Name: A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Leer de bereiding van Aβ-oligomeren uit synthetische peptiden en hun evaluatie met dot-blotting-analyse. Deze betrouwbare methode is essentieel voor neurofarmaceutisch onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (U1503223, 81673407, 21475131), het onderzoeksproject toegepast op non-profitorganisatie technologie van de provincie Zhejiang (2016C 37110), het Ningbo International Science en technologie Samenwerkingsproject 2014D 10019, de Ningbo gemeentelijke innovatie Team van Life Science en gezondheid (2015C 110026), de Ningbo Sci & Tech Project voor gemeenschappelijke rijkdom 2017C 50042, de Li Dak som Yip Yio kin Kenneth Li Marine biofarmaceutische Ontwikkelingsfonds, en het Fonds K. C. Wong Magna Ningbo Universiteit.

1. oplossing voorbereiding
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor reagens bronnen.
<ol><li>Bereid een 5% bovien serumalbumine (BSA) oplossing door 5 g BSA tot 100 mL van tweemaal gedestilleerd water toe te voegen. Meng ze volledig door vortexing hen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	<li>Bereid een anti-oligomeren antilichaam A11 oplossing (1:1, 000) door toevoeging van 10 µL van de stockoplossing van antilichaam aan 10 mL van de oplossing van 5% BSA. Meng ze volledig door vortexing hen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	<li>Bereid een anti-Aβ antilichaam 6E10 oplossing (1:1, 000) door toevoeging van 10 µL van de stockoplossing van antilichaam aan 10 mL 5% BSA oplossing. Meng ze volledig door vortexing. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	<li>Bereid een (1:1, 000) van de antilichaam OC-oplossing in anti-fibrillar oligomeren door 10 µL van de stockoplossing van antilichaam aan 10 mL 5% BSA oplossing toe te voegen. Meng ze volledig door vortexing. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	<li>Bereid een Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) stamoplossing door 24 g voor Tris base en 88 g NaCl aan 1000 mL tweemaal gedestilleerd water toe te voegen. Breng de pH op 7.4. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 3 maanden.</li>
	<li>Bereiden een Tris-gebufferde zoutoplossing en oplossing van Tween-20 (TBST) door toevoeging van 1 mL van Tween-20 tot 100 mL van TBS voorraad en 900 mL tweemaal gedestilleerd water.</li>
	<li>Bereid een secundair antilichaam-oplossing door toe te voegen 10 µL van mierikswortel peroxidase (HRP) geit anti-konijn IgG (H + L) tot 10 mL van oplossing van TBST. Meng ze volledig door vortexing hen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	<li>Los 3.68 g curcumine in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) vormen een stockoplossing 10-mM curcumine.</li>
	<li>Los 5 mg van synthetische Aβ1-42 in 2 mL zuiver 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) vormen een 2,5 mg/mL Aβ monomeer oplossing. Plaats het op kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 20 min. maken 100 µL aliquots en bewaren bij-20 ° C voor maximaal 6 maanden. Opmerking: Deze procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. De pipet tips zou worden afgesneden om ervoor te zorgen nauwkeurige pipetteren.</li>
	<li>Bereid electrochemiluminescence (ECL) vloeistof door het mengen van ECL vloeistof A en B met een volumeverhouding van 1:1. Deze oplossing moet net vóór gebruik worden bereid.</li>
</ol>2. de monstervoorbereiding
Opmerking: Voer de monsterverwerking 2 dagen vóór de stip bevlekken analyse.
<ol><li>Voeg 900 µL van tweemaal gedestilleerd water tot een koker van Aβ1-42 monomeer oplossing; de concentratie van Aβ1-42 zullen 0,25 mg/mL. Plaats het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Damp de oplossing met hoge zuiverheid stikstofgas totdat het volume ongeveer 850 µL is. De concentratie van de oplossing van de1-42 Aβ zal gaan over 0.29 mg/mL. Opmerking: De oplossing moet van tijd tot tijd geschud worden om dat de HFIP volledig is verdampt. Normaal gesproken is het volume van de resterende oplossing na 30 min van verdamping, ongeveer 850 µL.</li>
	<li>Verdun de curcumine stockoplossing om een werkoplossing curcumine (0.2 en 2 µM) met tweemaal gedestilleerd water. Meng de Aβ1-42oplossing en de curcumine werkoplossing met een volumeverhouding van 1:1. De eindconcentraties van curcumine zullen 0,1 en 1 µM. Opmerking: Potentiële oligomeren remmers kunnen gemengd worden met de oplossing1-42 Aβ in verhouding indien nodig.</li>
	<li>Schud de oplossing voortdurend in een magnetische roerder (Zie Tabel van materialen).<ol>
<li>Fix het plastic scheidingslijn voor de magnetische roerder. Plaats 2 magnetische roer bars op 2 hoeken van het vak en plaatsen van de buizen van het monster in het midden van het vak.</li>
		<li>Schud het vak bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 48 uur. Opmerking: De snelheid van de magnetische roerder is ongeveer 60 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer de buizen voor 15 min bij 4 ° C en 18.000 x g. verzamelen het supernatant.</li>
</ol>3. dot bevlekken analyse
Opmerking: Alle incubations worden uitgevoerd op een horizontale shaker.
<ol><li>Membraan van het nitrocellulose in 1 cm brede repen gesneden. Opmerking: De breedte van het membraan van het nitrocellulose kan worden aangepast volgens de experimentele behoeften.</li>
	<li>Leg 2-µL monsters gelijkmatig op 2 strips (strip 1 en 2) met elk punt interval op 0,5 cm.</li>
	<li>Plaats de strips bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten totdat de druppel op de band droog is.</li>
	<li>Incubeer de strips met een oplossing van 5% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel de strips met een oplossing van TBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De oplossing van TBST gecombineerd. Gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, Incubeer 1 strip met een anti-oligomeren antilichaam A11 oplossing en strippen van 2 met een anti-Aβ antilichaam 6E10 oplossing.</li>
	<li>Spoel de strips met een oplossing van TBST driemaal, telkens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De oplossing van TBST gecombineerd. Incubeer de strips met een secundair antilichaam oplossing voor 40 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel de strips met een oplossing van TBST driemaal, telkens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Toepassing de gemengde ECL vloeistof gelijkmatig op het oppervlak van de strips. De strips in een automatische Chemoluminescentie imaging systeem bloot (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Normaal, 300 µL van ECL vloeistof is genoeg voor één membraan. Het membraan moet vochtig worden bewaard tijdens de blootstelling. De belichtingstijd wordt automatisch berekend door het imaging systeem.</li>
	<li>Maak een analyse van de grijswaarden met ImageJ (National Institutes of Health) of een andere beeldverwerking software om semi-kwantitatieve resultaten te verkrijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol hebben we een methode ter voorbereiding van de monsters met Aβ1-42 oligomeren, en voor het analyseren van de hoeveelheid A11-positieve Aβ1-42 oligomeren door een stip bevlekken analyse gemeld. Hoewel onze methoden voor de bereiding van Aβ1-42 oligomeren-rijke monsters vrij eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn, zijn er nog enkele punten om opgemerkt te worden. In de eerste plaats wordt HFIP gebruikt voor het ontbinden van de synthetische Aβ1-42 peptide....

