Twee methoden voor Decellularization van plantaardige weefsels voor Tissue Engineering toepassingen
31 mei 2018
Hier presenteren we en contrast twee protocollen gebruikt om te decellularize van plantaardige weefsels: een wasmiddel gebaseerde aanpak en een wasmiddel-vrije benadering. Beide methoden zijn achterlaten van de extracellulaire matrix van de weefsels van de plant gebruikt, die vervolgens kan worden gebruikt als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.
Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het biomaterialenveld, zoals de ontwikkeling van een scaffold met uitstekende vloeistofoverdrachtscapaciteiten met geavanceerde ultrastructuren en schaalbare productie. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze kunnen worden toegepast op de meeste planten voor stamcellen zonder dat er speciaal materiaal nodig is. Verzamel eerst verse of bevroren monsters van F.hispida-bladeren.
Bewaar eventueel overgebleven vers monster op min 20 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Laat het blad in gedeïoniseerd water van 20 tot 25 graden Celsius ondergedompeld. Gebruik een schone biopsie-punch om het blad in schijven van acht millimeter doorsnede te snijden.
Vervolgens, om de bladmonsters te wassen, incubeer ze op een schudplaat met lage snelheid gedurende vijf tot tien minuten, ondergedompeld in gedeïoniseerd water. Bereid vervolgens 10% gewicht per volume van SDS in gedeïoniseerd water. Na het bereiden van de SDS-oplossing, plaats de bladmonsters op een plastic schaal.
Voeg vervolgens de SDS-oplossing toe om de monsters volledig te bedekken. Plaats de ondergedompeld SDS-bladmonsters, bedekt, op een schudplaat om verdamping te voorkomen. Incubeer vervolgens het bladmonster bij kamertemperatuur gedurende vijf dagen.
Na vijf dagen incubatie, vervang de SDS-oplossing door gedeïoniseerd water. Incubeer de monsters die in gedeïoniseerd water zijn geweekt gedurende 10 tot 15 minuten op een schudplaat. Meng vervolgens vijf milliliter niet-ionisch oppervlakte-actief middel met 50 milliliter bleekmiddel.
Voeg dit mengsel toe aan 445 milliliter gedeïoniseerd water. Dompel vervolgens de monsters onder in de vers bereide niet-ionische oppervlakte-actieve stof-bleekmiddeloplossing. Blijf de niet-ionische oppervlakte-actieve stof-bleekmiddeloplossing om de 24 uur verversen totdat de monsters helder zijn.
Laat vervolgens de heldere monsters gedurende twee minuten ondergedompeld in gedeïoniseerd water op een schudplaat. Voor detergentvrije decellularisatie, bereid vijf procent volume per volume bleekmiddel in 3% gewicht per volume natriumbicarbonaat oplossing. Verwarm vervolgens de oplossing tot 60 tot 70 graden Celsius op een hot plate binnen een afzuigkap.
Zodra de oplossing de gewenste temperatuur bereikt, week de bladmonsters. Vervolgens verlaag de snelheid van de roerplaat om schade aan de monsters te voorkomen en zoek naar de zichtbaar heldere monsters en draag ze voorzichtig over uit het bad. Eindelijk, incubeer de monsters in gedeïoniseerd water gedurende één tot twee minuten.
Aangezien alle monsters intrinsiek verschillend zijn, wordt aanbevolen om de voortgang van de decellularisatie ongeveer elke 15 minuten te controleren om ervoor te zorgen dat de monsters niet worden beschadigd. MTM-, SAF- en UTS-parameters worden eerst bestudeerd om de unieke decellulariseerde scaffold-eigenschappen van zowel P.aquatica als F.hispida soorten te onderzoeken. In feite vertonen alle drie de parameters vergelijkbare mechanische eigenschappen bij gebruik van zowel de detergent-gebaseerde als de detergent-vrije decellularisatiemethoden.
