Name: Plant-Microbe interactie: Transcriptionele reactie van Bacillus Mycoides op aardappel wortel exsudaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Ontdek transcriptoomanalyse van Bacillus mycoides in reactie op aardappelwortel-exsudaat. Deze methode identificeert belangrijke bacteriële genen betrokken bij plant-microbe interacties voor landbouwonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jakob Viel voor zijn nuttige opmerkingen en suggesties. Wij danken ook Anne de Jong voor zijn hulp bij de analyse van de bio-informatica. Yanglei Yi en Zhibo Li worden ondersteund door de China Scholarship Raad (CSC). Wij danken NWO-Trekweerstand Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) voor hun financiële steun aan de OPK.

1. het ontkiemen van aardappel in gesteriliseerde voorwaarden
<ol><li>Spoel het oppervlak van de aardappel met steriel water. Baad de aardappel in 70% ethanol en 3% natriumhypochloriet, voor elke 5 min. Spoel het weer met steriel water te verwijderen van alle resterende natriumhypochloriet.</li>
	<li>Bereiden van de materialen die nodig zijn voor het ontkiemen en groeien aardappelknollen; de plastic potten, engraftment manden, vermiculiet, steriliseren en water in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Opmerking: Zorg ervoor dat alle gebruikte materialen autoclaaf zijn. Anders, andere steriliserende methoden gebruiken.</li>
	<li>Zet de aardappel oppervlak-gesteriliseerd in de mand van de engraftment, en plaats dit in een gesteriliseerde met autoclaaf pot met vochtige vermiculiet.</li>
	<li>Houd de pot in een klimaat kamer bij 24 ° C gedurende drie weken. Zet deze dan op de cycli van 16 h van licht (120 µmol m-2s-1) en 8 h van duisternis. Om te voorkomen dat microbiële verontreinigingen, door een grote glazen vezel vak te gebruiken ter dekking van de pot.</li>
</ol>2. het verzamelen van exsudaat van de wortel van de aardappel
<ol><li>Wanneer de scheuten stronk, transfer de mand met de hele aardappel in een gesteriliseerde bekerglas gevuld met 150 mL gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water, met de aardappel knollen geplaatst net boven het wateroppervlak en de wortels in het water ondergedompeld (Zie Figuur 1). Houd de zaailing in de zaal van het klimaat, en dezelfde instellingen gebruiken als voorheen [24 ° C; cycli van 16 h van licht (120 µmol m-2s-1), 8 h van duisternis].</li>
	<li>Vanaf de tweede dag, het water met het exsudaat verzamelen en vullen van het bekerglas af met steriel gedeïoniseerd water. De bemonstering uit te voeren elke dag tot de zevende dag na het overbrengen van de zaailing.</li>
	<li>Opslaan van elk monster afzonderlijk bij 4 ° C. Voor elk monster, verspreid 100 µL op een Luria-Bertani (LB; 1% trypton, gistextract 0,5%, 0,5% NaCl) agarplaat om te controleren op microbiële verontreinigingen. Gooi de verontreinigde monsters.</li>
	<li>Combineer de verzamelde monsters van een zaailing, en concentreren ze door hen te vriesdrogen bij-40 ° C tot een eindvolume van 150 mL.</li>
</ol>3. de groeiende bacteriën
<ol><li>Strijk een stam van B. mycoides uit een voorraad van glycerol-80 ° C op een bord van de agar LB, en na een nacht bebroeden de plaat bij 30 ° C.</li>
	<li>Inoculeer een opgietvloeistof LB met een één kolonie van de plaat, en groeien van de cultuur in een schudden incubator bij 200 rpm's nachts bij 30 ° C.</li>
</ol>4. behandeling en bemonstering van bacteriën
