Name: Een GPC3-targeting bispecifieke antilichaam, GPC3-S-Fab, met krachtige cytotoxiciteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer de productie van het bispecifieke antilichaam GPC3-S-Fab in Escherichia coli voor leverkankeronderzoek. Deze methode maakt eenvoudige zuivering en evaluatie van cytotoxische effecten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door de R & D plannen van Guangdong Province (PR China) (2016A050503028).

Alle procedures met inbegrip van menselijk bloed collectie werden goedgekeurd door de zon Yat-Sen Universiteit ethische commissie.
1. GPC3-S-Fab Design strategie
<ol><li>GPC3-S-Fab ontwerpen door het koppelen van een Fab van anti-GPC3 (gehumaniseerd GC3313) met een anti-CD16 VHH14 (Figuur 1).</li>
	<li>Synthetiseren en kloon van de VH-CH1-CD16-VHH en VL-CL in de vectoren pET26b en pET21a als eerder gemeld12.</li>
</ol>2. transformatie en cultuur
<ol><li>Voeg 100 ng van pET26b met VH-CH1-CD16 (figuur 1A) en 100 ng van pET21a met VL-CL (figuur 1A) in 100 µL van de bevoegde BL21 (DE3) cellen. Meng goed en incubeer op ijs voor 30 min. Incubate in een waterbad van 42 ° C voor 45-90 s, overdracht, en broeden op het ijs gedurende 3-5 minuten.</li>
	<li>Voeg 500 µL van lysogenie Bouillon (LB) medium in een buis met BL21 (DE3) cellen en vervolgens Incubeer bij 37 ° C, 150 rpm voor 45-60 min. verspreid 100 µL van BL21 (DE3) cellen op LB-agar platen met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline , en vervolgens Incubeer bij 37 ° C voor 12-16 h.<ol>
<li>Bereiden van lysogenie Bouillon (LB) medium: 1% wt/vol trypton, 0,5% wt/vol gistextract, 1% wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculeer cellen uit een één kolonie in 5 mL super Bouillon (SB) opslagmedium met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicillineen cultuur bij 37 ° C, 220 rpm, 's nachts. Inoculeer vervolgens 1 mL van de cultuur in 100 mL van SB medium met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline en cultuur bij 37 ° C, 220 rpm voor 4 uur. Daarna Pipetteer 10 mL van de cultuur in 1 L van SB medium met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline en cultuur bij 37 ° C, 220 rpm.<ol>
<li>Bereiden super Bouillon medium: 3,2% wt/vol trypton, 2% wt/vol gistextract, 0,5% wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de OD600 bereikt 0.6 - wil 0.8, isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) een eindconcentratie van 0,2 mM. Cultuur bij 16 ° C, 180 rpm voor 36-48 h voor periplasmische expressie.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab periplasmische zuivering
<ol><li>Periplasmische breuk voorbereiding<ol>
<li>Verzamelen van cellen door centrifugatie bij 4000 x g, 4 ° C gedurende 30 minuten, negeren van het medium en wegen van de cellen.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen grondig in 4 mL ijskoud sacharoseoplossing (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25% (wt/vol) sacharose en 1 mM EDTA) per gram cellen en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer bij 8500 x g (tafelblad centrifuge, vaste hoek rotor), 4 ° C voor 20 min. verwijderen het supernatant (de sacharose breuk) en sla het op ijs.</li>
		<li>Resuspendeer de korrels in een mix van ijskoude 5 mM van MgCl2 en 1 mM van de PMSF (4 mL per gram cellen). Voeg 40 µL van de lysozym voorraad (15 mg/mL) per gram, en uit te broeden op het ijs gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer bij 8500 x g (tafelblad centrifuge, vaste hoek rotor), 4 ° C gedurende 20 min. overdracht het supernatant (de periplasmatische breuk) en sla het op ijs.</li>
		<li>Combineer de sacharose breuk en periplasmische breuk, en centrifugeer bij 30.000 x g, 4 ° C voor 30 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen en op te slaan in een 50 mL conische buis op ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTA affiniteit zuivering<ol>
<li>1 mL van Ni-NTA agarose resuspendeer door vermenging grondig te bereiken een homogene suspensie, verwijderen 1 mL Ni-NTA agarose aan een conische buis van vers 15 mL en voeg toe 10 kolom volumes (CV) evenwichtsinstelling buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M van NaCl) naar equilibreer.</li>
		<li>Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant zorgvuldig. Vervolgens voegt u de Ni-NTA agarose in de 50 mL-buis met de Fractie van de sucrose en periplasmische breuk. Rock bij 4 ° C gedurende 2 uur.</li>
		<li>Centrifugeer het mengsel bij 400 x g, 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende substantie aan een andere verse ijskoude buis als de niet-afhankelijke breuk. Breng de Ni-NTA agarose in een gravity-kolom.</li>
		<li>Voeg 10 CV buffer te wassen (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M van NaCl; 20 mM, 30 mM of 40 mM van imidazool) naar de kolom en verzamel de elute als de breuk wassen. Opmerking: Deze oplossingen moeten worden toegevoegd in volgorde van toenemende concentraties van imidazool.</li>
		<li>Voeg 3 CV van elutie buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 300 mM van NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 of 400 mM van imidazool) naar de kolom en het verzamelen van de elute als elutie breuk 1, 2, 3 en 4. Opmerking: Deze oplossingen moeten worden toegevoegd in volgorde van toenemende concentraties van imidazool.</li>
