Twee methoden voor Decellularization van plantaardige weefsels voor Tissue Engineering toepassingen
May 31st, 2018
Hier presenteren we en contrast twee protocollen gebruikt om te decellularize van plantaardige weefsels: een wasmiddel gebaseerde aanpak en een wasmiddel-vrije benadering. Beide methoden zijn achterlaten van de extracellulaire matrix van de weefsels van de plant gebruikt, die vervolgens kan worden gebruikt als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.
Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het biomaterialenveld, zoals de ontwikkeling van een scaffold met uitstekende vloeistofoverdrachtscapaciteiten met geavanceerde ultrastructuren en schaalbare productie. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze kunnen worden toegepast op de meeste planten voor stamcellen zonder dat er speciaal materiaal nodig is. Verzamel eerst verse of bevroren monsters van F.hispida-bladeren.
Bewaar eventueel overgebleven vers monster op min 20 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Laat het blad in gedeïoniseerd water van 20 tot 25 graden Celsius ondergedompeld. Gebruik een schone biopsie-punch om het blad in schijven van acht millimeter doorsnede te snijden.
Vervolgens, om de bladmonsters te wassen, incubeer ze op een schudplaat met lage snelheid gedurende vijf tot tien minuten, ondergedompeld in gedeïoniseerd water. Bereid vervolgens 10% gewicht per volume van SDS in gedeïoniseerd water. Na het bereiden van de SDS-oplossing, plaats de bladmonsters op een plastic schaal.
Voeg vervolgens de SDS-oplossing toe om de monsters volledig te bedekken. Plaats de ondergedompeld SDS-bladmonsters, bedekt, op een schudplaat om verdamping te voorkomen. Incubeer vervolgens het bladmonster bij kamertemperatuur gedurende vijf dagen.
Na vijf dagen incubatie, vervang de SDS-oplossing door gedeïoniseerd water. Incubeer de monsters die in gedeïoniseerd water zijn geweekt gedurende 10 tot 15 minuten op een schudplaat. Meng vervolgens vijf milliliter niet-ionisch oppervlakte-actief middel met 50 milliliter bleekmiddel.
Voeg dit mengsel toe aan 445 milliliter gedeïoniseerd water. Dompel vervolgens de monsters onder in de vers bereide niet-ionische oppervlakte-actieve stof-bleekmiddeloplossing. Blijf de niet-ionische oppervlakte-actieve stof-bleekmiddeloplossing om de 24 uur verversen totdat de monsters helder zijn.
Laat vervolgens de heldere monsters gedurende twee minuten ondergedompeld in gedeïoniseerd water op een schudplaat. Voor detergentvrije decellularisatie, bereid vijf procent volume per volume bleekmiddel in 3% gewicht per volume natriumbicarbonaat oplossing. Verwarm vervolgens de oplossing tot 60 tot 70 graden Celsius op een hot plate binnen een afzuigkap.
Zodra de oplossing de gewenste temperatuur bereikt, week de bladmonsters. Vervolgens verlaag de snelheid van de roerplaat om schade aan de monsters te voorkomen en zoek naar de zichtbaar heldere monsters en draag ze voorzichtig over uit het bad. Eindelijk, incubeer de monsters in gedeïoniseerd water gedurende één tot twee minuten.
Aangezien alle monsters intrinsiek verschillend zijn, wordt aanbevolen om de voortgang van de decellularisatie ongeveer elke 15 minuten te controleren om ervoor te zorgen dat de monsters niet worden beschadigd. MTM-, SAF- en UTS-parameters worden eerst bestudeerd om de unieke decellulariseerde scaffold-eigenschappen van zowel P.aquatica als F.hispida soorten te onderzoeken. In feite vertonen alle drie de parameters vergelijkbare mechanische eigenschappen bij gebruik van zowel de detergent-gebaseerde als de detergent-vrije decellularisatiemethoden.
Echter, de UTS-mechanische eigenschap van F.hispida vertoont een significant hogere gemiddelde waarde bij gebruik van SDS in plaats van bleekmiddel voor decellularisatie. Het genomische DNA-gehalte van de onderzochte ontdekte plantensoorten is ook significant verminderd na decellularisatie in vergelijking met de niet-decellulariseerde monsters. Vervolgens wordt ook de metabolische activiteit van humane dermale thyroblasten gemeten in aanwezigheid van decellulariseerde P.aquatica of Garcinia-scaffolds.
Interessant genoeg veroorzaakten op detergent-vrije basis gebaseerde scaffolds een verminderde invloed op de cellulaire metabolische activiteit, maar het wassen met Trishydrochloorbuffer, gevolgd door serumvrij medium na SDS-clearing, vermindert de invloed op de cellulaire metabolische activiteit in vergelijking met het wassen met alleen gedeïoniseerd water. Ten slotte wordt de groei van de mesenchymale stamcellen, gekleurd met calciene, op het oppervlak van de F.hispida-bladstructuur hier getoond. Eenmaal beheerst, kunnen deze technieken worden voltooid in ongeveer zeven dagen tot slechts 15 minuten wanneer ze correct worden uitgevoerd.