<ol><li>Bereid een reeks van maatkolven met 50 mL LB opgietvloeistof om te vergelijken de groeikromme van de bacteriën die met exsudaat van de wortel getrakteerd op een negatieve controle. Voeg 0,5 mL van de overnachting bacteriecultuur toe aan alle kolven en 0%, 5%, 10% of 15% (v/v) wortel afgescheiden of steriel gedeïoniseerd water toevoegen aan het medium, respectievelijk.</li>
	<li>Een cultuur met gedeïoniseerd water in plaats van wortel exsudaat als een besturingselement gebruiken. Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) elke 1 h daarna. Genereer een groeicurve door het uitzetten van de OD600 waarden tegen de tijd. Opmerking: We zagen dat 10% van de wortel exsudaat niet de groei van B. mycoides beïnvloedde (Zie Figuur 2); deze verhouding was gebruikt voor RNA-seq experimenten.</li>
	<li>Verdun een overnachting B. mycoides cultuur met 90 mL voorverwarmde LB middellange tot de eerste OD600 van ~ 0.05 in een kolf van 300 mL. Voeg 10 mL van exsudaat van de wortel tot de cultuur en Incubeer het bij 30 ° C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Gebruik een 10 mL steriel gedeïoniseerd waterbehandeling als een besturingselement. Verzamelen van cellen uit de cultuur door middel van centrifugeren bij 9000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, en onmiddellijk bevriezen de pellet in vloeibare stikstof, waarna het bij-80 ° C bewaren tot gebruik.</li>
</ol>5. RNA isolatie
Opmerking: Voordat u begint het isolement, bereiden de werkbank, rekken en pipetten door het reinigen met een oplossing van de decontaminatie RNase (Zie Tabel van materialen). Draag handschoenen te allen tijde, en ervoor te zorgen dat alle buizen, tips en oplossingen worden RNase-vrij. Houd altijd de monsters op ijs indien mogelijk.
<ol><li>0,1% (v/v) van diethyl-pyrocarbonate (DEPC) toevoegen aan ultrazuiver water (100 µL van DEPC per 100 mL oplossing), meng het goed en houd het bij kamertemperatuur 's nachts. Autoclaaf dit mengsel aan de inactivering van het DEPC na de nachtelijke behandeling. Dit DEPC-behandelde ultrazuiver water ter voorbereiding van de buffer TE gebruiken [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] en een oplossing van 10% (m/v) SDS.</li>
	<li>Ontdooi de cel pellets op het ijs en schorten elk in 400 µL van buffer TE (DEPC). Breng de schorsingen in 2 mL schroefdop buizen.</li>
	<li>Meng 300 µL van chloroform-Isoamylalcohol (24:1 v/v) en 300 µL van fenol (zure fenol, RNA rang) en laat het mengsel gedurende 5 minuten staan. Nemen 500 µL van de organische bovenste fase toe te voegen aan de geresuspendeerde cellen. Voeg vervolgens 50 µL van 10% SDS en 0,5 g van glaskralen (0,5 µm) in de buis.</li>
	<li>Sluit de dop stevig en plaatst u de buis in een kraal-molen homogenizer (Zie Tabel van materialen). Het uitvoeren van een 3 × 45 s pulse homogenisering met een interval van 1 minuut op ijs.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 11.000 x g (4 ° C), en de bovenste fase overbrengen in een nieuwe buis.</li>
	<li>Vanuit stap 5.5 500 µL van chloroform-Isoamylalcohol (24:1) toevoegen aan de bovenste fase samen en Centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 11.000 x g (4 ° C). Opmerking: De volgende stappen werden gewijzigd vanuit de fabrikant instructie van een commerciële glasvezel filter gebaseerde RNA isolatie kit (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>500 µL van de bovenste fase overbrengen in een verse buis, voeg 2 delen (1 mL) voor een buffer lysis/bindende en meng het door het pipetteren omhoog en omlaag.</li>