		<li>Dialyse de eluted breuken in 2 L van PBS (137 mM van NaCl, 2,7 mM van KCl, 10 mM voor Na2HPO4, 2 mM van KH2PO4, pH 7.4) met behulp van dialyse buis (12.4 kDa) bij 4 ° C voor 2 h. Controleer de aanwezigheid van GPC3-S-Fab met 12% SDS-pagina en vervolgens op Coomassie blue kleuring.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG-CH1 affiniteit zuivering<ol>
<li>1 mL van de IgG-CH1 affiniteit hars overboeken naar een conische tube van 50 mL, en de kralen met PBS eerst wassen. Voeg vervolgens de dialyzed oplossing met GPC3-S-Fab na stap 3.2.6. Rock bij 4 ° C gedurende 2 uur.</li>
		<li>Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min, 4 ° C. Zorgvuldig verwijderen van het supernatans dat aan een ander vers ijskoude buis, en breng het hars aan een kolom van de zwaartekracht.</li>
		<li>Voeg 10 CV van wassen buffer (PBS) naar de kolom, en het verzamelen van de elutie als de breuk wassen.</li>
		<li>Bereiden de collectie buizen door toevoeging van 1 M van Tris pH 9.0 (0,1 mL / mL van elk eluted breuk). Elueer met 3 CV elutie buffer (0,1 M glycine-HCl, pH 2.7), en het verzamelen van de eluted Fractie; Herhaal dit 3 keer.</li>
		<li>Dialyse de eluted breuken in 2 L van PBS met behulp van dialyse buis (12.4 kDa) bij 4 ° C voor 2 h. Herhaal tweemaal.</li>
		<li>Bepaal de eiwitconcentratie ultramicrospectrophotometer (molaire extinctie coëfficiënt: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-pagina en analyse van het westelijke bevlekken
<ol><li>Een 10 µL van het monster rekening 5 x SDS laden buffer en meng goed. Kook het mengsel van eiwit bij 100 ° C gedurende 5 minuten.<ol>
<li>5 x SDS laden buffer bereiden: 250 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol bromophenol blauw, 50% vol/vol glycerol, 5% vol/vol bèta-mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiden van een SDS-pagina gel met een lading gel (5%) en de scheiding gel (12%) als eerder beschreven26,27,28.</li>
	<li>10 µL van het mengsel van gekookte eiwit en eiwit marker laden en uitvoeren van de SDS-pagina.</li>
	<li>Vlekken van de gel door schudden voor 20 min met Coomassie briljant blauw oplossing, en vervolgens uit te voeren destaining.</li>
	<li>Voor het westelijke bevlekken, na het overbrengen naar een membraan PVDF, blokkeren van het membraan met TBST (20 mM Tris-HCl, NaCl, 0,1% vol/vol Tween 20 150 mM) + 5% wt/vol afgeroomde melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur tijdens het schudden.</li>
	<li>Incubeer het membraan met primaire antilichamen (anti-zijn of Anti-Flag) verdund 1:2,000 in TBST + 5% afgeroomde melk gedurende 1 uur.</li>
	<li>Wassen met TBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en herhaal 3 keer.</li>
	<li>Incubeer de membraan in secundair antilichaam (HRP-linked anti-muis Fc antilichaam) verdund 1:2,000 in TBST + 5% afgeroomde melk gedurende 1 uur.</li>
	<li>Wassen met TBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en herhaal 3 keer.</li>
	<li>Voeg 1 mL HPR substraat per film, ontwikkelen en nemen van beelden.</li>
</ol>5. gel filtratie analyse
<ol><li>Gebruik de volgende kolom: kolom volume van 24 mL; Evenwichtsinstelling buffer van PBS pH 7.4; Debiet van 0,5 mL/min bij room gematigde; Monstervolume van 200 µL.</li>
	<li>Gebruik de volgende eiwit volume en concentratie: 500 µL van 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten, en neem 200 µL te laden.</li>
	<li>Voor het eiwit marker volume en de concentratie, wordt 100 µL van cytochroom C (2 mg/mL, 12.4 kDa), 140 µL van anhydrase (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µL van albumine (10 mg/mL, 66 kDa) en 200 µL van alcoholdehydrogenase (5 mg/mL, 150 kDa) rekening door één buis. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten, en neem 200 µL te laden.</li>
	<li>Vóór elke run, wassen met ten minste 2 CV gedestilleerd water op een debiet van 0,5 mL/min.</li>
	<li>De kolom met ten minste 2 equilibreer CV van evenwichtsinstelling buffer (PBS, pH 7.4) op een debiet van 0,5 mL/min.</li>
	<li>Automatisch injecteren het monster bij 0,5 mL/min voor het laden van het monster.</li>
	<li>Elueer met evenwichtsinstelling buffer op 0,5 mL/min en op 280 en 215 nm te sporen.</li>
</ol>6. Stroom Cytometry analyse
<ol><li>Cultuur van de HepG2 (GPC3 positieve), Hep3B (GPC3 positieve), Huh7 (GPC3 positief), en MHCC - 97-H (GPC3 negatief) cellen in kunststof gerechten 100 x 20 mm met DMEM medium met 10% foetale runderserum (FBS) en penicilline (100 µg/mL), streptomycine (50 µg/mL) bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Cultuur CHO (GPC3 negatief) cellen en CHO/GPC3 cellen full-length menselijke GPC3 cDNA (GPC3 positief) in 100 x 20 mm kunststof gerechten met RPMI 1640 medium met 10% FBS (100 µg/mL) penicilline en streptomycine (50 µg/mL) bij 37 ° C, 5% CO2herbergen.</li>
