Een In Vitro Model voor het bestuderen van het Effect van Fotodynamische therapie 5-Aminolevulinic Zuur-gemedieerde op Staphylococcus aureus Biofilm
16 april 2018
Dit manuscript beschrijft een protocol om te bestuderen van de antimicrobiële werking van 5-aminolevulinic zuur-gemedieerde Fotodynamische therapie (PDT-ALA) op een biofilm Staphylococcus aureus . Dit protocol kan worden gebruikt om een in vitro model om te bestuderen van de behandeling van bacteriële biofilms met PDT in de toekomst te ontwikkelen.
Het algemene doel van dit experiment is om het antimicrobiële effect van vijf-aminolevulinezuur of ALA-gemedieerde fotodynamische therapie op een Staphylococcus aureus biofilm te evalueren. Deze methode kan cruciale vragen beantwoorden in het veld van bacteriële biofilms over hoe fotodynamische celreparatie kan worden gebruikt als een alternatieve behandeling voor het bestrijden van biofilm-infecties. Een voordeel van deze procedure is dat het potentieel heeft om voor andere bacteriën te worden gebruikt met minimale aanpassingen.
Om een biofilm te genereren in een 96-wellsplaat, incubeer eerst een min achttig graden Celsius ThOD Staphylococcus aureus USA driehonderd in drie biofilmvormende klinische stamculturen in afzonderlijke 14 milliliter ronde bodembuizen met vijf milliliter tryptone soja bouillon, of TSB, medium, in een 37 graden Celsius incubator met schudden gedurende de nacht. Wanneer de culturen de stationaire fase hebben bereikt, centrifugeer de bacteriële cellen en suspendeer de pellets opnieuw in PBS tot een concentratie van twee maal 10 tot de negende kolonievormende eenheid per milliliter. Verdun deze bacteriële suspensies in een verhouding van een tot 200 en TSB medium aangevuld met 0,5 procent glucose en zaai 200 microliters bacteriële cellen per put in drie putjes per stam per experimentele groep in een polystyreen celcultuurbehandelde 96-wells microplaat voor een 24 uur durende incubatie bij 37 graden Celsius, met zuurstof, zonder schudden.
De volgende dag, was de putjes voorzichtig drie keer met PBS zonder de biofilms te verstoren. Voeg vervolgens 200 microliters vers bereid ALA toe aan de geschikte experimentele putjes en plaats de plaat bij 25 graden Celsius gedurende een uur beschermd tegen licht. Bestraal vervolgens de plaat met een lichtemitterende diode met een lichtintensiteit van 100 milliwatt per vierkante centimeter gedurende een uur.
Om het aantal levensvatbare bacteriën per groep aan het einde van de fototherapiebehandeling te tellen, was elke put drie keer voorzichtig met PBS om eventuele niet-adherente cellen te verwijderen. Gebruik vervolgens een pipettentip om de adherante bacteriën van de bodem van elke put te schrapen. Haal de cellen van elke groep in een eppendorfbuisje per experimentele conditie en pellet de cellen door centrifugatie.
Suspendeer de pellets opnieuw in één milliliter 0,25 procent pancreatine enzym en PBS voor een 90 minuten durende incubatie bij 37 graden Celsius, gevolgd door een andere centrifugatie. Suspendeer de pellets opnieuw in 200 microliters PBS en maak een tot 10 seriële verdunningen van elke groep, door vijf microliters van de seriële verdunde monsters toe te voegen op afzonderlijke tryptone soja agar platen. Bepaal vervolgens het aantal bacteriekolonies per groep door de platen 16 uur bij 37 graden Celsius te incuberen.
Om de biofilms te beoordelen door confocale laserscanningmicroscopie genereer en bestraal de biofilms zoals gedemonstreerd. Was de bestraalde biofilms met PBS en kleed de levende en dode cellen met één milliliter van een groen fluorescerende nucleaire en chromosoom procaryotische celmembraan permeabele kleurstof en één milliliter van een micromolaire propidiumjodide oplossing, respectievelijk. Verwijder na 20 minuten de overtollige kleurstof en beeld de biofilms af door confocale laserscanningmicroscopie onder een 63 maal 1.4 NA olie-immersie objectieflens.