	<li>Combineer de filter en collectie buizen (uit de RNA isolatie kit) en Pipetteer het mengsel uit stap 5.7 aan de filter-buis. Centrifugeer de buizen voor 15 s bij 8.000 x g en negeren de doorstroming.</li>
	<li>Bereiden van 1,5 mL microcentrifuge buizen met 100 µL van 10 µL van DNase DNase buffer ik en 5 µL van een RNase-remmer (Zie Tabel van materialen). De bereide oplossing mix toevoegen op het filter van de filter-buis en Incubeer het 20-30 min bij 15-25 ° C.</li>
	<li>Voer de stappen wassen volgens de instructie van de fabrikant. Hiermee kunt u dat 50 µL van een buffer elutie elueer de RNA.</li>
	<li>Sla de eluted RNA bij-80 ° C en zet een plastic paraffine film eromheen. Op hetzelfde moment, door een paar microliters van het monster te overbrengen in een tube microcentrifuge 1,5 mL een kwaliteitscontrole uitvoeren.</li>
</ol>6. RNA kwaliteitscontrole en Sequencing
<ol><li>Controleer de RNA met een spectrofotometer microvolume. Opmerking: De absorptie ratio's op 260/280 moet boven 1.8 en ratio's op 260/230 moet boven ten minste 1,8, bij voorkeur boven 2.0.</li>
	<li>Run de gezuiverde RNA in een geautomatiseerde elektroforese instrument met behulp van de analyse van de RNA aanbevelen kit (Zie Tabel van materialen); het RNA integriteit nummer (RIN) moet ten minste boven 7 om verder te gaan.</li>
	<li>Een totaal bedrag van 3 RNA µg per monster te gebruiken voor het genereren van bibliotheken met een RNA-Seq bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen) na de aanbevelingen van de fabrikant. Opmerking: De bibliotheek voorbereidingen waren sequenced op een high-throughput sequencing platform en gekoppeld-einde leest zijn gegenereerd.</li>
</ol>7. de data-analyse met behulp van de webgebaseerde pijpleiding T-REx
<ol><li>Een kwaliteit filteren met behulp van de FASTX-Toolkit versie 0.0.13 wordt uitgevoerd (Phred kwaliteitsscores van > 20). Snijd de rauwe RNA-Seq leesbewerkingen van de sequenties van de adapter met het hulpprogramma Trimmomatic. Opmerking: Alle downstream analyses werden gebaseerd op schone gegevens met hoge kwaliteit.</li>
	<li>Download de B. mycoides ATCC 6462 NCBI genoomdatabase (NCBI toetreding nr.: CP009692.1) en gebruik het als een referentie-genoom voor het toewijzen van de schone leest met behulp van Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>Gebruik HTSeq v0.6.1 om te tellen de leest nummers toegewezen aan elk gen en het leest per kilobase van afschrift per miljoen toegewezen leest (RPKM) van elk gen op basis van de lengte van de graaf van het gen en leest toegewezen aan dit gen.</li>
	<li>Voor de analyse van de gegevens door de T-REx-pijpleiding, de RPKM-tabel te gebruiken als input, evenals drie beschrijvende bestanden: (i) een bestand van de factoren te beschrijven het experiment in factoren, (ii) een contrasten-bestand om te bepalen welke factoren zullen worden vergeleken voor differentiële genexpressie , en (iii) een klassebestand te beschrijven van groepen genen van belang. Opmerking: De beschrijvende bestanden zijn in.txt formaat. Voorbeelden zijn te vinden op de website van T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Een gedetailleerde instructies voor data-analyse met behulp van de T-REx kan worden gevonden in een eerdere publicatie door de Jong et al. 14.</li>
</ol>

