Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Het algemene doel van deze techniek is om de betrokkenheid van individuele mRNA's bij polysomen tijdens translatie te bestuderen. Polysoomprofilering is een krachtige technologie om de betrokkenheid van mRNA met ribosomen en polysomen te bestuderen. De techniek is belangrijk voor onderzoek naar regulatie van eiwitsynthese, activering van translatie en repressie.

Hier presenteert ons team de technieken voor polysomale fractievoorbereiding en analyse van fracties op het voorbeeld van drie organismen. Parasiet Leishmania major, gekweekte menselijke cellen en een dierlijk weefsel. Deze aanpak bestaat uit vier grote stappen, lysaatvorbereiding, bereiding van sucrosegradiënt en ultracentrifugering, polysoomfractievoorbereiding en monsterverzameling.

Analyse van de fracties. Cellen uit verschillende bronnen worden verzameld, gewassen en gelyseerd in lyseringsbuffer door passage door een naald of Dounce homogenisator. Centrifugatie wordt gebruikt om celresten te verwijderen en het lysaat te klaren.

Een continue sucrosegradiënt wordt gevormd door het mengen van 10% en 50% sucrose-oplossingen in een gradiëntmaker. Lysaat wordt op de bovenkant van de gradiënt geladen. Ultracentrifugering scheidt mRNA's geassocieerd met een verschillend aantal ribosomen.

Dit wordt gemonitord door een UV-detector tijdens fractievoorbereiding, waardoor verschillende absorbantiespectrummen worden gevormd. Lysaatvorbereiding. Er zijn enkele verschillen in de voorbereiding van het lysee, afhankelijk van de bron.

Na de voorbereiding van het lysee zijn de procedures identiek, ongeacht de oorsprong van het monster. Leishmania major Cytoplasmatisch Lysaatvorbereiding. Plaats Leishmania major cellen in 30 milliliter medium met een dichtheid van 100.000 cellen per milliliter.

Deze stap wordt uitgevoerd in een bioveiligheidskast. Plaats de flacon met Leishmania-cultuur in de incubator en laat de cellen groeien bij 27 graden Celsius, tot de logaritmische fase. Dit duurt meestal ongeveer twee dagen.

Leishmania major cellen zijn gemakkelijk zichtbaar onder de microscoop. Voeg Cycloheximide toe aan de gekweekte Leishmania-cultuur tot een uiteindelijke concentratie van 100 microgram per milliliter, om ribosomen op getransleerde mRNA's te arresteren. Plaats de cellen terug in de incubator gedurende tien minuten bij 27 graden Celsius.

Nadat de cycloheximide-behandeling is voltooid, breng je cellen over naar een 50 milliliter conische buis en centrifugeer het 1.800 g gedurende 8 minuten. Gooi het supernatant weg. Was de cellen met 30 milliliter pbs en centrifugeer.

Gooi het supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw in een milliliter pbs. Neem een ​​aliquot van de cellen en meng het met de formaldehydeoplossing. Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer.

Breng het gewenste aantal cellen over naar een microfugebuis. Centrifugeer de cellen gedurende 8 minuten bij 1.800 g bij vier graden Celsius. Gooi daarna het supernatant weg.

Suspendeer de cellen in een milliliter lyseerbuffer met proteaseremmers en RNAsin. Breng de cellen drie keer door een 23 gauge naald. Na passage door de naald wordt het lysee transparant.

Centrifugeer gedurende tien minuten bij 11.200 g bij vier graden Celsius om het lysee te klaren. Breng het geklaarde lysee over in een nieuwe microfugebuis en bewaar het op ijs tot ultracentrifugering van de sucrosegradiënt. Cytoplasmatisch lyseevoorbereiding uit gekweekte menselijke cellen.

Laat HeLa-cellen groeien in een grote plaat in de incubator bij 37 graden Celsius, met 5% CO2. Voeg cycloheximide toe aan de gekweekte HeLa-cellen tot een uiteindelijke concentratie van 100 microgram per milliliter om de ribosomen op getransleerde mRNA's te arresteren. Incubeer de cellen gedurende tien minuten bij 37 graden Celsius met 5% CO2.

Zuig het medium af en was de plaat twee keer op ijs met koud pbs. Voeg 500 microliter lyseerbuffer toe aan de plaat en schraap de cellen. Breng de gelyseerd cellen over naar de microfugebuis.

Breng de cellen drie keer door een 23 gauge naald. Centrifugeer gedurende acht minuten bij 11.200 g om het lysee te klaren. Na centrifugatie verplaats de buizen op ijs en breng het supernatant over naar een nieuwe buis.

Neem een ​​aliquot, verdun het en meet de absorptie bij 260 nanometer met behulp van een nanodruppel. Als er meerdere monsters zijn, pas dan de lysaten aan tot dezelfde optische dichtheid en bewaar de monsters op ijs tot ultracentrifugering van de sucrosegradiënt. Cytoplasmatisch lyseevoorbereiding uit muistestis.

Dissecteer de muistestis. Maak een kleine incisie in de tunica albugenia en verzamel de seminifere tubuli van de testis en breng ze over in de conische buis met vijf milliliter pbs. Roer het weefsel krachtig door elkaar.

Laat het weefsel vijf minuten op ijs bezinken. Verwijder de buffer en was het twee keer met pbs. Breng de seminifere tubuli over in een twee milliliterbuis en centrifugeer ze gedurende één minuut bij 500 g.

Verwijder het supernatant. Voeg 500 microliter lyseerbuffer toe aan de tubuli en gebruik een pipet om het weefsel te verstoren. Breng de suspensie over in een kleine volume dounce homogenisator.

Verstoor het weefsel met zeven tot acht slagen van de glazen stamper. Breng het lysee over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer het monster gedurende acht minuten bij 12.000 g bij vier graden Celsius om het lysee te klaren.

Breng het supernatant over in een nieuwe buis en bewaar het op ijs. Ga dan verder met de voorbereiding van de sucrosegradiënt. Sucrosegradiëntvoorbereiding.

Plaats een ultracentrifugebuis in de microblock en trek de lijn langs het bovenste niveau van de block. Breng vervolgens de buis over in een stabiele rek. Neem een ​​tien milliliter spuit met het laagapparatuur bevestigd en vul de spuit met 10% sucrose-oplossing.

Laat het voorzichtig los op de bodem van de ultracentrifugebuis tot de sucrose-oplossing de markering bereikt. Vul een andere spuit met 50% sucrose-oplossing en breng voorzichtig het laagapparaat door de 10% sucrose-laag naar de bodem