	<li>Cultuur van de NK92/CD16 herbergen full-length menselijke CD16 cDNA (CD16 positief) in 25cm2 kolf met RPMI 1640 medium met 10% FBS (100 µg/mL) penicilline en streptomycine (50 µg/mL) bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Wanneer de cellen zijn 70-90% confluente, negeren de medium en wassen van de cellen met 2 mL PBS. Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% trypsine en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min (of totdat de cellen beginnen om los van het oppervlak te maken). Voeg 1 mL van het volledige groeimedium te neutraliseren de trypsine en resuspendeer de cellen door pipetteren zachtjes op en neer.</li>
	<li>De getallen van de cel met behulp van een Neubauer-hemocytometer tellen en de levensvatbaarheid van de cellen door Trypan Blue detecteren.</li>
	<li>Verzamelen van 3 x 106 cellen voor elke regel van de cel. Voeg 1 mL PBS + 0,2% BSA om resuspendeer de cellen. Centrifuge op 200 x g, 4 ° C gedurende 5 min. tweemaal herhalen.</li>
	<li>Voeg 0.3 mL PBS + 0,2% BSA om resuspendeer de cellen, en breng 100 µL (ongeveer 1 miljoen) aan elke 5 mL polystyreen ronde-onderkant-buis. Opmerking: Zorg ervoor dat alle stappen hiervandaan de buizen moeten koud worden gehouden op het ijs. Wanneer het antilichaam aan de cel oppervlakte-antigeen bindend is, zal het complex beginnen te internaliseren. Doordat het koud, is het proces aanzienlijk vertraagd.</li>
	<li>Voeg 10 µL van primaire antilichamen (GPC3-S-Fab of menselijke IgG1, eindconcentratie 5 µg/mL) toe aan elke buis en incubeer op ijs gedurende 1 uur.</li>
	<li>Voeg 1 mL PBS + 0,2% BSA te wassen, en centrifuge op 200 x g, 4 ° C gedurende 5 min. Herhaal dit drie keer.</li>
	<li>Resuspendeer in 100 µL van PBS + 0,2% BSA, Voeg 0,5 µL van secundair antilichaam (anti-menselijk IgG(H+L)-488, definitieve concentratie 10 µg/mL) en incubeer op ijs voor 1 h. nota: vanaf dit stap, gelieve te houden de cellen van het licht.</li>
	<li>Voeg 1 mL PBS + 0,2% BSA te wassen, en centrifuge op 200 x g, 4 ° C gedurende 5 min. Herhaal dit drie keer.</li>
	<li>Het analyseren van de cellen door stroom cytometer volgens het standaardprotocol29. Verwerven van cellen met een 488 nm laser voor excitatie.</li>
</ol>7. cytotoxische Assays
<ol><li>Bereiden van tumorcellen.<ol>
<li>Cultuur HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H en CHO cellijnen zoals beschreven in stappen 6.1-6.5.</li>
		<li>Cellen naar 0,5 × 105/mL Verdun en plaat 100 µL cellen (5.000 cellen per putje) op 96-wells-platen. Cultuur 6-8 h zodat de cellen te koppelen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te bereiden.<ol>
<li>Verdun vers bereid bloed met een gelijk volume van PBS in een conische tube van 50 mL. Bijvoorbeeld, Verdun 10 mL bloed met 10 mL PBS.</li>
		<li>15 mL lymfocyt scheiding voedingsbodem rekening een conische buis van verse 50 mL. Breng langzaam het verdunde bloed op de lymfocyt scheiding medium langs de kant van de buis. Opmerking: Houd de buis verticaal. Breek niet het oppervlak van de lymfocyt scheiding medium.</li>
		<li>Centrifugeer bij 400 x g gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur met de rem af.</li>
		<li>Langzaam verwijderen de bovenste plasma laag, en nemen de laag van de witte bloed met PBMCs op het plasma-lymfocyt scheiding middellange raakvlak.</li>
		<li>Verdun de PBMCs met een dubbel volume van PBS + 2% FBS. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Wassen van de cellen tweemaal met PBS + 2% FBS. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min. tellen de cel nummers, zoals beschreven in stap 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van NK-cellen.<ol>
<li>Maak de PBMCs suspensie met een concentratie van 5 x 107 cellen/mL in PBS + 2% FBS, en plaats hen in een polystyreen ronde-bodem-tube van 5 mL.</li>
		<li>Menselijke NK cel verrijking Cocktail bij 50 µL/mL van cellen toevoegen. Meng goed en laat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten inwerken.</li>
		<li>Resuspendeer de magnetische deeltjes uit de NK-cel verrijking kit, en meng goed zodat ze gelijkmatig worden opgeschort door pipetteren op en neer krachtig meer dan 5 keer. De geresuspendeerde magnetische deeltjes bij 100 µL/mL overbrengen in de celsuspensie. Meng goed en laat bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten inwerken.</li>
		<li>Brengen van de celsuspensie tot een totaal volume van 2.5 mL door toevoeging van PBS + 2% FBS. Meng de cellen in de buis door pipetteren zachtjes op en neer 2 - 3 keer. Plaats de buis (zonder een cap) in de magneet. Laat de magnetische kralen settelen gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder de magneet. Omkeren in een continue beweging, de buis, een nieuwe buis uit de verrijkte celsuspensie binnenstromen.</li>
		<li>Tellen de cel nummers, zoals beschreven in stap 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instellen van de cytotoxische reactie.<ol>
<li>Verdun de NK-cellen tot 5 × 105 cellen/mL met behulp van het bijbehorende kweekmedium. Voeg 100 µL celsuspensie NK aan de tumorcellen op een 96-wells-plaat verzinkt.</li>
		<li>Voeg 10 µL van GPC3-S-Fab in verschillende concentraties, met de hoogste dosis op een eindconcentratie van 30 µg/mL, 3-voudig verdunning, 9 punt (drie wordt gerepliceerd).</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 72 uur.</li>
		<li>Na 72 uur incubatie, verwijderen van het medium, voeg 100 µL van DMEM medium met 10 µL van CCK8 reagens aan elk putje in 96-wells-platen en vervolgens Incubeer bij 37 ° C.</li>
