Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

Deze methode zou kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het pancreasgebied door deze pancreatoïden te gebruiken om te begrijpen hoe endocriene cellen zich vormen in een architectonisch en cellulair complexe omgeving. Het grote voordeel van deze techniek is dat de pancreatoïden endocriene cellen ontwikkelen door de opname van het omringende mesenchym. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn bij deze methode worstelen omdat de pancreas erg klein is op e10.5.

En de dissectie is cruciaal voor de vorming van pancreatoïden om voldoende niet-besmettend weefsel te krijgen. Om de dissectie voor te bereiden, vul een emmer met ijs en plaats een container met fosfaat gebufferd zoutoplossing in het ijs. Reinig twee fijne pincetten en dissectiescharen met 70% ethanol.

Bij de dissectiezone zet je een container met minimaal drie borosilicaat capillaire buisjes, een aansteker en gefilterde 1000 microliter pipet tips. Pipet vervolgens minimaal één milliliter van 1,25 milligram per milliliter koude dispase verdund in gesteriliseerde water in het tweede putje van een 12-putjesplaat op ijs. Pipet PBS in het eerste, derde en vierde putje van de 12-putjesplaat.

Pipet ook één milliliter van 0,05% trypsine in een 1,5 milliliter buisje op ijs. Nadat je e10,5 zwangere muizen hebt geëuthanaseerd in overeenstemming met IACUC-richtlijnen, spuit je de buik met 70% ethanol om het gebied te reinigen. Maak vervolgens een V-vormige incisie in het genitale gebied van de muis met behulp van een schaar en pincetten en verleng de incisie tot aan het middenrif.

Verwijder voorzichtig de baarmoeder door een incisie te maken in de bovenste laterale delen van de baarmoeder, het orgaan omhoog weg van de muis te trekken en deze incisie door te laten lopen naar het genitale gebied voordat je hetzelfde doet aan de andere kant. Plaats de verwijderde baarmoeder in een 10 centimeter petrischaal met de koude PBS. Plaats onder een licht dissectiemicroscoop de petrischaal en open voorzichtig het baarmoederweefsel door twee pincetten tussen elke embryo te plaatsen en weefsel van de dooierzak te pellen.

Breng de embryo's over door het dooierzakje voorzichtig met pincetten vast te pakken en ze in een 10 centimeter petrischaal met vers, koude PBS te plaatsen. Plaats de petrischaal op ijs. Plaats vervolgens meerdere PBS-druppels op het deksel van de 10 centimeter petrischaal.

Gebruik deze druppels om het embryo tijdens de dissectie over te brengen terwijl extra-embryonale weefsels worden verwijderd om zichtbaarheid te garanderen. Breng een embryo over naar een PBS-druppel en verwijder het voorzichtig uit het dooierzakje met behulp van pincetten terwijl de resterende embryo's in PBS op ijs blijven. Verwijder het hoofd voordat je het embryo naar een nieuwe PBS-druppel verplaatst met behulp van pincetten om het embryo lichtjes te scheppen zonder het weefsel te beschadigen.

In een nieuwe PBS-druppel verwijder je de vier ledemaatknoppen met behulp van pincetten. Plaats de pincetten in de opening waar de ledemaatknop aanwezig was en scheur voorzichtig alleen het meest externe weefsel anterieuraal. Draai het embryo en herhaal in de posterieure richting, stoppend bij de achterste ledemaatknop.

Op dit punt zou het maagdarmkanaal zichtbaar moeten zijn. Het achterste gebied van het maagdarmkanaal heeft een lichte bocht;plaats pincetten achter deze bocht in de opening tussen het maagdarmkanaal en het spinale gebied aan de lichaamswand. Ontkoppel het maagdarmkanaal, werk langzaam omhoog tot het meest anterieure gebied is bereikt, waar het hartgebied zich aansluit.

In de volgende stappen is het van cruciaal belang om het omringende weefsel in de cultuur te vermijden, zodat de pancreatoïden niet worden besmet met niet-pancreatisch weefsel. Als je echter niet de hele pancreasknop grijpt, zullen het aantal en de grootte van de pancreatoïden worden aangetast. Breng het maagdarmkanaal over naar de verse PBS-druppel.

Verwijder verder het buitenste weefsel rond het maagdarmkanaal. Zodra dit buitenste weefsel is verwijderd, kan de pancreasknop worden gevisualiseerd posterieur aan de leverknoppen, tussen de maag en de darm. Neem vervolgens pincetten en knijp voorzichtig in het weefsel onder de uitstaande knop in de darm en til de pancreasknop lichtjes op.

Na het knijpen in het gebied waar de knop zich verbindt met de darm, wordt de knop gescheiden. Was eenmaal in een nieuwe PBS-bubbel voordat je de knop overbrengt naar het eerste putje van de 12-putjesplaat en koude PBS op ijs. Herhaal totdat alle knoppen van de embryo's zijn verzameld en in het eerste putje van de 12-putjesplaat zijn geplaatst.

Plaats vervolgens de 12-putjesplaat onder de lichte dissectiemicroscoop. Tel het aantal pancreasknoppen dat succesvol is gedissecteerd om later de splitsingsverhouding te berekenen. Plaats een gefilterde 1000 microliter pipettip in de pipet met de capillaire buis eraan bevestigd.

Ontsmet de capillaire buis met vuur en maak een bocht in de buis voor gebruiksgemak. Gebruik de capillaire buis om de knoppen over te brengen naar het tweede putje met koude dispase-oplossing gedurende twee minuten voordat je ze overbrengt naar het derde putje met schone PBS. Pipet de knoppen op en neer en breng ze over naar het vierde putje met schone PBS.

Ten slotte, gebruik de capillaire inrichting om de knoppen over te brengen naar de 1,5 milliliter buis met 0,05% trypsine. Plaats de buis in de voorverwarmde 37 graden Celsius shaker en schud gedurende vier tot vijf minuten op 1.500 RPM. Nadat je ongeveer 10 seconden hebt gevormd, plaats je de buis onmiddellijk in de centrifuge en draai je gedurende vijf minuten op 200g.

Verwijder voorzichtig alle oplossing behalve ongeveer 50 microliter om de gecentrifugeerde cellen niet te verstoren. Voor elke knop