A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse
22 mei 2018
Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Aβ oligomeren van een synthetische peptide in vitro en relatieve hoeveelheid Aβ oligomeren evalueren door een stip bevlekken analyse.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurofarmacologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar is om beta-amyloïde oligomeer te vormen. We tonen aan dat deze methode cruciaal is omdat de stappen voor het bereiden van beta-oligomeer moeilijk te leren zijn.
Stel eerst de concentratie van de A-bèta-monomeroplossing in op 0,25 milligram per milliliter door 900 microliters tweevoudig gedistilleerd water toe te voegen aan de buis. Vervolgens de monomeroplossing blijven verdampen met stikstofgas van hoge zuiverheid tot het volume ongeveer 850 microliters bereikt met een concentratie van ongeveer 0,29 milligram per milliliter. De aanwezigheid van HR5P beïnvloedt de vorming van A-bèta-oligomeer.
Daarom is het verdampen zo veel mogelijk een kritische stap in deze procedure. Gebruik vervolgens tweevoudig gedistilleerd water om de curcumin-voorraadoplossing te verdunnen om een werkoplossing van 0,2 en twee micromolar voor te bereiden. Behoud een verhouding van één-op-één en meng de A-bèta-oplossing met curcumin om de uiteindelijke concentratie van curcumin op 0,1 en één micromolar te bereiken.
Laat vervolgens de oplossing op een magnetische agitator staan. Bevestig een plastic verdeelbox aan de magnetische agitator. Plaats twee magnetische roerstaven in de twee hoeken van de box en plaats de buizen met de monsters in het midden van de box.
Schakel de box 48 uur lang door op kamertemperatuur met 60 omwentelingen per minuut en centrifugeer vervolgens de buis bij 18.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Na centrifugatie wordt de supernatant verzameld. Voor dotbloting-analyse neemt u een nitrocellulosemembraan en snijdt deze in stroken van een centimeter breed, plaats vervolgens twee microliter van het monster gelijkmatig op de stroken een en twee met elk punt op 0,5 centimeter intervallen.
Wanneer het monster op het membraan wordt gespoten, is het noodzakelijk om gelijkmatig te verspreiden en de verschillende druppels te regelen, zodat de verschillende monsters niet aan elkaar zijn verbonden. Incubeer vervolgens de stroken gedurende vijf minuten op kamertemperatuur om de druppels te laten drogen. Na vijf minuten incuberen de stroken met 5% bovien serumalbumine gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
Nadat de incubatie is voltooid, spoelt u de stroken gedurende vijf minuten met TBST-buffer. Zuig de buffer af nadat de was is voltooid en incubeer vervolgens strip één met anti-oligomeerantilichaam A11 en strip twee met anti-A-bèta-antilichaam 6E10-oplossing gedurende een uur. Na een uur wast u de stroken met TBST gedurende vijf minuten ieder drie keer, zuig vervolgens de buffer af en incubeer de stroken met secundaire antilichaamoplossing gedurende 40 minuten.
Na de incubatie van het secundaire antilichaam wast u de stroken opnieuw met TBST gedurende vijf minuten ieder drie keer. Voeg vervolgens ongeveer 300 microliter gemengde ECL-vloeistof toe aan het oppervlak van de vochtige stroken en stel de stroken bloot in een automatisch chemiluminescentie-beeldvormingssysteem. TEM-studies tonen de afwezigheid van zichtbare aggregaten in de HFIP-opgeloste A-bèta-monomeroplossing, maar na 48 uur incubatie vormen dezelfde monomeren oligomeren, die voornamelijk bolvormige aggregaten zijn met een diameter van 10 tot 80 nanometer.
Bij het onderwerpen van de A-bèta-monomer- en oligomeerrijke monsters aan dotbloting-analyse, toont dit de aanwezigheid van A11-positieve A-bèta-oligomeren in A-bèta-oligomeerrijke monsters. Interessant is dat A-bèta 6E10-positieve A-bèta-peptiden aanwezig zijn in zowel de A-bèta-monomer- als oligomeerrijke monsters. Vervolgens wordt ook een semi-kwantitatieve analyse uitgevoerd om de specifieke antilichaam-positieve A-bèta-monomer- en oligomeerrijke monsters uit te drukken als een percentage van de controle.
A11-positieve A-bèta-peptiden zijn significant hoger in A-bèta-oligomeerrijke monsters in vergelijking met de monomeren. Integendeel, A-bèta 6E10-positief A-bèta-peptide is aanwezig in zowel de monomer- als oligomeerrijke monsters. In feite worden A-bèta-oligomeren ook geco-incubeerd met curcumin en A-bèta-oligomeerremmende stof.
