Name: Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer een ultralage-invoer genoomsequencingmethode voor tardigraden met minimale DNA-hoeveelheden. Deze techniek vermindert contaminatie en maakt genoomanalyse van enkele Hypsibius dujardini exemplaren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Nozomi Abe, Yuki Takai en Nahoko Ishii voor hun technische ondersteuning in genomic sequencing. Dit werk werd gesteund door de Grant-in-Aid voor de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) Research Fellow, KAKENHI Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (No.22681029) en KAKENHI Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (B), No. 17 H 03620 van de JSPS, door een Subsidie voor elementaire wetenschap-onderzoeksprojecten uit The Sumitomo Foundation (No.140340), en deels door de middelen voor onderzoek van de departementale overheid Yamagata en Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris gebruikt om te voeden de beerdiertjes was voorzien hoffelijkheid van Chlorella Industry Co. LTD.

1. voorbereiding
<ol><li>Bereiden van 2% agarose gel met gedestilleerd water (DW) als het oplosmiddel in een 90-mm kunststof cultuur schotel, en 10 mL van een 1% penicilline/streptomycine cocktail met DW. De gel kan worden opgeslagen voor 2-3 weken in een couveuse ingesteld bij 18 ° C. Opmerking: Vermijd elke opslag van de gel onder 10 ° C, voor de lage temperatuur zal het krimpen van het agarose gel, resulterend in een minuscuul kloof tussen de gel en de cultuur schotel muur waarin de beerdiertjes opgesloten kunnen worden.</li>
</ol>2. voorbereiding en uitsluiting van verontreinigingen van de proeven
<ol><li>Een enkele beerdiertjes verzamelen, plaats het op de voorbereide agarplaat en wassen 2 x - 3 x met DW om eventuele resterende deeltjes te verwijderen.</li>
	<li>Incubeer de beerdiertjes bij 18-22 ° C gedurende 24 uur overtollig voedsel uit de darmen verwijderen.</li>
	<li>Plaats de uitgehongerd beerdiertjes in penicilline/streptomycine antibiotica voor 2-6 h tot Verwijder eventuele bacteriële besmetting en plaats van de gedecontamineerde dier op een glas van de schone dia met behulp van een precisiepipet P10.</li>
	<li>Observeer de beerdiertjes onder een microscoop op 500 X vergroting en bevestigen dat er geen resterende bacteriën. Opmerking: De hoge vergroting met een stereomicroscoop is optimaal, maar een optische Microscoop kan worden gebruikt als alternatief zonder toepassing van een dekglaasje aan.</li>
	<li>Verzamelen van het individu met behulp van een precisiepipet van de P10 met een maximum van 5 µL van vloeistof, plaatst u deze in een lage-bindende polymerase kettingreactie (PCR) buis en verwijderen als veel overtollige vloeistof mogelijk. Opmerking: De slangen, buizen van PCR en Pipetteer tips moeten lage binding aan het minimaliseren van het verlies van DNA. Opmerking: Gedragingen een homogenisering zo spoedig mogelijk, voor de snelle uitdroging of dood van het dier aanzienlijk schade kan toebrengen aan de genomic DNA.</li>
</ol>3. de homogenisering en DNA-extractie
<ol><li>Meng het dier om te verkrijgen zijn genomic DNA (gDNA) met een van de volgende methoden. Opmerking: Het is cruciaal voor het gebruik van de opgegeven kit komt te staan in de Tabel van materialen in de volgende stappen in DNA-extractie voor andere kits (kolom en kraal gebaseerd) niet effectief op deze extreem lage input zijn. De genomische lysis-buffermengsel is geleverd met 0,5% bèta-mercaptoethanol vóór gebruik.<ol>
<li>Meng het dier met freeze-en-dooi cycli18.<ol>
<li>Onmiddellijk na stap 2.5, voeg 100 µL van lysis buffer aan de PCR-buis met de beerdiertjes.</li>
			<li>Plaats van de PCR-buis in vloeibare stikstof voor 10 min en voor 10 min, verplaatsen naar een warmte blok opgewarmd tot 37 ° C. Herhaal deze stap 2 x. Opmerking: Deze stap kan worden herhaald wanneer de homogenisering niet voldoende is of er wordt uitgevoerd na het handmatige neerslaan.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Handmatig het verpletteren van het dier.<ol>