		<li>Lees de plaat bij 450 nm bij 1, 2, 3 en 4 uur na het toevoegen van het CCK8-reagens.</li>
		<li>Het analyseren van de gegevens. Berekenen van de overlevingskansen als (OD450 GPC3-S-Fab Effector + tumor - OD450 medium) / (OD450 tumor - OD450 medium) × 100% en (OD450 GPC3-S-Fab + tumor - OD450 medium) / (OD450 tumor - OD450 medium) × 100%. De effector cellen zijn NK-cellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li>
<li>Rathi, C., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pharmacology+of+bispecific+antibody+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs.</a> The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).</li>
<li>Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-antigen-binding+bispecific+antibodies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment.</a> Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).</li>
<li>Demarest, S. J., Glaser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics%2C+antibody+engineering%2C+and+the+merits+of+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).</li>
<li>Mabry, R., Snavely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies%3A+The+selection+of+stable+single-chain+fragments+to+overcome+engineering+obstacles%5BTitle%5D)+AND+%22IDrugs%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles.</a> IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).</li>
<li>Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+interactions+in+the+Fab+fragment%3A+a+comparative+evaluation+of+the+single-chain+Fv+and+Fab+format+engineered+with+variable+domains+of+different+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability.</a> Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).</li>
<li>Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody-based+cancer+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Nanobody-based cancer therapy of solid tumors.</a> Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).</li>
<li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments%3A+the+superfluous+luxury+of+paired+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li>
<li>Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Domain+Antibodies+As+Versatile+Affinity+Reagents+for+Analytical+and+Diagnostic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications.</a> Frontiers in Immunology. 8, 977(2017).</li>
<li>Fernandes, C. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camelid+Single-Domain+Antibodies+As+an+Alternative+to+Overcome+Challenges+Related+to+the+Prevention%2C+Detection%2C+and+Control+of+Neglected+Tropical+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases.</a> Frontiers in Immunology. 8, 653(2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bispecific+antibody%2C+S-Fab%2C+induces+potent+cancer+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing.</a> Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-domain+antibody-linked+Fab+bispecific+antibody+Her2-S-Fab+has+potent+cytotoxicity+against+Her2-expressing+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells.</a> AMB Express. 6 (1), 32(2016).</li>
<li>Nakano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-glypican+3+antibodies+cause+ADCC+against+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).</li>
<li>Behar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+anti-FcgammaRIII+%28CD16%29+llama+single-domain+antibodies+that+activate+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design%2C+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.</a> Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).</li>
<li>Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22886257">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li>
<li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16408159">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li>
<li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li>
<li>Filmus, J., Selleck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans%3A+proteoglycans+with+a+surprise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glypicans: proteoglycans with a surprise.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).</li>
<li>Baumhoer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypican+3+expression+in+human+nonneoplastic%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+tissues%3A+a+tissue+microarray+analysis+of+4%2C387+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).</li>
<li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li>
<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li>
<li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma%3A+biological+significance+and+temporospatial+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li>
<li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+%28FcgammaRIII%29+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li>
<li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Research%22%5BJournal%5D)">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+CD16a%2C+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells%2C+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