Curcumine leidt tot een significante vermindering van de relatieve hoeveelheid A11-positieve A-bèta-oligomeren met verminderde A11-kleuring in de curcumin-geco-incubeerde A-bèta-oligomeermonsters. Verschillende concentraties curcumin hebben echter geen invloed op het aantal A-bèta-peptiden in de 6E10-positieve monomer- en oligomeerrijke monsters in vergelijking met A11-positieve monsters. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in enkele uren worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers om kandidaten voor geneesmiddelen voor neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer te verkennen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u A-bèta-oligomeer kunt bereiden en de hoeveelheid ervan kunt evalueren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de preparatie van Aβ-oligomeren uit een synthetisch peptide in vitro en de evaluatie van de relatieve hoeveelheden middels dot blot-analyse. Deze methode is eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar, waardoor deze essentieel is voor neurofarmacologisch onderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neurofarmacologie
- Biochemie
Achtergrond
- Aβ-oligomeren zijn betrokken bij neurodegeneratieve ziekten.
- Inzicht in hun vorming is cruciaal voor de ontwikkeling van therapeutica.
- Huidige methoden voor het prepareren van deze oligomeren kunnen complex zijn.
- Dit protocol heeft tot doel het proces voor onderzoekers te vereenvoudigen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bereiden van Aβ-oligomeren.
- Om de evaluatie van oligomeerconcentraties te vergemakkelijken.
- Om de reproduceerbaarheid in neurofarmacologische experimenten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Aanpassen van de A-beta monomeerconcentratie naar 0,25 mg/mL.
- Indampen van de oplossing met hoogzuiver stikstofgas.
- Monitoren van de effecten van HR5P op de vorming van oligomeren.
- Gebruik van dot blot-analyse voor evaluatie.
Belangrijkste resultaten
- De methode produceert succesvol Aβ-oligomeren.
- Dot blotting-analyse kwantificeert de hoeveelheden oligomeren effectief.
- De aanwezigheid van HR5P beïnvloedt de vorming van oligomeren significant.
- Het protocol vertoont een hoge betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid.
Conclusies
- Dit protocol vereenvoudigt de preparatie van Aβ-oligomeren.
- Het biedt een waardevol instrument voor neurofarmacologisch onderzoek.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze betrouwbare methode.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Betrouwbare preparatie en kwantificering van A11-positieve β-amyloïde oligomeren zijn cruciaal voor de validatie van targets in vroege stadia van neurodegeneratie en voor het screenen van inhibitoren in onderzoek naar de ziekte van Alzheimer. Dit protocol maakt de reproduceerbare generatie en semi-kwantitatieve beoordeling van toxische oligomere species mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij het testen van therapeutische hypothesen. De methode richt zich direct op een sleutelmoment voor mechanische risicoreductie en portfolio-triage in neurofarmacologische R&D.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar de vorming van β-amyloïd oligomeren als mechanistische drijfveer in de pathologie van de ziekte van Alzheimer mogelijk.
- Ondersteunt de functionele validatie van neurotoxische species met behulp van de specificiteit van het A11-antilichaam.
- Faciliteert het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen die gericht zijn op de inhibitie van oligomeren.
- Biedt een reproduceerbare workflow voor de vergelijkende analyse van kandidaat-inhibitoren.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde oligomeerrijke monsters voor voor downstream inhibitor-screeningcampagnes.
- Levert semi-kwantitatieve dot blot-resultaten voor gestandaardiseerde assay-readouts.
- Maakt reproduceerbare detectie van A11-positieve oligomeren mogelijk voor de evaluatie van verbindingen.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform in screening-pipelines voor neurodegeneratie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stelt in vitro oligomeerkarakterisering in overeenstemming met ziekterelevante neurotoxische species.
- Biedt continuïteit van validatie in de ontdekkingsfase naar preklinische beoordeling van inhibitoren.
- Maakt risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van kandidaatmoleculen mogelijk op basis van mechanistisch bewijs.
- Ondersteunt de translationele biomarkerontwikkeling voor interventies gericht op oligomeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, waardoor robuuste hypothesetoetsing en assay-ontwikkeling voor portfolio's gericht op neurodegeneratieve ziekten mogelijk worden.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische validatie van de toxiciteit van β-amyloïde oligomeren en de effecten van inhibitoren.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, semi-kwantitatieve dot blot-resultaten voor workflows voor het screenen van verbindingen.
- Analytics: Maakt comparatieve kwantificatie van A11- en 6E10-positieve species mogelijk voor datagestuurde besluitvorming.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro oligomeerbeoordeling met ziekterelevante neurotoxiciteitsmodellen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een reproduceerbaar, schaalbaar protocol voor doorlopende onderzoeksinitiatieven naar neurodegeneratie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en mechanistische risicoreductie voor de ziekte van Alzheimer.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare preparatie en kwantificering van oligomeren.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van robuuste inhibitor-screening.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutische kandidaten voor neurodegeneratie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de behandeling van peptiden en immunodetectietechnieken.
- Toegang tot dot blotting-instrumentatie en chemiluminescentie-beeldvormingssystemen is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare monstervoorbereiding en analyse.
- Aanpasbaar aan verschillende inhibitor-kandidaten en oligomere peptide-systemen.
- Afhankelijk van de antilichaamspecificiteit en de beperkingen van semi-kwantitatieve analyse.