<li>Onmiddellijk na stap 2.5, onder een stereomicroscoop, crush van het individu met het P10-uiteinde van de pipet door te drukken op het dier tegen de buiswand PCR, en onmiddellijk Voeg 100 µL van lysis buffer. Opmerking: Het is cruciaal voor het observeren van deze procedure onder een stereomicroscoop, omdat de beerdiertjes gemakkelijk weg glijden kan en inefficiënte pletten in een gebrek resulteren zal aan het uitpakken van de gDNA. Zorg ervoor dat de tardigrade cuticle gebroken, is zodat de lysis-buffermengsel in het organisme infiltreren kan.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor lysis optreden. Opmerking: Minimaal 30 min is vereist voor een efficiënte lysis, maar de incubatietijd kan langer.</li>
	<li>Het volledige volume (100 µL) van de lysis mengsel naar een schone 1.5-mL laag-bindende microtube overbrengen.</li>
	<li>Voeg 100 µL van lysis buffer aan de lage-bindende PCR buis die werd gebruikt voor de homogenisering en is nu leeg, en na het mengsel pipetteren, over te brengen naar de 1.5-mL laag-bindende microtube gebruikt in stap 3.3. Herhaal deze stap 2 x.</li>
	<li>Zoals in stap 3.4, voeg 300 µL van lysis buffer aan de PCR-buis van lage-bindende en, na pipetteren, het mengsel te verplaatsen naar de 1.5-mL laag-bindende microtube. De 1.5-mL laag-bindende microtube moet bevatten 600 µL van het mengsel na deze stap. Opmerking: Deze stappen zijn om te minimaliseren van het verlies van gDNA gebonden aan de buiswand PCR, door het monster meerdere keren wassen.</li>
	<li>Het totaal van 600 µL van lysis mengsel toevoegen aan de spin-kolom in een collectie buis geplaatst en Centrifugeer het bij 10.000 x g voor 1 min.</li>
	<li>Opnieuw toepassen van de stroom door naar de kolom samen en Centrifugeer het bij 10.000 x g voor 1 min. Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het merendeel van de gDNA is gebonden aan de kolom.</li>
	<li>Voeg 500 µL van was buffer naar de spin kolom samen en Centrifugeer het bij 10.000 x g voor 1 min. overdracht de spin kolom een schone 1.5-mL microtube.</li>
	<li>Breng 20 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, naar de spin kolom, wacht 5 minuten bij kamertemperatuur, en Centrifugeer het bij 10.000 x g voor 1 min. Opmerking: De elutie buffer mag geen EDTA, bevatten voor het interfereert met de bibliotheek voorbereiding enzymen.</li>
	<li>De stroom door de kolom spin, en na 5 min van incubatie bij kamertemperatuur opnieuw van toepassing, het gedurende 1 minuut bij 10.000 x g centrifugeren. Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang om de maximale elutie van de gDNA die afhankelijk is van de kolom.</li>
</ol>4. bibliotheek bouw volgorde
<ol><li>
Fragmentatie van DNA
	<ol>
<li>15 µL van de eluant van de gDNA overbrengen in een 15-µL microtube voor fragmentatie van DNA en centrifugeer de buis voor 1 min met behulp van een tafelblad microcentrifuge. Opmerking: De opgegeven microtube weergegeven in de Tabel van materialen is optimaal voor een lage input. De fragmentatie met laag-volume ultrasoonapparaat is essentieel, en dit kan niet worden vervangen door enzymatische fragmentatie vanwege de extreem lage concentratie van DNA.</li>
		<li>Fragment van de gDNA tot 550 bp. Opmerking: De 550 bp instellingen wij gebruikt zijn als volgt: incident piekvermogen = 30 W, plicht factor = 20%, cycli per burst = 50, behandeltijd 23 = s.</li>
		<li>Na een grondige pipetteren, door 10 µL van het gefragmenteerde DNA mengsel te overbrengen in een schone laag-bindende PCR buis. Opmerking: Het experiment kan hier gestopt worden. Behouden van het DNA bij 4 ° C of -20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bibliotheek bouw volgorde Opmerking: Het is absoluut cruciaal te gebruiken van de opgegeven kit in de Tabel van materialen in de volgende procedures, vanwege de lage hoeveelheid input DNA.<ol>