In deze studie, presenteren wij een strategie voor de bouw van een nieuwe indeling van bsAbs, GPC3-S-Fab, die NK cellen gericht op GPC3 positieve tumorcellen kan aanwerven. De S-Fab is gebaseerd op de natuurlijke Fab formaat door toevoeging van een anti-CD16 VHH11,12. Vergeleken met de bsAbs met Fc regio, kan GPC3-S-Fab gemakkelijk worden geproduceerd in het periplasma van bacteriën op grote schaal.
Met behulp van de strategie van het ...

Monoclonal antilichamen zijn nu over het algemeen gebruikt voor kanker behandeling1. Als gevolg van de flexibiliteit van antilichamen, werden diverse antilichaam gebaseerde formaten actief onderzocht. Vergeleken met monoklonale antilichamen, hebben bsAbs twee verschillende antigeen-bindende modules, waardoor ze te herkennen met twee verschillende doelen tegelijk en efficiënt leiden tot de aanwerving van immuun effector cellen te richten en te doden van tumor cellen2.
Huidige recombinante bsAb formaten kunnen over het algemeen worden toegewezen aan twee klassen: Fc-bevattende bsAbs en bsAbs zonder een Fc-regio. Vergeleken met Fc-bevattende indelingen die worden meestal geproduceerd in zoogdiercellen, bsAbs zonder een Fc-regio hebben de voordelen van kleinere, meer gemakkelijk in expressiesystemen micro-organisme worden geproduceerd, en tumor weefsels efficiënter kan doordringen 3.
bsAbs zonder een Fc-regio worden vaak gevormd door individuele bindend wordt, zoals één-keten variabele fragmenten (scFvs) of Fabs3te koppelen. Zonder de stabiliserende domeinen, bsAbs op basis van scFv fragmenten vaak geknoeid thermische stabiliteit, lage oplosbaarheid of een toegenomen potentieel voor aggregatie4,5. Fab gebaseerde bsAbs zijn daarentegen meer stabiel als gevolg van de heterodimerization van de CH1 en CL in de inheemse Fab deel4,6.
Variabele domein van zware-keten-only-antilichamen (VHHs, ook wel aangeduid als één domein antilichamen) zijn de actieve antigeen-bindende fragment van natuurlijke zware-keten antilichamen7. VHHs hebben de kenmerken van hoge affiniteit, specificiteit van conventionele IgGs8, lage immunogeniciteit en hoge opbrengst in bacteriële expressie9. Vergeleken met de Fv fragmenten, hebben VHHs hogere thermische stabiliteit10. Vergeleken met Fab wordt, hebben VHHs kleinere maten als gevolg van het ontbreken van CH1 en CL. S-Fab, de bsAb formaat, verkregen door het koppelen van de Fab met een enkel domein antilichamen, VHH, is zo ontworpen en studeerde voor zijn anti-tumor effecten11,12.
In deze studie werd de bouw van GPC3-S-Fab door het koppelen van de Fab van hGC3313 met een anti-CD16a VHH14 beschreven. De GPC3-S-Fab kan efficiënt worden geproduceerd door periplasmische expressie in Escherichia coli (E. coli). Functionele studies van GPC3-S-Fab suggereerde dat GPC3-S-Fab een veelbelovende strategie voor leverkanker therapie is. Dus, de voordelen van GPC3-S-Fab over alternatieve technieken met toepassing verwijzingen naar eerdere studies zijn gemakkelijk productie en zuivering, en meer stabiele bsAbs.
Zoogdieren expressiesystemen en prokaryote expressiesystemen zijn gebruikt om verschillende formaten van BsAbs express. In tegenstelling tot zoogdieren expressiesystemen, E. coli-gebaseerde eiwit expressiesystemen hebben vele voordelen, waaronder hoge opbrengsten, lage kosten en arbeidsbesparende, het gemak van genetische manipulaties, en hoge transformatie efficiëntie15. Voor bsAbs expressie in E. coli, zijn er twee fundamentele strategieën: expressie in het cytoplasma en expressie in het periplasma tussen het cytoplasma en buitenste celmembraan15. Vergeleken met de vermindering omgeving van cytoplasma, is het periplasma een meer oxiderende milieu, dat de juiste vouwen stimuleert en co uitdrukking van eiwitten16. Juiste vouwen speelt een belangrijke rol in de generatie van de oplosbaarheid, stabiliteit en functie van bsAbs. Daarom is een signaal reeks pelB toegevoegd aan de N-terminus van de S-Fab naar directe secretie om het periplasma van E. coli17. Om ervoor te zorgen werkzaam correct vouwing, oplosbaarheid, thermische stabiliteit en conformationele stabiliteit, vermindering van de complexiteit en de omvang van een antilichaam is vaak16. De S-Fab-indeling bestaat uit een Fab en één VHH, die zeer goed wordt uitgedrukt in bacteriële systemen waarschijnlijk te wijten aan de eenvoudige structuur en kleine omvang.
GPC3 werd in dit GPC3-S-Fab bispecifieke antilichaam formaat gekozen. Glypican-3 (GPC3) is een lid van de heparine sulfaat (HS) Proteoglycaan familie die wordt verankerd aan het celoppervlak via glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 is overexpressie in 70% van de gevallen van hepatocellulaire carcinoom (HCC), die goed zijn voor de meerderheid van de lever kanker19,20,21,22. Omdat GPC3 zelden in normale weefsels uitgedrukt is, GPC3 voorgesteld als een potentieel doelwit voor HCC. Meerdere muis mAbs zijn geproduceerd tegen GPC3. Echter alleen GC33 tentoongesteld beperkte anti-tumor activiteit 22en zij nagelaten om klinische werkzaamheid bij patiënten tentoon te stellen. In deze studie GPC3-S-Fab bleek te kunnen werven van NK-cellen te doden GPC3 tumor cellen14.
Werven van NK-cellen, werd anti-CD16 VHH gebruikt. CD16a is een lage affiniteit IgG receptor, uitgedrukt voornamelijk op natural killer (NK) cellen, monocyten en macrofagen en enkele subtypen van T-cellen. Het is betrokken bij de cytotoxiciteit (ADCC) van de antilichaam-afhankelijke cel van NK cellen23. Menselijke NK cellen kunnen worden onderverdeeld in twee soorten, CD56 - CD16 + en CD56 + CD16-. In tegenstelling tot CD56 + CD16− NK-cellen, CD56-CD16 + NK-cellen kunnen vrijgeven van hogere niveaus van Perforine en granzyme B en aldus een sterke cytotoxiciteit24. Kupffer cellen (KCs), uiting van CD16a, zijn de ingezetene macrofagen in de lever. Kupffer cellen spelen een belangrijke rol bij de onderdrukking van leverkanker25. Dus, is bsAbs gericht op CD16a mogelijk een meer belovende strategie dan boeiende T cellen tegen leverkanker.