De ziekte van Alzheimer (AD) is een van de belangrijkste neurodegeneratieve ziekten van van oudere mensen wereldwijd1. Het is algemeen aanvaard dat de abnormale aggregatie van β-amyloid (Aβ) de dominante pathologische factor van advertentie kan worden. Aβ aggregaten zijn de belangrijkste onderdelen van de seniele plaques, één van de biologische markers in de hersenen van patiënten van de advertentie. Bovendien produceren Aβ aggregaten, in het bijzonder, met inbegrip van oligomeren potente neurotoxiciteit, die mogelijk de oorzaak van de neuronale dood als AD vordert. Daarom, neurodegeneratie ertoe leiden dat de remming van de vorming van Aβ oligomeren en Aβ oligomeren remmers kunnen worden ontwikkeld als ziekte-aanpassen behandelingen van AD. Vele studies hebben gewend een synthetische Aβ peptide vormen oligomeren in vitro, morphologies en structuren van kunstmatige Aβ oligomeren verkennen en onderzoeken de inhibitors van Aβ oligomeren met behulp van in vitro modellen2,3 , 4. echter verschillende in vitro vorming protocollen van Aβ oligomeren kunnen leiden tot oligomeren met verschillende morfologische kenmerken, die de onvergelijkbare resultaten onder de verschillende onderzoeksgroepen zou kunnen veroorzaken. Een standaard formatie-protocol voor Aβ oligomeren is daarom dringend noodzakelijk.
Tot nu toe niet veel methoden om direct detecteren Aβ oligomeren gemeld. Transmissie elektronische microscopie (TEM), niet-denaturering gelelektroforese enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en stip bevlekken analyse kunnen worden gebruikt om te onderzoeken de hoeveelheid en/of de morfologie van Aβ oligomeren in vitro5, 6. bijvoorbeeld, de morfologie en de structuur van Aβ oligomeren kunnen worden waargenomen in TEM. De relatieve hoeveelheden en moleculaire grootte van Aβ aggregaties kunnen worden afgemeten aan niet-denaturering gelelektroforese. ELISA kan worden gebruikt om te bepalen van Aβ oligomeren in serum, plasma en extracten van hersenweefsel. Tot slot, dot bevlekken analyse, een techniek die wordt gebruikt voor het opsporen, analyseren en identificeren van eiwitten, kan worden gebruikt om de relatieve concentratie van Aβ oligomeren in verschillende monsters met behulp van oligomeren-specifieke en Aβ-specifieke antilichamen. Bovendien biedt een stip bevlekken assay aanzienlijke tijd te besparen, zoals de gelelektroforese van het en de Bevlekkende procedures voor gels niet nodig zijn. Deze bepaling is derhalve normaal scherm potentiële Aβ oligomeren remmers gebruikt. Het algemene doel van dit protocol is voor het beschrijven van een relatief eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode ter voorbereiding van een monster Aβ1-42 oligomeren-rijk, voor het analyseren van de hoeveelheid Aβ1-42 oligomeren met stip bevlekken analyse en scherm Aβ Oligomeer remmers met behulp van semi-kwantitatieve experimentele resultaten.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td><td>Cell&nbsp;Signalling Technology</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&beta;1-42</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Bovine V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Dimethyl sulfoxide</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5&times;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Super low range&nbsp;protein Marker</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Membranes</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue Fast staining solution</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>All - automatic chemiluminescence imaging system</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic agitator</td><td>Shanghai Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van dot bevlekken analyse

