Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen
21 juni 2018
Identificatie van genetische varianten bij te dragen tot complexe ziekten bij de mens laat ons toe om nieuwe mechanismen te identificeren. Hier, aantonen wij een multiplex genotypering aanpak aan kandidaat-genen of gene traject analyse die maximaliseert de dekking tegen lage kosten en is vatbaar voor cohort gebaseerde studies.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van klinische diagnostiek en genetica, zoals het detecteren van genetische markers die geassocieerd zijn met ziekteverloop, inclusief het humaan papillomavirus. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een kosteneffectieve, gerichte en tijdbesparende diagnostische methode is. Om deze procedure te starten, reconstrueer eventueel bestelde gelyofiliseerd primers met moleculair gezuiverd water.
Trek de voorwaartse en achterwaartse primers voor elke multiplexed test in een voorraadprimermix, zodat deze elke primer bevat met een concentratie van 0,5 millimolair. Bereid daarna een mastermix voor de PCR zoals beschreven in het protocol. Voeg vier microliter van deze mix toe aan elke put van een 384-puts PCR-plaat, samen met één microliter genomisch DNA met een concentratie tussen de vijf en tien nanogram per microliter.
Dek de plaat af met een plaatdeksel en centrifugeer gedurende 200 keer G gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Voer vervolgens de PCR uit zoals beschreven in het protocol. Laad één microliter van het PCR-product met drie microliter laadbuffer op een 2% agarosegel.
Laat dit draaien op 100 volt gedurende 45 minuten om ervoor te zorgen dat de DNA-amplificatie succesvol was. Bereid vervolgens een SAP-mastermix voor zoals beschreven in het protocol. Voeg twee microliter van de vers bereide SAP-mastermix toe aan elke put van de eerder uitgevoerde PCR-plaat.
Centrifugeer kort gedurende 1.000 keer G gedurende één minuut. Plaats vervolgens de plaat terug in de thermocycler. Laat de thermocycler draaien op 37 graden Celsius gedurende 40 minuten.
En vervolgens op 85 graden Celsius gedurende vijf minuten om het enzym te inactiveren. Bereken vervolgens de verdunningsfactor voor elke primer en combineer de bepaalde volumes van elk om een primerpool te vormen. Voeg water toe om deze pool te verdunnen.
Maak de extensie-mastermix samen voor zowel de high plex-test als de low plex-test, zoals beschreven in het protocol. Voeg twee microliter van de extensie-mastermix toe aan elke put van de plaat, waardoor het totale volume in elke put oploopt tot negen microliter. Centrifugeer kort gedurende 1.000 keer G gedurende één minuut en plaats vervolgens de plaat terug in de thermocycler.
Voeg daarna 16 microliter gedeïoniseerd water toe aan elke put, waardoor het totale volume per put oploopt tot 25 microliter. Breng zes milligram hars gelijkmatig aan op een volledige kuilplateau. Laat het hars gedurende 20 minuten op kamertemperatuur drogen.
Breng vervolgens het hars aan op de reactieplaat. Gebruik een suspensiemixer om de plaat gedurende vijf minuten op lage snelheid bij kamertemperatuur te draaien. Centrifugeer vervolgens de plaat gedurende 3.200 keer G gedurende vijf minuten om te voorkomen dat het hars op de massaspectrometerchip wordt aangebracht.
Upload het steekproeflatout van de plaat naar de software-interface van het systeem. Gebruik een doseersysteem om het genotyperings-analytmengsel van de plaat op de genotyperingchip aan te brengen. Laad het chip in het MALDI-TOF-systeem om de massaspectrums van het analytmengsel te genereren en interpreteer het met behulp van de software-interface van het platform.
In deze studie wordt multiplex-genotypering uitgevoerd met behulp van massaspectrometrie. Representatieve SNP-gegevens worden gegenereerd en geanalyseerd voor het kandidaatgen IL13 in een ontdekkingsklinische cohort, fenotypeerd voor voedselallergie. Eén variant, rs1295686, is geassocieerd met voedselallergie die door uitdaging is bewezen.
Deze associatie wordt bevestigd in een replicatiecohort met behulp van de multiplex-genotyperingsaanpak die in dit protocol is aangetoond. Een meta-analyse van de resultaten van de twee cohorten levert sterk bewijs op voor de associatie tussen IL13 en FA. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om geen monsters of reagentia te besmetten. Het is ook belangrijk om een extra 10% mastermix voor te bereiden voor elke PCR om rekening te houden met eventuele pipettingsfouten.
Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden zoals real-time PCR worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of genexpressie correleert met de geïdentificeerde ziekte-geassocieerde genetische markers. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van klinische diagnostiek en genetica om ziekteassociaties in patiëntencohorten te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met genotyperingsreagentia en het MALDI-TOF-systeem gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een multiplex genotyperingsmethode voor de analyse van kandidaatgenen die gerelateerd zijn aan complexe menselijke ziekten. De methode is kosteneffectief en geschikt voor cohortstudies, waardoor de detectie van genetische markers geassocieerd met ziekte-uitkomsten wordt verbeterd.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Genetica
- Klinische diagnostiek
- Pathogeendetectie
Achtergrond
- De identificatie van genetische varianten helpt bij het begrijpen van ziektemechanismen.
- Kostenbeheersbare methoden zijn cruciaal voor grootschalige studies.