<table><tbody><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td><td>Mini-PROTEAN&reg; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot apparatus</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Imaging system</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein Liquid chromatogram</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Beckman coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision plate reader</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag-tag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-human(H&amp;L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 affinity resin</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>NK cell enrichment kit</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kit</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Standard marker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Gel filtratie</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td><td>VWR chemicals</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycine</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm plastic dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96 well cell culture cluster</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

een gpc3-targeting bispecifieke antilichaam, gpc3-s-fab, met krachtige cytotoxiciteit

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Dit protocol beschrijft de bouw en functionele studies van een bispecifieke antilichaam (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs herkent twee verschillende epitopen door hun twee verschillende wapens. bsAbs zijn actief bestudeerd om hun vermogen om direct werven immune cellen te doden tumorcellen. Op dit moment worden de meeste bsAbs geproduceerd in de vorm van recombinante eiwitten, hetzij als bsAbs Fc-bevattende hetzij als kleinere bsAb derivaten zonder de Fc-regio. In deze studie werd GPC3-S-Fab, een antilichaam fragment (Fab) gebaseerde bispecifieke antilichaam, ontworpen door de Fab van anti-GPC3 antistof GC33 met een anti-CD16 één domein antilichaam te koppelen. De GPC3-S-Fab kan worden uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd door twee affiniteit chromatographies. Het gezuiverde GPC3-S-Fab kan specifiek binden aan en GPC3 positieve lever kankercellen doden door de indienstneming van natural killer cellen, hetgeen wijst op een mogelijke toepassing van GPC3-S-Fab in therapie leverkanker.