<ol><li>Haichar, F. eZ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%3A+Multidisciplinary+Journal+of+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4395/6/1/19">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19(2016).</li>
<li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li>
<li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116(2012).</li>
<li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807170100102X">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li>
<li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li>
<li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.4141/CJSS08021">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li>
<li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139396001266">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li>
<li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02859887">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li>
<li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0885576503904437">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li>
<li>Peng, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s41348-017-0110-z">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li>
<li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/aab.12245/abstract">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li>
<li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REx%3A+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663(2015).</li>
<li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).</li>
<li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNASwift%3A+a+rapid%2C+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li>
<li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-samtools%3A+Ruby+bindings+for+SAMtools%2C+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+for+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGS-trex%3A+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Plant-microbe interacties hebben zijn hypothetische nader te bepalen door een fijn afgestemde evenwicht tussen bacteriën en planten. Deze interacties zijn zeer complex en moeilijk te bestuderen in een natuurlijk systeem, die bestaat uit diverse microbiële soorten, potentieel hoedanigheid van consortia. Dit document beschrijft een vereenvoudigde protocol om te bestuderen van de bacteriële reactie op wortel exsudaat onder goed gecontroleerde omstandigheden. Het profiel van de transcriptome van rhizobacteria, bij blootstell...

Planten kunnen afgescheiden tot 20% van de koolstof vast tijdens de fotosynthese door wortels in de rhizosfeer1, dat wil zeggen, de smalle zone van de bodem in de buurt van de wortels. Als gevolg van de hogere beschikbaarheid van nutriënten is de rizosfeer een geschikt leefgebied voor verschillende micro-organismen, met inbegrip van plantengroei bevordering van bacteriën. De wortel exsudaat bevatten een aantal anorganische verbindingen als ionen, anorganische zuren, zuurstof en water. De meerderheid van de wortel exsudaat wordt echter gevormd door organische materialen, die kunnen worden onderverdeeld in laag molecuulgewicht verbindingen en ultrahoog moleculair gewicht verbindingen. De laagmoleculaire bestanddelen bevatten aminozuren, organische zuren, suikers, fenolische verbindingen, vetzuren en een array van secundaire metabolieten. De verbindingen van ultrahoog moleculair gewicht bestaan uit mucilage en eiwitten2,3. Rhizosfeer micro-organismen kunnen sommige van deze verbindingen gebruiken als een bron van energie voor groei en ontwikkeling. De wortel exsudaat spelen een belangrijke rol bij het vormgeven van de rhizobacterial Gemeenschap, omdat de plant-geproduceerde verbindingen in het exsudaat het gedrag van de rhizosfeer-geassocieerde bacteriën beïnvloeden kunnen door de expressie van specifieke genen beïnvloeden.
Inzicht in de bacteriële reactie op wortel exsudaat is een belangrijke stap in het ontcijferen van de plant-microbe interactie mechanismen. Zoals de bacteriële reactie op plant-microbe interacties het product van differentiële genexpressie is, kan het worden bestudeerd door transcriptome analyse. Met behulp van deze methode, vastgesteld eerdere studies verscheidene belangrijke genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties. In Pseudomonas aeruginosa, genen die betrokken zijn in het metabolisme, chemotaxis en type II secretie geleerd om te reageren op de bieten wortel exsudaat van4. Sexy et al. 5 studeerde de transcriptomic profilering van B. amyloliquefaciens FZB42 in antwoord op maïs root exsudaat. Hun resultaten tonen aan dat van de genen sterk geïnduceerd door de wortel exsudaat, verschillende groepen bij betrokken zijn in de metabolische banen met betrekking tot het gebruik van de voedingsstoffen, chemotaxis, beweeglijkheid en niet-ribosomal synthese van antimicrobiële peptiden en polyketiden.
De nauwkeurigheid van deze studies, is afhankelijk van de hoeveelheid exsudaat van de wortel. Hoewel verschillende methoden de hoeveelheid exsudaat van de wortel voor verschillende doeleinden beschreven hebben, ze eisen van geavanceerde instrumenten of worden niet uitgevoerd in goed gecontroleerde omstandigheden6,7,8. Bovendien micro-organismen rhizosfeer-remmende invloed kunnen uitoefenen op wortel afgescheiden compositie door het beïnvloeden van de plant cel membraan permeabiliteit en beschadiging van de wortel weefsels, met name in het geval van consortia van micro-organismen9. Bij het onderzoeken van de microbiële reactie op wortel exsudaat, is het belangrijk om duidelijk omschreven Gebruiksvoorwaarden teneinde wijziging van de verbindingen met andere micro-organismen10. Bovendien, kwalitatief hoogwaardige RNA is nodig voor RNA-seq transcriptome studies gebaseerde. Echter, bij de behandeling van niet-model-bacteriële spanningen, de standaard protocollen of commerciële kits hebben meestal een lage efficiëntie als gevolg van onbekende factoren of speciale groei eigenschappen.
Het protocol hier beschreven werd geverifieerd met behulp van B. mycoides, die is een gram-positieve, spore-vormende bacterie van de Firmicute stam. Het is alomtegenwoordig in de rizosfeer van verschillende plantensoorten. Verschillende plant groei bevorderen van eigenschappen zijn gemeld voor deze soorten, waaronder inductie van systematische weerstand (ISR) in suikerbieten11, remming van de demping-off pathogen Pythium voor komkommer12, evenals stikstof fixatie in de rhizosfeer zonnebloem13. De moleculaire mechanismen van de interactie met een waardplant zijn echter niet goed bestudeerd.
Het doel van de experimenten die hier gepresenteerd is om te studeren van de reactie van de transcriptomic van endosphere-geïsoleerde B. mycoides op aardappel wortel exsudaat. Kortom, het protocol bestaat uit de volgende stappen: ten eerste, het verzamelen van exsudaat van de wortel van de aardappel onder steriele omstandigheden. Vervolgens uittreksel kwalitatief hoogwaardige RNA van bacteriecellen behandeld met exsudaat van de wortel. De laatste stap is de analyse van de gegevens met behulp van de web gebaseerde T-REx pijpleiding14. Dit protocol werd gebruikt voor het identificeren van B. mycoides genen die tonen een verschuiving in expressie niveaus bij contact met exsudaat van wortel en aldus een belangrijke rol kunnen spelen in plant-microbe interacties.