- Multiplex genotyping kan de diagnostische efficiëntie verbeteren.
- Het humaan papillomavirus is een voorbeeld van een doelwit voor de detectie van genetische markers.
Doel van de studie
- Om een multiplex genotyperingsmethode te ontwikkelen voor de analyse van kandidaatgenen.
- Om de dekking te maximaliseren en tegelijkertijd de kosten te minimaliseren.
- Om cohortgebaseerde studies in de genetica te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Reconstitutie van geliofyliste primers met water van moleculaire graad.
- Bereiding van een voorraadprimer-mix met een concentratie van 0,5 millimolair.
- Bereiding van de mastermix voor PCR volgens het beschreven protocol.
- Gebruik van een 384-well PCR-plaat voor analyse van genomisch DNA.
Belangrijkste resultaten
- De methode bleek efficiënt bij het detecteren van genetische markers.
- De kosteneffectiviteit werd gevalideerd door middel van praktische toepassing.
- Er werd een tijdsbesparing opgemerkt in het diagnostische proces.
- Succesvolle toepassing bij de detectie van het humaan papillomavirus.
Conclusies
- De multiplex-genotyperingsaanpak is een waardevol instrument in de genetica.
- Het biedt een kader voor toekomstige studies naar complexe ziekten.
- Verder onderzoek zou de toepassingen ervan in de klinische diagnostiek kunnen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Multiplexe genotypering met massaspectrometrie maakt kosteneffectieve high-throughput analyse van genetische varianten in klinische cohorten mogelijk, wat doelwitvalidatie in onderzoek naar complexe ziekten ondersteunt. Deze benadering vergroot het voorspellende vertrouwen door kandidaatloci zoals IL13 te koppelen aan fenotypische uitkomsten zoals voedselallergie via statistisch robuuste associatiestudies. Hiermee wordt genetische screening gepositioneerd als een schaalbare ontdekkingstool voor het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen in vroege R&D-pipelines.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door associaties tussen genetische varianten en ziektefenotypen in klinisch relevante cohorten te testen.
- Operationele waarde: Maakt gelijktijdige analyse van maximaal 40 SNP's per assay mogelijk, wat de efficiëntie bij targetvalidatie op pathway-niveau verhoogt.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's voor IL13 als therapeutisch target door middel van replicatie en meta-analyse van genotype-fenotype associaties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van koppingsonbalans om de genomische dekking te maximaliseren met een minimale selectie van SNP's, waardoor de efficiëntie van het assay-ontwerp wordt verbeterd.
- Operationele waarde: De MALDI-TOF-uitlezing levert kwantitatieve genotyperingsgegevens met een hoge resolutie die geschikt zijn voor geautomatiseerde analysepijplijnen.
- Schaalbaarheid: Het 384-well PCR-formaat maakt een hoge doorvoersnelheid van monsters mogelijk voor screeningscampagnes op cohortbasis.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt genetische bevindingen in menselijke cohorten met functionele validatiepaden, wat de selectie van targets die zijn afgestemd op biomarkers ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Replicatie in onafhankelijke cohorten vergroot het vertrouwen voor de overgang van ontdekking naar preklinische investering.
- Mechanistisch Inzicht: Maakt vervolgstudies mogelijk (bijv. correlatie van genexpressie) om de biologische mechanismen achter genetische associaties te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van genetische screening naar lead-identificatie, waarbij genetisch gestratificeerde cohorten worden geleverd voor downstream target-validatie en compound-screening.
- Discovery Biology: Test genetische hypothesen in gefenotypeerde klinische cohorten om ziekte-geassocieerde pathways te verduidelijken en targets te prioriteren.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare genotypedata die een betrouwbare stratificatie van monsters voor functionele assays mogelijk maakt.
- Analytics: Levert genotype-calls met een hoge betrouwbaarheid en kwaliteitscontroledrempels, ter ondersteuning van statistische vergelijkingen tussen condities en cohorten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt menselijke genetische bevindingen met preklinische validatie door varianten met een sterke fenotypische associatie te identificeren.
- Enterprise hergebruik: Het ontwerp van multiplex assays is aanpasbaar voor verschillende genen en ziekten, wat investeringen op platformniveau in genotyping-infrastructuur ondersteunt.
Operationele en Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets via statistisch onderbouwde genetische associaties in klinisch relevante populaties.
- Operationele waarde: Verlaagt de kosten per monster via multiplexing en stroomlijnt de workflow met geïntegreerde PCR, extensie en MALDI-TOF-detectie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door menselijk genetisch bewijs te leveren dat de selectie van targets in een vroeg stadium van de pipeline ontkoppelt van risico's.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van replicatie en effectgrootte in cohortstudies.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het ontwerp van genetische assays, PCR-optimalisatie en de interpretatie van MALDI-TOF-gegevens.
- Afhankelijk van toegang tot massaspectrometriesystemen met multiplex-mogelijkheden en gevalideerde genotyperingssoftware.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor monsterbehandeling en kwaliteitscontrole om reproduceerbaarheid tussen locaties of batches te garanderen.
- Aanpassing aan nieuwe targets vereist SNP-selectie op basis van LD en compatibiliteitstesten voor multiplex-primers.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid voor de DNA-kwaliteit van het monster en de noodzaak voor zorgvuldige behandeling van reagentia om contaminatie te voorkomen.