<li>Voeg 2 µL van de sjabloon voorbereiding buffer en 1 µL van het sjabloon voorbereiding enzym en meng ze met een pipet.</li>
		<li>Uitvoeren van de sjabloon voorbereiding reactie op een thermische cycler met de volgende voorwaarden: 22 ° C gedurende 25 minuten, 55 ° C gedurende 20 min, 4 ° C houden en een verwarmde deksel bij 101-105 ° C. Zodra de reactie wordt voltooid, gaat u verder met de volgende stap.</li>
		<li>1 µL van de bibliotheek synthese buffer en 1 µL van het enzym van de synthese bibliotheek toevoegen aan de sjabloon voorbereiding reactieproduct en Incubeer het mengsel bij 22 ° C gedurende 40 min (met een 4 ° C houden). Zodra de reactie wordt voltooid, gaat u verder met de volgende stap.</li>
		<li>Voeg 30 µL van de bibliotheek amplificatie master mix (25 µL van de bibliotheek amplificatie buffer 1 µL van het enzym bibliotheek versterking en 4 ÂµL van nuclease-gratis water) en 5 µL van het indexeren reagens.</li>
		<li>Meng alles met een pipet en Centrifugeer het mengsel kort met een tafelblad centrifuge.</li>
		<li>Een PCR uitvoeren met de voorwaarden die zijn opgenomen in tabel 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatuur</td>
			<td>Tijd</td>
			<td>Cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>3 minuten</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>85 ˚C</td>
			<td>2 minuten</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>2 minuten</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>20 seconden</td>
			<td rowspan="3">4 cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>67 ˚C</td>
			<td>20 seconden</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>40 seconden</td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>20 seconden</td>
			<td rowspan="2">16 cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>50 seconden</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ˚C</td>
			<td>Houd</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: PCR voorwaarden.
<ol start="3"><li>
Zuivering van de PCR producten Opmerking: Deze stap kan worden vervangen door andere methoden van zuivering. Als een alternatieve methode wordt gebruikt, zorg ervoor om te controleren of de resulterende DNA zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. Absorptie ratio's van 260/280 en 260/230 moet zowel boven 1.8.<ol>
<li>Voeg 50 µL van magnetische kralen, Pipetteer de oplossing 10 x, samen en Centrifugeer het kort met een tafelblad microcentrifuge.</li>
		<li>Laat de oplossing gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
		<li>Incubeer het op een magnetische stand gedurende 5 minuten of totdat de oplossing volledig wordt leegmaken, en het supernatant wilt verwijderen.</li>
		<li>200 µL van vers bereide 80% ethanol toevoegen aan de lage-bindende PCR buis op een magneet-stand, wacht 30 s, en verwijder de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap 2 x. De kralen niet storen.</li>
		<li>Kort centrifugeren van de lage-bindende PCR buis met een tafelblad centrifuge en verwijder alle overtollige ethanol op de magnetische stand. Drogen van de kralen, maar vermijd uitdrogen.</li>
		<li>Resuspendeer de kralen met 15 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 grondig Pipetteer de oplossing zodat de magnetische kralen zijn homogeen verdeeld, Incubeer de buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, en na een kort centrifugeren, Incubeer het op een magnetische stand voor 2 min totdat de oplossing helder is. Opmerking: De elutie buffer mogen geen EDTA, voor het interfereert met de sequencing-chemie.</li>
		<li>Breng het supernatant, zonder verstoring van de pellet, tot een nieuwe lage-bindende PCR koker. Opmerking: Het experiment kan hier gestopt worden. Behoud van het DNA bij 4 ° C of bij-20 ° C gedurende lange tijd opslag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. de kwaliteitscontrole, kwantificering en opeenvolging van DNA
Opmerking: Een kwaliteitscontrole wordt niet uitgevoerd vóór deze stap als gevolg van de lage hoeveelheid DNA.