<table><tbody><tr><td>natriumhypochloriet</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;CAS: 7681-52-9&nbsp;</td><td>10-15%&nbsp; actief chloor</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) bouillon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glaskralen</td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0,5 &micro;m</td></tr><tr><td>2,0 ml buis met schroefdop</td><td></td><td></td><td>RNase vrij</td></tr><tr><td>1,5 ml en 2,0 ml eppendorf buis</td><td></td><td></td><td>RNase vrij</td></tr><tr><td>Bead mill homogenisator</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td>Mini_beadbeater</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonaat (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS: 151-21-3&nbsp;</td><td>10% oplossing bereid met DEPC behandeld MQ water</td></tr><tr><td>TE-buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td></tr><tr><td>fenol</td><td>Sigma</td><td></td><td>RNA kwaliteit</td></tr><tr><td>chloroform-isoamyl alcohol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>bereid 24:1 van chloroform:isoamyl alcohol, bewaar op kamertemperatuur</td></tr><tr><td>High pure RNA isolatiekit</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>RNase Decontaminatie Oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>Geautomatiseerd elektroforese instrument</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Microvolume spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA kwaliteitsanalyse kit</td><td>Agilent</td><td>RNA 6000 Nano kit&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNase remmer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>Directionele RNA bibliotheek Voorbereidingskit</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>Voor Illumina</td></tr></tbody></table>

plant-microbe interactie: transcriptionele reactie van bacillus mycoides op aardappel wortel exsudaat