Echter, de UTS-mechanische eigenschap van F.hispida vertoont een significant hogere gemiddelde waarde bij gebruik van SDS in plaats van bleekmiddel voor decellularisatie. Het genomische DNA-gehalte van de onderzochte ontdekte plantensoorten is ook significant verminderd na decellularisatie in vergelijking met de niet-decellulariseerde monsters. Vervolgens wordt ook de metabolische activiteit van humane dermale thyroblasten gemeten in aanwezigheid van decellulariseerde P.aquatica of Garcinia-scaffolds.
Interessant genoeg veroorzaakten op detergent-vrije basis gebaseerde scaffolds een verminderde invloed op de cellulaire metabolische activiteit, maar het wassen met Trishydrochloorbuffer, gevolgd door serumvrij medium na SDS-clearing, vermindert de invloed op de cellulaire metabolische activiteit in vergelijking met het wassen met alleen gedeïoniseerd water. Ten slotte wordt de groei van de mesenchymale stamcellen, gekleurd met calciene, op het oppervlak van de F.hispida-bladstructuur hier getoond. Eenmaal beheerst, kunnen deze technieken worden voltooid in ongeveer zeven dagen tot slechts 15 minuten wanneer ze correct worden uitgevoerd.
Wanneer u deze procedures uitvoert, is het belangrijk om de monsters te controleren tijdens het decellularisatieproces, omdat de monsters van batch tot batch kunnen variëren, wat kan resulteren in verschillende clearing-tijden. Na dit proces kunnen andere methoden zoals dequantificatie of mechanische testen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals in welke mate de monsters zijn gecleared en op welke andere weefsels de monsters mechanisch vergelijkbaar zijn. Na de ontwikkeling ervan heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van weefselengineering om perfusabele scaffolds te fabriceren.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u plantenweefsel kunt decellulariseren voor gebruik als scaffolds. Vergeet niet dat het werken met detergenten en bleekmiddeldampen gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van geschikte beschermende uitrusting en het gebruik van een afzuigkap moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert en vergelijkt twee protocollen voor het decellulariseren van plantenweefsels: een methode op basis van detergentia en een detergent-vrije methode. Beide methoden behouden de extracellulaire matrix, die kan dienen als scaffold voor toepassingen in tissue engineering.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Biomaterialen
- Tissue Engineering
- Plantbiologie
Achtergrond
- Decellularisatietechnieken zijn cruciaal voor het creëren van scaffolds.
- Scaffolds kunnen de capaciteiten voor vloeistofoverdracht verbeteren.
- Methoden kunnen worden toegepast op diverse plantenstamweefsels.
- Voor deze technieken is geen gespecialiseerde apparatuur vereist.
Doel van de studie
- Om detergent-gebaseerde en detergent-vrije decellularisatiemethoden te vergelijken.
- Om het potentieel van extracellulaire matrices van planten als scaffolds te evalueren.
- Om uitdagingen bij de ontwikkeling van scaffolds voor tissue engineering aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van verse of bevroren bladsamples van F.hispida.
- Bewaren van monsters bij -20 °C.
- Onderdompelen van bladeren in gedeïoniseerd water bij 20 tot 25 °C.
- Uitstansen van schijfjes met een diameter van 8 mm uit de bladeren met behulp van een biopsietang.
Belangrijkste resultaten
- Beide decellularisatiemethoden bewaren de extracellulaire matrix effectief.
- De gecreëerde scaffolds kunnen worden gebruikt in diverse weefselkweektoepassingen.
- De vloeistoftransportcapaciteiten van de scaffolds werden verbeterd.
- De methoden zijn schaalbaar en toepasbaar op de meeste plantensoorten.
Conclusies
- Decellularisatietechnieken leveren levensvatbare scaffolds voor tissue engineering.
- Beide methoden hebben specifieke voordelen en kunnen worden gekozen op basis van specifieke behoeften.
