo van de upstream metabole reacties, en te verwijderen van de planktonische cellen van een uniform enkelgelaagde biofilm op de elektrode werken. Alternatieve methoden te bevestigen de snelheidslimieten-stap in microbiële huidige productie als EET t/m OM c- Cyts ook worden beschreven. Onze techniek van een geheel-cel elektrochemische assay voor het onderzoeken van proton vervoer kinetiek kan worden toegepast op andere microbiële stammen van electroactive.

Na 25 h van potentiële toepassing op +0.4 V (in tegenstelling tot ze) ontstond een enkelgelaagde biofilm op de elektrode van de werken van ITO glas, die eerder door een scanning elektronen microscopie of een confocale microscopie4werd bevestigd. De representatieve tijdsverloop van de huidige productie van de S. oneidensis heer-1 tijdens de vorming van een biofilm enkelgelaagde is afgebeeld in Figuur 2. Hoewel de huidige in elk...

Hier presenteren we een protocol van geheel-cel elektrochemische experimenten te bestuderen van de bijdrage van proton vervoer aan het tarief van extracellulaire elektronentransport via de buitenmembraan cytochromes complex in Shewanella oneidensis heer-1.

Elektrochemische detectie van Deuterium kinetisch-isotoopeffect op extracellulaire elektronentransport in Shewanella oneidensis heer-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Het algemene doel van dit protocol is om de bijdrage van protontransport te observeren aan de snelheid van bacteriële extracellulaire elektronentransport door de detectie van het deuteriumkinetische isotoopeffect. Onze methode onthult de impact van protontransport op de kinetiek van extracellulaire elektronentransport of EET van bacteriën naar een elektrode via outer membrane c-type cytochromes. Onze assay weerspiegelt het native protonmanagement in EET omdat we levende bacteriën gebruikten in plaats van gezuiverde enzymen.Onze uitdaging was echter om de storingen van andere cellulaire processen te verwijderen. Het deuteriumkinetische isotoopeffect, aangeduid als KIE, is een van de beste technieken om de bijdrage van protontransport aan het bijbehorende elektronentransportproces te onderzoeken. Om Shewanella MR-1 cellen te laten groeien, breng een kolonie van de cellen die op een agarplaat zijn gekweekt over in 15 milliliter LB-medium.Laat de cellen 24 uur groeien bij 30 graden Celsius in aërobe omstandigheden met schudden bij 160 tpm. Centrifugeer de celsuspensie bij 6.000 maal de zwaartekracht gedurende 10 minuten. Slaap de resulterende celpellet vervolgens op in 15 milliliter De

electrochemical-detection-deuterium-kinetic-isotope-effect-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Source: Tokunou, Y., et al, Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a whole-cell electrochemical method to assess how proton transfer affects extracellular electron transport (EET) in electroactive bacteria. By replacing protons with deuterons using deuterium oxide, the method measures changes in current to reveal a kinetic isotope effect, highlighting the role of...

Measuring the Kinetic Isotope Effect on Microbial Electron Transport Using Deuterium Oxide

Source: Tokunou, Y. et. al., Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the assembly and operation of an electrochemical reactor model designed to simulate biofilm formation on electrode surfaces. Controlled electrochemical stimulation promotes microbial adhesion, leading to the gradual development of a bacterial monolayer biofilm.

Developing a Bacterial Monolayer Biofilm Using an Electrochemical Reactor

Exosomen zijn microvesiculaire structuren die in biovloeistoffen worden aangetroffen en mogelijk belangrijke, voor ziekten discriminerende biomarkers dragen. Hier wordt een nieuwe methode gebruikt om specifiek exosomen te extraheren en het exosomale geladene snel te testen op zowel RNA/eiwitdoelen na de verstoring van exosomen met behulp van niet-uniforme elektrische cyclische vierkante golven.

Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm)

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Dit artikel presenteert een methode voor het kweken van een biofilm voor in situ secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie voor toewijzing van de chemische in haar gehydrateerd staat, ingeschakeld door een microfluidic-reactor, systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm-Interface. De heer Shewanella oneidensis -1 met groene fluorescentie eiwit werd gebruikt als een model.

In Situ Karakterisatie van Shewanella oneidensis MR1 Biofilms door SALVI en ToF-SIMS

Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

On-site microbiële verrijking of in situ -teelttechnieken kunnen het vergemakkelijken van het isolement van de microbiële taxa moeilijk-aan-cultuur, vooral uit laag-biomassa of geochemically extreme omgevingen. Hier beschrijven we een elektrochemische opstelling zonder gebruik te maken van een externe krachtbron te verrijken van microbiële stammen die kunnen extracellulaire elektronentransport (EET).

Zichzelf staande elektrochemische Set-up te verrijken Anode-respiring bacteriën ter plaatse

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van gemedieerde extracellulaire elektronenoverdracht (EET) in melkzuurbacteriën met behulp van een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers. We illustreren deze methode met Lactiplantibacillus plantarum en de redoxmediator 1,4-dihydroxy-2-naftoïnezuur en geven een grondige beschrijving van de elektrochemische technieken die worden gebruikt om gemedieerde EET te evalueren.

Karakterisering van gemedieerde extracellulaire elektronenoverdracht in melkzuurbacteriën met een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van organische elektrochemische transistors (OECT's) om extracellulaire elektronenoverdracht (EET) activiteit in Shewanella oneidensis te vertalen in elektrische signalen. Het hybride OECT-systeem biedt verbeterde robuustheid, gevoeligheid en potentieel voor snelle tests met hoge doorvoer, waardoor het een effectief hulpmiddel is voor EET-metingen.

Vertalen van extracellulaire elektronenoverdrachtsactiviteiten met organische elektrochemische transistors

Ontdek elektrochemische detectie van het deuterium kinetisch-isotoopeffect bij extracellulaire elektronentransport in levende Shewanella oneidensis MR-1 cellen. Deze methode onthult de rol van protontransport in bacteriële elektronoverdracht.

Elektrochemische detectie van Deuterium kinetisch-isotoopeffect op extracellulaire elektronentransport in Shewanella oneidensis heer-1 (Video) | JoVE Journal

Elektrochemische detectie van Deuterium kinetisch-isotoopeffect op extracellulaire elektronentransport in Shewanella oneidensis heer-1

Meer video's verkennen