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Nuttige plant-geassocieerde bacteriën spelen een belangrijke rol in het bevorderen van de groei en het voorkomen van de ziekte in planten. De toepassing van plant groeibevorderende rhizobacteria (PGPR) als biofertilizers of biocontrol agenten is uitgegroeid tot een effectief alternatief voor het gebruik van conventionele meststoffen en gewas productiviteit tegen lage kosten kan verhogen. Plant-microbe interacties, is afhankelijk van host plant-uitgescheiden signalen en een reactie erop door hun bijbehorende bacteriën. Echter reageren de moleculaire mechanismen van hoe nuttige bacteriën op de bijbehorende plantgerelateerde signalen worden niet volledig begrepen. Beoordeling van de reactie van de transcriptomic van bacteriën op wortel exsudaat is een krachtige aanpak om de bacteriële genexpressie en verordening onder rhizospheric omstandigheden. Deze kennis is noodzakelijk om te begrijpen van de onderliggende mechanismen die betrokken zijn in plant-microbe interacties. Dit witboek beschrijft een gedetailleerd protocol om te bestuderen van de transcriptomic reactie van B. mycoides EC18, een stam die geïsoleerd van de aardappel-endosphere, met exsudaat van de wortel van de aardappel. Met de hulp van recente hoge gegevensdoorvoer sequencing-technologie, kan dit protocol worden uitgevoerd in verschillende weken en produceren enorme datasets. Eerst, verzamelen we de wortel exsudaat onder steriele condities, waarna ze worden toegevoegd aan B. mycoides culturen. RNA van deze culturen is geïsoleerd met behulp van een fenol/chloroform methode in combinatie met een commerciële kit en onderworpen aan een kwaliteitscontrole door een geautomatiseerde elektroforese instrument. Na sequencing, data-analyse wordt uitgevoerd met de web gebaseerde T-REx-gasleiding en een groep van differentially uitgedrukte genen wordt geïdentificeerd. Deze methode is een nuttig instrument om nieuwe ontdekkingen op de bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties.

Plant-geassocieerde micro-organismen kunnen positief beïnvloeden plantengroei en gezondheid. De mechanismen van de complexe interacties tussen planten en hun microbiële symbionten worden echter niet volledig begrepen. Root exsudaat spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de activiteit van de rhizobacterial en het gedrag en het is over het algemeen gepostuleerd dat de microbiële kolonisatie van de wortels met de aantrekkingskracht van microben te wortel exsudaat initieert. Het doe...

Het doel van het hier gepresenteerde protocol is het bestuderen van de reactie van de transcriptomic van endosphere-geïsoleerde Bacillus mycoides op aardappel wortel exsudaat. Deze methode vereenvoudigt de identificatie van belangrijke bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties en is in principe van toepassing op andere endofyten en planten, met kleine aanpassingen.

Plant-Microbe interactie: Transcriptionele reactie van Bacillus Mycoides op aardappel wortel exsudaat