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Β-amyloid (Aβ) is een hydrofobe peptide met een intrinsieke tendens u zelf samenvoegen tot aggregaten. Onder diverse aggregaten, Aβ oligomeren algemeen aanvaard wordt als de toonaangevende neurotoxine in de voortgang van de ziekte van Alzheimer (AD) en wordt beschouwd als de cruciale gebeurtenis in de pathogenese van AD. Daarom Aβ oligomeren remmers misschien voorkomen neurodegeneratie en hebben het potentieel om te worden ontwikkeld als ziekte-aanpassen behandelingen van AD. De vorming van de verschillende protocollen van Aβ oligomeren kunnen echter leiden tot oligomeren met verschillende kenmerken. Bovendien, er zijn niet vele methoden om effectief scherm Aβ1-42 oligomeren remmers. Een antilichaam A11 kan reageren met een subset van giftige Aβ1-42 oligomeren met anti-parallel β-sheet structuren. In dit protocol beschrijven we hoe te bereiden een A11-positieve Aβ1-42 oligomeren-rijke monster uit een synthetische Aβ1-42 peptide in vitro en evalueren van relatieve hoeveelheid A11-positieve Aβ1-42 oligomeren in monsters met een dot bevlekken analyse met behulp van de A11 en Aβ1-42-specifieke 6E10 antilichamen. Met behulp van dit protocol, kunnen remmers van A11-positieve Aβ1-42 oligomeren ook worden afgeschermd van de van semi-kwantitatieve experimentele resultaten.

Om te onderzoeken of een Aβ1-42 monomeer een Aβ1-42 oligomeren na voorbereiding kan vormen, werd TEM analyse gebruikt. Geen zichtbare aggregaten werden waargenomen in de HFIP-ontbonden Aβ1-42 monomeer steekproef(Figuur 1). Bovendien voornamelijk bolvormige aggregaten met een diameter van rond 10-80 nm werden waargenomen in de steekproef Aβ1-42 na 48u schudden, suggereren dat Aβ1-42 oligom...