GPC3-S-Fab zuivering
GPC3-S-Fab was gezuiverd van E. coli door een tweestaps affiniteit zuivering, eerst met Ni-NTA-agarose, gevolgd door IgG-CH1 affiniteit zuivering. Na de zuivering van de affiniteit in twee stappen, was GPC3-S-Fab gezuiverd tot homogeniteit met de twee kettingen dicht bij 1:1 (figuur 2A). De aanwezigheid van zowel VH-CH1-CD16 VHH en VL-CL polypeptiden ka...

Hier presenteren we een protocol om te produceren een antilichaam bispecifieke GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Het gezuiverde GPC3-S-Fab heeft krachtige cytotoxiciteit tegen GPC3 positieve lever kankercellen.

Een GPC3-targeting bispecifieke antilichaam, GPC3-S-Fab, met krachtige cytotoxiciteit

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het gebied van bispecifieke antilichamen, zoals hoe een bispecifiek antilichaam in bacteriën kan worden geproduceerd en de functie van het gezuiverde antilichaam kan worden bepaald. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat GPC3-S-Fab gemakkelijk kan worden geproduceerd en gezuiverd uit E.coli. Om de periplasmatische fractie voor te bereiden, centrifugeer eerst de celsuspensie gedurende 30 minuten bij 4.000 g op vier graden Celsius.Vervolgens verwijder je het medium en weeg je de cellen. Na centrifugatie, lost u de cellenpellet op in vier milliliter ijskoude sucrose-oplossing voor elke gram cellen. Incubeer de celsuspensie gedurende 15 minuten op ijs.Na 15 minuten centrifugeer je de celsuspensie bij 8.500 g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Pipetteer vervolgens de supernatant met de sucrosefractie uit en bewaar deze op ijs. Resuspendeer de cellenpellet in een ijskoud mengsel van vijf millimolair magnesiumchloride en een millimolair PMSF.Voeg vervolgens 40 microliter van 15 milligram per milliliter van de lysosome stock toe aan de celsuspensie. Laat de celsuspensie na toevoeging van de lysosome stock 30 minuten op ijs staan. Na de incubatietijd combineer je de sucrose en de periplasmatische fracties.Centrifugeer vervolgens de sucrose-periplasmatische fractie bij 30.000 g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Na het centrifugeren, breng je het supernatant over in een 50-milliliter kegelbuisje op ijs. Meng vervolgens en resuspendeer één milliliter van nikkel-NTA agarose met het supernatant om een homogene suspensie te verkrijgen, vervolgens één milliliter van nikkel-NTA agarose in een nieuwe 15-milliliter kegelbuisje.Voeg aan de agarose tien kolomvolumes van de evenwichtsbuffer toe. Centrifugeer vervolgens de agarose gedurende vijf minuten bij 400 g. Na centrifugatie verwijder je voorzichtig het supernatant en voeg je de nikkel-NTA agarose toe aan de sucrose-periplasmatische fractie.Scud vervolgens het sucrose-periplasmatische fractie-bevattende buisje gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het mengsel. Verwijder voorzichtig het supernatant naar een nieuw ijskoud buisje, omdat dit de ongebonden fractie is.Nadat het supernatant is overgebracht, voeg je de nikkel-NTA agarose toe in de zwaartekrachtkolom. Voeg vervolgens drie kolomvolumes van elutiebuffer toe aan de kolom. Verzamel vervolgens het eluaat als elutiefracties één, twee, drie en vier, respectievelijk.Verdun en zaai 5.000 cellen in 100 microliter in elke put van een 96-putjesplaat. Incubeer de plaat gedurende zes tot acht uur op 37 graden Celsius voor hechting. Om de PBMC's voor te bereiden, verdun je eerst het vers bereide bloed met een gelijk volume fosfaatgebufferde zoutoplossing in een 50-milliliter kegelbuisje.Pipetteer 15 milliliter lymfocytscheidingsmedium in een nieuw 50-milliliter kegelbuisje. Breng vervolgens voorzichtig het verdunde bloed langs de wanden van de buis naar het lymfocytscheidingsmedium. Centrifugeer de cellen gedurende 35 minuten bij 400 g bij kamertemperatuur met de remmen uitgeschakeld.Na centrifugatie trek je voorzichtig de bovenste plasmalaag eruit. Pipetteer vervolgens de witte bloedlaag met de PBMC's. Verdun deze PBMC's met dubbel het volume fosfaatgebufferde zoutoplossing met 2% foetaal bovien serum.Centrifugeer vervolgens de PBMC-suspensie. Was de cellenpellet met fosfaatgebufferde zoutoplossing met 2% foetaal bovien serum en centrifugeer opnieuw. Tel na centrifugatie het aantal cellen.Om de natuurlijke killercellen voor te bereiden, reconstrueer de PBMC's in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 2% foetaal bovien serum. Breng vervolgens het mengsel over in een polystyreen ronde bodembuis. Voeg 50 microliter per milliliter natuurlijke killercellen verrijkingscocktail toe aan de PBMC-mengsel.Meng de inhoud en laat de buis gedurende 10 minuten staan. Resuspendeer en meng vervolgens de magnetische deeltjes in het verrijkingscocktail door meerdere keren te pipetteren, zodat de deeltjes gelijkmatig gesuspendeerd zijn. Voeg vervolgens 100 microliter per milliliter magnetische deeltjes toe aan de celsuspensie.Meng de celsuspensie met magnetische deeltjes en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na vijf minuten 2,5 milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing met 2% foetaal bovien serum toe aan de celsuspensie. Pipetteer voorzichtig twee tot drie keer om de cellen in de buis te mengen.Plaats de buis op de magneet en laat de magnetische kralen gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur bezinken. Draai vervolgens in één beweging de buis om en giet de verrijkte celsuspensie in een nieuwe buis. Tel opnieuw het aantal cellen.Zodra het tellen is voltooid, verdun je de natuurlijke killercellen in het kweekmedium. Voeg vervolgens 100 microliter van de celsuspensie toe aan de in een 96-putjesplaat geplaatste tumorcellen. Om de cytotoxiciteitsassays op te zetten, voeg je 10 microliter van verschillende concentraties van GPC3-S-Fab antilichaam toe aan de 96-putjesplaat.Incubeer vervolgens de plaat gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius. Na de aangegeven incubatietijd aspireer je het medium. Voeg vervolgens 100 microliter DMEM-medium met 10 microliter CCK-reagens toe aan elke put van de 96-putjesplaat.Incubeer de plaat weer gedurende 37 graden Celsius. Lees na incubatie de plaat bij 450 nanometer elke opeenvolgende uur tot vier uur na toevoeging van het CCK8-reagens. Het GPC3-S-Fab antilichaam wordt gezuiverd met een tweestaps affiniteitszuivering.Hier tonen de twee panelen dat het antilichaam wordt gezuiverd met behulp van nikkel-NTA agarose en de IgG-CH1 affiniteitszuiveringskolommen, respect