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van plant-microbe interactie. U kunt bijvoorbeeld belangrijke genen identificeren van bacteriestammen die zijn geïsoleerd uit de endosfeer of rizosfeer tijdens de interactie van de bacteriën met de plant. Het is een veelzijdige methode die ook kan worden gebruikt voor studies over andere bacteriën met planten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat in een relatief korte periode een groot aantal bacteriegenen dat belangrijk is tijdens plant-microbe interacties kan worden geïdentificeerd. Om deze procedure te starten, spoelt u het aardappeloppervlak met steriel water. Laat de aardappel vijf minuten in 70% ethanol weken en vervolgens vijf minuten in 3% natriumhypochloriet.Spoel het daarna opnieuw af met steriel water om eventueel achtergebleven natriumhypochloriet te verwijderen. Bereid vervolgens de materialen voor die nodig zijn voor het ontkiemen en kweken van aardappelknollen. Steriliseer de plastic potten, engraftmentmanden, vermiculiet en water door ze 20 minuten bij 121 graden Celsius in de autoclaaf te plaatsen.Vervolgens plaatst u de oppervlakte-gesteriliseerde aardappel in de engraftmentmand en plaatst u deze in een geautoclaveerde pot met nat vermiculiet. Gebruik een grote glazen vezelbox om de pot te bedekken om microbiële besmettingen te voorkomen. Houd de pot drie weken lang in een klimaatkamer op 24 graden Celsius en stel deze in op cycli van 16 uur licht en 8 uur duisternis.Om de aardappelwortelexudaat te verzamelen, wanneer de scheuten ontspruiten, brengt u de mand met de hele aardappel over in een gesteriliseerde beker gevuld met 150 milliliter autoclaveerd gedeïoniseerd water, waarbij de aardappelknollen net boven het wateroppervlak worden geplaatst en de wortels in het water worden ondergedompeld. Houd de zaailing in de klimaatkamer en gebruik dezelfde instellingen als voorheen. Vanaf de tweede dag verzamelt u het water dat de exudaten bevat en vult u de beker bij met steriel, gedeïoniseerd water.Bewaar vervolgens elk monster afzonderlijk bij vier graden Celsius. Verspreid voor elk monster 100 microliters op een Luria-Bertani agarplaat om te controleren op microbiële besmettingen. Gooi de besmette monsters weg.Combineer de verzamelde monsters van één zaailing. Breng vervolgens de gecombineerde wortelexudaten over in 50 milliliterbuizen. Vries de buizen met wortelexudaten in bij min 80 graden Celsius.Concentreer ze door ze bij min 40 graden Celsius te vriesdrogen tot een eindvolume van 150 milliliter. Om de bacteriën te laten groeien, streken u een B.mycoides-stam vanuit een glycerolvoorraad bij min 80 graden Celsius op een LB agarplaat en incubeer de plaat een nacht bij 30 graden Celsius. Inoculeer vervolgens het LB vloeibaar medium met een enkele kolonie van de plaat en laat de cultuur een nacht groeien in een schudende incubator bij 200 tpm bij 30 graden Celsius.Om de bacteriën te behandelen en te bemonsteren, verdunt u een nachtcultuur van B.mycoides met 90 milliliter voorverwarmd LB-medium tot de begin-OD600 van nul punt nul vijf in een 300 milliliterkolf. Voeg vervolgens 10 milliliter wortelexudaat toe aan de cultuur en gebruik een 10 milliliter steriele, gedeïoniseerde waterbehandeling als controle. Incubeer ze vervolgens een uur bij 30 graden Celsius.Na een uur brengt u de cultuur over in 50 milliliter centrifugeerbuizen. Verzamel de cellen uit de cultuur door centrifugatie bij 9.000 keer G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Gooi vervolgens de supernatant weg en vries de pellet onmiddellijk in vloeibare stikstof.Bewaar het vervolgens bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Om RNA te isoleren, ontdooi de celpellets op ijs en suspendeer elk van ze in 400 microliter TE-buffer. Breng vervolgens de suspensies over in de twee milliliter schroeven dopbuizen.Voeg nul punt vijf gram glaskralen toe aan de buis. Sluit vervolgens de doppen stevig en plaats de buizen in een bead mill homogenisator. Voer een 45-seconden puls homogenisatie drie keer uit, met een interval van een minuut op ijs.Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij 11.000 keer G en breng de bovenste fase van elk monster over in een nieuwe buis. Voeg 500 microliter chloroform:isoamyl alcohol toe aan de bovenste fase en centrifugeer het mengsel gedurende vijf minuten bij 11.000 keer G. Breng vervolgens 500 microliter van de bovenste fase over in een verse buis. Voeg een milliliter van de lysis binding buffer toe en meng het door omhoog en omlaag te pipetteren.Bereid vervolgens een punt vijf milliliter microcentrifugebuisjes voor met 100 microliter DNase buffer, 10 microliter DNase I en vijf microliter RNase inhibitor. Voeg het bereide oplossingsmengsel toe aan het filter van de filterbuizen en incubeer ze gedurende 20 tot 30 minuten bij 15 tot 25 graden Celsius. Voer vervolgens de wasstappen uit volgens de instructies van de fabrikant en voeg 50 microliter elutie buffer toe aan de buis.Na centrifugatie eluteer het RNA. Breng enkele microliters van het monster over in een punt vijf milliliter microcentrifugebuis om een kwaliteitscontrole uit te voeren. Dek ten slotte het elueerde RNA af met een plastic paraffinefolie en bewaar het bij min 80 graden Celsius.Na de verzameling werden de wortel exudaten toegevoegd aan de B.mycoides-cultuur in een verhouding van 10% en werd het bacteriële totale RNA geïsoleerd. Het RNA werd vervolgens onderworpen aan een kwaliteitscontrole door een geautomatiseerd elektroforese-instrument. Deze grafieken vertegenwoordigen het RNA geïsoleerd uit B.mycoides behandeld met de wortel exudaten, en deze grafieken vertegenwoordigen het RNA geïsoleerd uit de controlegroep.Alle monsters scoorden een RIN-waarde boven de negen, met twee duidelijke banden die overeenkomen met de 16S en 23S RNA-subeenheden, wat aantoont dat hoogwaardig RNA werd verkregen met dit protocol. Na voorbereiding van de bibliotheek werden paar eindle