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Aβ oligomeren van een synthetische peptide in vitro en relatieve hoeveelheid Aβ oligomeren evalueren door een stip bevlekken analyse.

A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurofarmacologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar is om beta-amyloïde oligomeer te vormen. We tonen aan dat deze methode cruciaal is omdat de stappen voor het bereiden van beta-oligomeer moeilijk te leren zijn.Stel eerst de concentratie van de A-bèta-monomeroplossing in op 0,25 milligram per milliliter door 900 microliters tweevoudig gedistilleerd water toe te voegen aan de buis. Vervolgens de monomeroplossing blijven verdampen met stikstofgas van hoge zuiverheid tot het volume ongeveer 850 microliters bereikt met een concentratie van ongeveer 0,29 milligram per milliliter. De aanwezigheid van HR5P beïnvloedt de vorming van A-bèta-oligomeer.Daarom is het verdampen zo veel mogelijk een kritische stap in deze procedure. Gebruik vervolgens tweevoudig gedistilleerd water om de curcumin-voorraadoplossing te verdunnen om een werkoplossing van 0,2 en twee micromolar voor te bereiden. Behoud een verhouding van één-op-één en meng de A-bèta-oplossing met curcumin om de uiteindelijke concentratie van curcumin op 0,1 en één micromolar te bereiken.Laat vervolgens de oplossing op een magnetische agitator staan. Bevestig een plastic verdeelbox aan de magnetische agitator. Plaats twee magnetische roerstaven in de twee hoeken van de box en plaats de buizen met de monsters in het midden van de box.Schakel de box 48 uur lang door op kamertemperatuur met 60 omwentelingen per minuut en centrifugeer vervolgens de buis bij 18.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Na centrifugatie wordt de supernatant verzameld. Voor dotbloting-analyse neemt u een nitrocellulosemembraan en snijdt deze in stroken van een centimeter breed, plaats vervolgens twee microliter van het monster gelijkmatig op de stroken een en twee met elk punt op 0,5 centimeter intervallen.Wanneer het monster op het membraan wordt gespoten, is het noodzakelijk om gelijkmatig te verspreiden en de verschillende druppels te regelen, zodat de verschillende monsters niet aan elkaar zijn verbonden. Incubeer vervolgens de stroken gedurende vijf minuten op kamertemperatuur om de druppels te laten drogen. Na vijf minuten incuberen de stroken met 5% bovien serumalbumine gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.Nadat de incubatie is voltooid, spoelt u de stroken gedurende vijf minuten met TBST-buffer. Zuig de buffer af nadat de was is voltooid en incubeer vervolgens strip één met anti-oligomeerantilichaam A11 en strip twee met anti-A-bèta-antilichaam 6E10-oplossing gedurende een uur. Na een uur wast u de stroken met TBST gedurende vijf minuten ieder drie keer, zuig vervolgens de buffer af en incubeer de stroken met secundaire antilichaamoplossing gedurende 40 minuten.Na de incubatie van het secundaire antilichaam wast u de stroken opnieuw met TBST gedurende vijf minuten ieder drie keer. Voeg vervolgens ongeveer 300 microliter gemengde ECL-vloeistof toe aan het oppervlak van de vochtige stroken en stel de stroken bloot in een automatisch chemiluminescentie-beeldvormingssysteem. TEM-studies tonen de afwezigheid van zichtbare aggregaten in de HFIP-opgeloste A-bèta-monomeroplossing, maar na 48 uur incubatie vormen dezelfde monomeren oligomeren, die voornamelijk bolvormige aggregaten zijn met een diameter van 10 tot 80 nanometer.Bij het onderwerpen van de A-bèta-monomer- en oligomeerrijke monsters aan dotbloting-analyse, toont dit de aanwezigheid van A11-positieve A-bèta-oligomeren in A-bèta-oligomeerrijke monsters. Interessant is dat A-bèta 6E10-positieve A-bèta-peptiden aanwezig zijn in zowel de A-bèta-monomer- als oligomeerrijke monsters. Vervolgens wordt ook een semi-kwantitatieve analyse uitgevoerd om de specifieke antilichaam-positieve A-bèta-monomer- en oligomeerrijke monsters uit te drukken als een percentage van de controle.A11-positieve A-bèta-peptiden zijn significant hoger in A-bèta-oligomeerrijke monsters in vergelijking met de monomeren. Integendeel, A-bèta 6E10-positief A-bèta-peptide is aanwezig in zowel de monomer- als oligomeerrijke monsters. In feite worden A-bèta-oligomeren ook geco-incubeerd met curcumin en A-bèta-oligomeerremmende stof.Curcumine leidt tot een significante vermindering van de relatieve hoeveelheid A11-positieve A-bèta-oligomeren met verminderde A11-kleuring in de curcumin-geco-incubeerde A-bèta-oligomeermonsters. Verschillende concentraties curcumin hebben echter geen invloed op het aantal A-bèta-peptiden in de 6E10-positieve monomer- en oligomeerrijke monsters in vergelijking met A11-positieve monsters. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in enkele uren worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers om kandidaten voor geneesmiddelen voor neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer te verkennen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u A-bèta-oligomeer kunt bereiden en de hoeveelheid ervan kunt evalueren.