De levensvatbaarheid van biofilmbacteriën neemt af na dubbele ALA fototherapiebehandeling in vergelijking met controle-enkelvoudige of niet-behandelde biofilmbacteriële levensvatbaarheid en alle vier de geteste stammen. De visualisatie van de biofilms door confocale laserscanningmicroscopie bevestigt deze bevinding, met de meeste cellen die positief staan voor propidiumjodide in de ALA fototherapie dubbele behandelingsgroep. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de volledige ALA behandelde bacteriemanipulatie in het donker moet worden uitgevoerd en dat de biologische biofilm voorzichtig moet worden behandeld om verstoring van de gevormde biofilm te voorkomen.
Deze boodschap kan worden toegepast om het antimicrobiële effect van fotodynamische therapie op bacteriële biofilm in vitro te onderzoeken door onderzoekers op het gebied van bacteriële infecties.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een protocol om het antimicrobiële effect van fotodynamische therapie gemedieerd door 5-aminolevulinezuur (ALA-PDT) op een Staphylococcus aureus biofilm te bestuderen. Deze methode kan belangrijke vragen in het vakgebied van bacteriële biofilms beantwoorden met betrekking tot alternatieve behandelingen voor het beheersen van biofilm-infecties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Fotodynamische Therapie
- Biofilmonderzoek
Achtergrond
- Staphylococcus aureus is een veelvoorkomend pathogeen dat geassocieerd wordt met biofilm-infecties.
- Fotodynamische therapie (PDT) is een behandeling die gebruikmaakt van lichtgeactiveerde verbindingen om bacteriën te doden.
- 5-aminolevulinezuur (ALA) is een precursor bij de synthese van fotosensibilisatoren die worden gebruikt in PDT.
- Deze studie heeft als doel een in vitro-model te ontwikkelen voor het testen van ALA-PDT op bacteriële biofilms.
Doel van de studie
- Om het antimicrobiële effect van ALA-gemedieerde PDT op Staphylococcus aureus-biofilmen te evalueren.
- Om het potentieel van PDT als alternatieve behandeling voor biofilminfecties te verkennen.
- Om een protocol vast te stellen dat kan worden aangepast voor andere bacteriële stammen.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van Staphylococcus aureus in tryptone soya broth (TSB) voor de vorming van biofilms.
- Incubatie van culturen bij 37 °C om de stationaire fase te bereiken.
- Centrifugatie en resuspensie van bacteriële cellen in PBS.
- Uitplaten van bacteriële cellen in een 96-wells microplaat voor PDT-behandeling.
Belangrijkste Resultaten
- Het protocol genereert succesvol biofilms die geschikt zijn voor het testen van ALA-PDT.
- ALA-PDT vertoonde potentiële antimicrobiële effecten tegen biofilms van Staphylococcus aureus.
- De methode kan met minimale aanpassingen worden aangepast voor andere bacteriële stammen.
- Verdere studies zijn nodig om de behandelingscondities te optimaliseren.
Conclusies
- ALA-PDT is een veelbelovende benadering voor de behandeling van bacteriële biofilms.
- Deze studie biedt een basis voor toekomstig onderzoek naar fotodynamische therapie.
- Inzicht in de mechanismen van PDT kan leiden tot verbeterde behandelstrategieën voor biofilm-gerelateerde infecties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Dit in vitro-model maakt een mechanistische evaluatie mogelijk van fotodynamische therapie (PDT) voor biofilm-geassocieerde infecties, een groeiende uitdaging bij de ontwikkeling van antimicrobiële middelen. Door het kwantificeren van colony-forming units en het visualiseren van de levensvatbaarheid via confocale microscopie, biedt de assay reproduceerbare, kwantitatieve resultaten om de risico's van PDT-kandidaten in een vroeg stadium van de ontdekking te minimaliseren. Het platform ondersteunt targetvalidatie en lead-identificatie voor anti-biofilmstrategieën, wat bijzonder relevant is voor Staphylococcus aureus en andere biofilm-vormende pathogenen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese van de effectiviteit van ALA-PDT tegen S. aureus-biofilms via CFU-reductie en levensvatbaarheidskleuring.