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Yi, Y., et al. Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation and treatment of Bacillus mycoides cultures to study plant-microbe interactions. It outlines the steps from streaking a stock culture and incubating it in liquid medium to exposing the bacteria to plant root exudates under agitation. The process culminates in harvesting and flash-freezing the bacterial cells for...

Treatment of Bacteria with Plant Root Exudates to Emulate In Vitro Plant-Microbe Interactions

Agro-infiltratie en PVX-agro-infectie zijn routinematige functionele assays voor voorbijgaande ectopische expressie van genen in planten. Deze methoden zijn efficiënte assays in effectoromics strategieën (snelle weerstand en avirulence gen ontdekking) en cruciaal voor modern onderzoek in moleculaire plant pathologie. Ze voldoen aan de vraag naar robuuste functionele analyse met hoge doorvoer in fabrieken.

Agro-infiltratie en PVX Agro-infectie in aardappel en Nicotiana benthamiana

Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.

Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van aardappel- en de activiteit van de promotor van een gen suberine door GUS Staining

De gepresenteerde methode creëert natuurlijke herbivoor beschadigd plantenweefsel door de toepassing van Manduca sexta larven op losgeraakte bladeren van aardappel. Het plantenweefsel wordt onderzocht voor de uitdrukking van zes transcriptiefactor homologs die betrokken zijn bij vroege reacties op insecten herbivory.

Vrijstaande blad testen voor het vereenvoudigen van genexpressie studies in aardappel tijdens besmetting door kauwen insect Manduca sexta

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het op aardappelvirus X (PVX) gebaseerde microRNA-uitschakelingssysteem (VbMS) om endogene microRNA's (miRNA's) in aardappelen functioneel te karakteriseren. Target mimic (TM) moleculen van miRNA van belang worden geïntegreerd in de PVX-vector en tijdelijk uitgedrukt in aardappel om de doel miRNA- of miRNA-familie tot zwijgen te brengen.

Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel.

Dit protocol presenteert een gedetailleerde samenvatting van strategieën om plantenwortels te enten met bodemmicroben. Voor de schimmels Verticillium longisporum en Verticillium dahliae worden drie verschillende wortelinfectiesystemen beschreven. Mogelijke toepassingen en mogelijke downstream analyses worden belicht en voor- of nadelen worden per systeem besproken.

Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

We presenteren een protocol voor een op glas gebaseerd, semi-hydroponisch experimenteel systeem dat de groei ondersteunt van een verscheidenheid aan fylogenetisch verschillende planten met of zonder microben. Het systeem is compatibel met verschillende groeimedia en maakt niet-destructieve bemonstering van wortelexsudaat mogelijk voor stroomafwaartse analyse.

Een veelzijdig glazen pottensysteem voor semihydroponische wortelexsudaatprofilering

Het protocol beschrijft infectie van Solanum tuberosum-wortels met plantparasitaire nematoden onder in vivo kasomstandigheden en aardappel in vitro transgene wortels voor histochemische analyse van de wortelstructuur door middel van optische microscopie.

In vivo en in vitro infectie van aardappelwortels met plantparasitaire nematoden voor de beoordeling van geïnduceerde structurele veranderingen

Ontdek transcriptoomanalyse van Bacillus mycoides in reactie op aardappelwortel-exsudaat. Deze methode identificeert belangrijke bacteriële genen betrokken bij plant-microbe interacties voor landbouwonderzoek.

Plant-Microbe interactie: Transcriptionele reactie van Bacillus Mycoides op aardappel wortel exsudaat

Meer video's verkennen