a11-positive-amyloid-oligomer-preparation-assessment-using-dot

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

SDD-AGE is een nuttige techniek voor de detectie en karakterisering van amyloid-achtige polymeren in de cellen. Hier laten we zien een aanpassing dat maakt deze techniek vatbaar is voor grootschalige toepassingen.

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, eiwit scheiding door SDS-PAGE, antigen retrieval en immunoblotting met een antilichaam tegen het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, wij consequent te sporen monomere en multimere Aß in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

Aptameren zijn korte ribo-/deoxyribo-oligonucleotides geselecteerd...

Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer

This video demonstrates the two-dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis-based separation of amyloid fibers. The technique separates the polymorphic amyloid aggregates based on their heterogeneous size.

Two-Dimensional Semi-Denaturing Agarose Gel Electrophoresis: A Technique to Separate Polymorphic Amyloids Fibers Based on Size Heterogeneity

Eiwitten kunnen ofwel een natuurlijke structuur aannemen ofwel verkeerd vouwen in onoplosbare amyloyde. Omstandigheden die de verkeerd vouwende route bevorderen, leiden tot de vorming van verschillende soorten amyloyde fibrillen. De hier beschreven methoden maken een snelle omzetting van natuurlijke eiwitten in amyloyde in vitro mogelijk.

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

Met behulp van atoomkrachtmicroscopie in combinatie met biopanning-technologie hebben we een negatief en positief biopanning-systeem gemaakt om antilichamen te verkrijgen tegen ziektespecifieke eiwitvarianten die aanwezig zijn in elk biologisch materiaal, zelfs bij lage concentraties. We zijn erin geslaagd om antilichamen te verkrijgen voor TDP-43-eiwitvarianten die betrokken zijn bij Amyotrofe Laterale Sclerose.

Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Eenvoudige methoden beschreven voor het aantonen van de productie van cytotoxische amyloids na infectie van pulmonaire endotheel door Pseudomonas aeruginosa.

Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa

Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Deze biochemische zuiveringsmethode met op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyse vergemakkelijkt de robuuste karakterisering van amyloïde fibrilkernen, wat de identificatie van doelen voor het voorkomen van de ziekte van Alzheimer kan versnellen.

Biochemische zuivering en proteomische karakterisering van amyloïde fibrilkernen uit de hersenen

Hier presenteren we een protocol om globale m⁶A-niveaus semi-kwantitatief te beoordelen met behulp van dot blot. Totaal RNA wordt geëxtraheerd, gedenatureerd, op een nylonmembraan gespoten, onderzocht met anti-m⁶A-antilichaam en visualiseerd door chemiluminescentie. Signaalintensiteit, gekwantificeerd met ImageJ grijswaardenanalyse, weerspiegelt de relatieve methylatie-abundantie en biedt een reproduceerbare workflow voor onderzoek.

Dot Blot-assay voor het detecteren van globale N 6-methyladenosine RNA-modificatieniveaus

Leer de bereiding van Aβ-oligomeren uit synthetische peptiden en hun evaluatie met dot-blotting-analyse. Deze betrouwbare methode is essentieel voor neurofarmaceutisch onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

Meer video's verkennen