Wanneer u deze procedures uitvoert, is het belangrijk om de monsters te controleren tijdens het decellularisatieproces, omdat de monsters van batch tot batch kunnen variëren, wat kan resulteren in verschillende clearing-tijden. Na dit proces kunnen andere methoden zoals dequantificatie of mechanische testen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals in welke mate de monsters zijn gecleared en op welke andere weefsels de monsters mechanisch vergelijkbaar zijn. Na de ontwikkeling ervan heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van weefselengineering om perfusabele scaffolds te fabriceren.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u plantenweefsel kunt decellulariseren voor gebruik als scaffolds. Vergeet niet dat het werken met detergenten en bleekmiddeldampen gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van geschikte beschermende uitrusting en het gebruik van een afzuigkap moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert en vergelijkt twee protocollen voor het decelluleren van plantweefsels: een op detergenten gebaseerde aanpak en een detergentvrije aanpak. Beide methoden behouden de extracellulaire matrix, die kan dienen als schaal voor weefseltechniek toepassingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomaterialen
- Weefseltechniek
- Plantenbiologie
Achtergrond
- Decellurisatietechnieken zijn cruciaal voor het maken van schalen.
- Schalen kunnen de vloeistofoverdrachtscapaciteit verbeteren.
- Methoden kunnen worden toegepast op verschillende plantenstamvefsels.
- Er is geen gespecialiseerde apparatuur nodig voor deze technieken.
Doel van het onderzoek
- Om detergent-gebaseerde en detergentvrije decellurisatiemethoden te vergelijken.
- Om het potentieel van plantaardige extracellulaire matrices als schalen te evalueren.
- Om uitdagingen in schalenontwikkeling voor weefseltechniek aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Verzameling van verse of bevroren F.hispida bladmonsters.
- Opslag van monsters bij -20 graden Celsius.
- Onderdompeling van bladeren in gedeïoniseerd water bij 20 tot 25 graden Celsius.
- Snijden van bladeren in schijven van acht millimeter diameter met een biopsie-pons.
Belangrijkste resultaten
- Beide decellurisatiemethoden behouden effectief de extracellulaire matrix.
- De gemaakte schalen kunnen worden gebruikt in verschillende weefseltechniek toepassingen.
- De vloeistofoverdrachtscapaciteit van de schalen werd verbeterd.
- Methoden zijn schaalbaar en toepasbaar op de meeste plantensoorten.
Conclusies
- Decellurisatietechnieken bieden haalbare schalen voor weefseltechniek.
- Beide methoden hebben verschillende voordelen en kunnen worden gekozen op basis van specifieke behoeften.
- Toekomstig onderzoek kan extra toepassingen van plantaardige schalen verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Plant-derived scaffolds address critical biomaterials challenges in tissue engineering by offering scalable, biocompatible alternatives to autologous, synthetic, and animal-derived grafts. The described decellularization methods enable reproducible production of scaffolds with preserved extracellular matrix architecture, supporting fluid transfer and mechanical functionality essential for regenerative medicine applications. This positions plant-based systems as a strategic option for de-risking early-stage scaffold development in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of extracellular matrix contributions to scaffold biocompatibility and mechanical integrity.
- Operational Value: Provides standardized plant tissue preparation workflows applicable across species without specialized equipment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields scaffolds with quantifiable mechanical properties (UTS, MTM, SAF) for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay-ready scaffold production with low cellular metabolic impact, enabling reproducible cell-seeding experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of human cell responses (e.g., dermal thyroblasts, mesenchymal stem cells) on plant-derived matrices.
- Operational Value: Offers dual-method flexibility (detergent-based vs. detergent-free) to optimize scaffold properties for specific tissue engineering endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
These decellularization methods integrate into the discovery continuum by providing preparatory scaffolds for cell-based assays, supporting progression from biomaterial screening to preclinical validation in tissue engineering workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding plant extracellular matrix suitability as a scaffold foundation.
- Screening: Delivers reproducible scaffolds with measurable mechanical and biological outputs for comparative evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable data (genomic DNA reduction, metabolic activity, UTS) to inform scaffold selection criteria.
- Translational Research: Supports continuity from biomaterial discovery to preclinical testing via standardized scaffold production.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-agnostic protocol adaptable to multiple plant species, enhancing resource efficiency across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in scaffold performance by decoupling cellular and extracellular matrix contributions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized incubation times, solution concentrations, and washing steps.
- Strategic Value: Lowers development barriers by eliminating need for specialized equipment, enabling broader lab adoption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing scaffolds with tunable properties (e.g., UTS modulation via SDS vs. bleach).
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial handling and decellularization monitoring to prevent over-processing.
- Necessitates access to standard lab equipment (shake plate, hot plate, fume hood, biopsy punch) and reagents (SDS, bleach, sodium bicarbonate).
- Demands cross-team standardization of clearing endpoint assessment (e.g., visual inspection timing) to ensure batch consistency.
- Requires adaptation of incubation durations based on plant species and tissue thickness, as noted in sample variability observations.
- Involves safety considerations for handling detergents and bleach, including PPE use and fume hood operation during heated steps.