- Toekomstig onderzoek kan aanvullende toepassingen van scaffolds afgeleid van planten verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Van planten afgeleide scaffolds pakken kritieke biomateriaaluitdagingen in tissue engineering aan door schaalbare, biocompatibele alternatieven te bieden voor autologe, synthetische en dierlijke grafts. De beschreven decellularisatiemethoden maken een reproduceerbare productie van scaffolds mogelijk met een behouden architectuur van de extracellulaire matrix, wat vloeistofoverdracht en mechanische functionaliteit ondersteunt die essentieel zijn voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit positioneert plant-gebaseerde systemen als een strategische optie voor het verminderen van risico's bij de vroege ontwikkeling van scaffolds in preklinische pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de bijdragen van de extracellulaire matrix aan de biocompatibiliteit en mechanische integriteit van het steunstructuur (scaffold) te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde workflows voor de preparatie van plantenweefsels die op verschillende soorten toepasbaar zijn zonder gespecialiseerde apparatuur.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert scaffolds op met kwantificeerbare mechanische eigenschappen (UTS, MTM, SAF) voor vergelijkende screening van biomaterialen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de productie van assay-ready scaffolds met een geringe impact op het cellulaire metabolisme, waardoor reproduceerbare experimenten voor celzaaien mogelijk worden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de evaluatie van menselijke celresponsen (bijv. dermale thyroblasten, mesenchymale stamcellen) op matrices van plantaardige oorsprong.
- Operationele waarde: Biedt flexibiliteit door een dubbele methode (op basis van detergentia versus detergentievrij) om de eigenschappen van het scaffold te optimaliseren voor specifieke einddoelen in tissue engineering.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze decellularisatiemethoden integreren in het ontdekkingscontinuüm door preparatieve scaffolds te leveren voor celgebaseerde assays, wat de overgang van biomateriaalscreening naar preklinische validatie in tissue engineering-workflows ondersteunt.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten mogelijk met betrekking tot de geschiktheid van de extracellulaire matrix van planten als basis voor scaffolds.
- Screening: Levert reproduceerbare scaffolds met meetbare mechanische en biologische resultaten voor comparatieve evaluatie.
- Analytics: Genereert kwantificeerbare gegevens (reductie van genomisch DNA, metabole activiteit, UTS) ter informatie voor de selectiecriteria van scaffolds.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van de ontdekking van biomaterialen tot preklinisch testen via gestandaardiseerde scaffoldproductie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een platformonafhankelijk protocol dat aanpasbaar is aan meerdere plantensoorten, waardoor de efficiëntie van middelen over projecten heen wordt verbeterd.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de prestaties van het scaffold door cellulaire bijdragen te ontkoppelen van die van de extracellulaire matrix.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde incubatietijden, oplossingsconcentraties en wasstappen.
- Strategische waarde: Verlaagt ontwikkelingsbarrières door de noodzaak voor gespecialiseerde apparatuur weg te nemen, wat een bredere adoptie in laboratoria mogelijk maakt.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door scaffolds te leveren met instelbare eigenschappen (bijv. UTS-modulatie via SDS versus bleekmiddel).
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met biomaterialen en het monitoren van decellularisatie om overbewerkingsprocessen te voorkomen.
- Vereist toegang tot standaard laboratoriumapparatuur (schudplaat, warmteplaat, zuurkast, biopsietang) en reagentia (SDS, bleekmiddel, natriumbicarbonaat).
- Vraagt om cross-team standaardisatie van de beoordeling van het eindpunt van de klaring (bijv. timing van visuele inspectie) om batchconsistentie te waarborgen.
- Vereist aanpassing van de incubatieduren op basis van de plantensoort en weefseldikte, zoals opgemerkt in observaties van monster-variabiliteit.
- Houdt rekening met veiligheidsmaatregelen bij het hanteren van detergentia en bleekmiddel, inclusief het gebruik van PBM en het werken in een zuurkast tijdens verhittingsstappen.