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Specifieke cellen elimineren zonder andere cellen te beschadigen is uiterst moeilijk, vooral in gevestigd weefsel, maar er is een dringende behoefte aan een methode voor cel-eliminatie op het gebied van weefselengineering. Hier presenteren we een methode voor specifieke cel-eliminatie uit een gemengde 3D-celcultuur met behulp van nabij-infrarood foto-immunotherapie (NIR-PIT).

Selectieve Cell Eliminatie van Gemengde 3D Cultuur Met behulp van een Near Infrared Photoimmunotherapy Techniek

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Dit werk beschrijft de synthese en karakterisering van een op pomalidomide gebaseerde, bifunctionele homo-PROTAC als een nieuwe benadering voor het induceren van alomtegenwoordige en afbraak van de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), het doelwit van thalidomide analogen.

Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs

De ontwikkeling van een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF) is een roman voor de eliminatie van schadelijke antilichamen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de synthese van DCAF1 molecuul, dat selectief 4G2 antilichamen kan blokkeren om antilichaam afhankelijke verbeterings effecten te elimineren tijdens een Denguevirus infectie.

Gerichte antilichamen blokkering door een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetics (DCAF)

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Hier beschrijven we een methode voor het transduceren van menselijke T-cellen met luciferase om in vivo tracking van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel naar tumoren in studies te vergemakkelijken om de anti-tumor werkzaamheid en het mechanisme van T-cel-engaging bispecifieke antilichamen te evalueren.

Het volgen van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel met behulp van luciferase-getransduceerde menselijke T-cellen

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Hier presenteren we een methode om menselijke iPSC-afgeleide chimere antigeenreceptor (CAR)-tot expressie brengende natural killer-cellen te differentiëren en uit te breiden met verbeterde doding tegen verschillende maligniteiten. Dit protocol demonstreert de differentiatie en uitbreiding van voor natural killer (NK) geoptimaliseerde iPSC-afgeleide CAR-NK-cellen en de meting van antitumoractiviteit tegen verschillende tumorcellijnen.

Vooruitgang in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide chimere antigeenreceptor-expressie natuurlijke killercellen

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Leer de productie van het bispecifieke antilichaam GPC3-S-Fab in Escherichia coli voor leverkankeronderzoek. Deze methode maakt eenvoudige zuivering en evaluatie van cytotoxische effecten mogelijk.

Een GPC3-targeting bispecifieke antilichaam, GPC3-S-Fab, met krachtige cytotoxiciteit

Meer video's verkennen