- Operationele waarde: Maakt functionele doelwitvalidatie mogelijk door de activatie van de fotosensibilisator te koppelen aan bacteriedodende mechanismen in een gecontroleerd biofilmmodel.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt preklinische go/no-go-beslissingen door dosis- en tijdsafhankelijke antimicrobiële effecten aan te tonen onder gestandaardiseerde omstandigheden.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert mature, reproduceerbare S. aureus biofilms in 96-well formaat, geschikt voor high-throughput screening van PDT-verbindingen.
- Kwantitatieve output: Levert CFU-tellingen en confocale microscopiedata als orthogonale readouts voor de beoordeling van de potentie van verbindingen en de penetratie in de biofilm.
- Hergebruik van het platform: Aanpasbaar aan andere bacteriële stammen en fotosensibilisatoren met minimale protocolwijzigingen, wat brede toepassingen voor anti-infectieve screening mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert klinisch relevante S. aureus biofilm-infecties, waardoor in vitro bevindingen worden overbrugd naar preklinische validatie van PDT-gebaseerde anti-infectiva.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt het PDT-mechanisme via live/dead-kleuring, waardoor ambiguïteit in de routes van biofilm-eliminatie wordt verminderd.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt beslissingen over verdere ontwikkeling door reproduceerbare gegevens over biofilm-inhibitie te leveren over meerdere stammen en experimentele replica's.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van antibacteriële ontdekking, van targetvalidatie via lead-optimalisatie tot preklinische efficiëntietests, in het bijzonder voor modaliteiten gericht op biofilms.
- Ontdekkingsbiologie: Test mechanistische hypothesen over door PDT geïnduceerde biofilmverstoring en verlies van bacteriële levensvatbaarheid in een fysiologisch relevant model.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde evaluatie van fotosensibilisatoren en lichtdosisparameters voor anti-biofilmactiviteit mogelijk.
- Analytica: Biedt CFU-reductie en op fluorescentie gebaseerde levensvatbaarheidsmetrieken om behandelingscondities te vergelijken en structuur-activiteitsrelaties te sturen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro biofilmremming met preklinische effectiviteitsmodellen via kwantificeerbare, reproduceerbare eindpunten.
- Zakelijke herbruikbaarheid: Vestigt een modulair biofilm PDT-platform dat toepasbaar is op meerdere pathogeentargets en fotosensibilisator-chemotypes.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in PDT-biofilminteracties door directe visualisatie en kwantificering van bacteriële doding.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde, lichtbeschermde workflow met gedefinieerde incubatie-, bestralings- en uitleesstappen voor reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Verbetert het vertrouwen in go/no-go-beslissingen voor PDT-kandidaten door vroege werkzaamheidsgegevens te verschaffen in een klinisch relevant biofilmodel.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van PDT-programma's mogelijk door verbindingen te identificeren met aantoonbare biofilmpenetratie en antimicrobiële activiteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microbiologische technieken, biofilmcultuur en fotobiologische veiligheidsprotocollen.
- Afhankelijk van apparatuur voor gecontroleerde lichtblootstelling (bijv. LED-irradiatiemeter) en fluorescentiemicroscopie of een plaatlezer voor CFU- en beeldmetingen.
- Maakt standaardisatie van de ALA-bereiding, incubatietijden en lichttoediening over experimentele groepen heen noodzakelijk om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Aanpassing aan andere bacteriële stammen kan optimalisatie van de condities voor biofilmvorming en de opname-efficiëntie van de fotosensitizer vereisen.
- Praktische beperking: de gevoeligheid van de biofilm kan variëren afhankelijk van de groeifase en de samenstelling van de matrix, wat zorgvuldige controles vereist voor vergelijkende studies.