<ol><li>
Validatie van de verdeling van de grootte van de bibliotheek van DNA Opmerking: Andere hoog-gevoelige elektroforese systemen met een digitale rapportage van grootteverdeling kunnen worden gebruikt.<ol>
<li>Retourneren van de elektroforese buffer reagens en gel cartridge (25-1000 bp in bereik) tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 3 µL van elektroforese buffer reagens met 1 µL van de sequencing-bibliotheek en meng ze grondig voor 1 min met een vortex en kort centrifugeren hen met een tafelblad centrifuge.</li>
		<li>Voeren van elektroforese en valideren van de grootteverdeling van de bibliotheek met de bijbehorende software. De belangrijkste fragment piek moet worden over het algemeen variërend van ongeveer 300 tot 1000 bp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificering van DNA Opmerking: Andere fluorescentie gebaseerde methoden of kwantitatieve PCR kan ook worden gebruikt, maar spectrofotometrie moet worden vermeden, want het is niet nauwkeurig genoeg voor het kwantificeren van sequencing bibliotheken.<ol>
<li>Voeg 796 µL van oplossing buffer en 4 µL van fluorescerende reagens en meng ze. Afzien van 190 µL van de werkoplossing twee assay buizen en 197 µL aan één assay buis.</li>
		<li>Voeg 10 µL van normen met een bekende concentratie van DNA aan elke test-buis met 190 µL van de werkoplossing, en 3 µL van de bereid bibliotheek aan de test-buis met 197 µL van de werkoplossing.</li>
		<li>Vortex de buizen kort samen en centrifugeer ze op een tafelblad centrifuge. Het DNA een Fluorimeter met 3-µL instellingen te kwantificeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bibliotheek opeenvolging van DNA Opmerking: De sequencing-platform moet verenigbaar zijn met het bouwpakket voor de opgegeven mediawisselaar.<ol>
<li>Bereiden de sequencing-bibliotheek gebaseerd op protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Stel de reagens cassette en stroom-cel in de sequencing-instrument en de volgorde uitgevoerd volgens protocol van de fabrikant informatie invoeren.</li>
		<li>De volgorde worden uitgevoerd. Opmerking: We hebben twee sequencing runs uitgevoerd: een monster/uitvoeren, evenals vier monsters multiplexed in één punt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. computationele analyse
<ol><li>Base-oproep en, indien nodig, demultiplex het luidt als volgt.</li>
	<li>De kwaliteit van de gegevens van de reeks met FastQC19te valideren. Opmerking: Zie voor een meer diepgaande validatie van de verkregen data, onze vorige verslag16.</li>
</ol>

<ol><li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.ph.54.030192.003051">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).</li>
<li>Mobjerg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+extreme+environments+-+on+the+current+knowledge+of+adaptations+in+tardigrades%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades.</a> Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).</li>
<li>Becquerel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+suspension+de+la+vieau+dessous+de+1%2F20+K+absolu+par+demagnetization+adiabatique+de+L%27alun+de+fer+dans+le+vide+les+plus+el%C3%A9ve%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Acad%C3%A9mie+des+Sciences%22%5BJournal%5D)">La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve.</a> Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).</li>
<li>Ono, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/23311940.2016.1167575">Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia.</a> Cogent Physics. 3 (1), 1167575(2016).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+anhydrobiotic+eggs+of+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+to+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments.</a> Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+repair+and+protection+in+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+and+Hypsibius+dujardini+after+exposure+to+UVC+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation.</a> PLoS One. 8 (6), e64793(2013).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+tolerance+in+the+tardigrade+Milnesium+tardigradum%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).</li>
<li>May, R. M., Maria, M., Gumard, J. <a target="_blank" href="https://ci.nii.ac.jp/naid/10021039778/">Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché.</a> Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).</li>
<li>Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+tolerance+in+the+eutardigrade+Richtersius+coronifer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer.</a> International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).</li>
<li>Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+a+tardigrade%3A+Horizontal+gene+transfer+or+bacterial+contamination%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).</li>
<li>Delmont, T. O., Eren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+contamination+with+advanced+visualization+and+analysis+practices%3A+metagenomic+approaches+for+eukaryotic+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies.</a> PeerJ. 4, e1839(2016).</li>
<li>Koutsovoulos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+in+the+genome+of+the+tardigrade+Hypsibius+dujardini%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).</li>
<li>Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+Bemm+et+al.+and+Arakawa%3A+Identifying+foreign+genes+in+independent+Hypsibius+dujardini+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).</li>
<li>Boothby, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).</li>
<li>Arakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057(2016).</li>
<li>Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+a+single+tardigrade+Hypsibius+dujardini+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual.</a> Scientific Data. 3, 160063(2016).</li>
<li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+tardigrades+Hypsibius+dujardini+and+Ramazzottius+varieornatus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002266(2017).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e47">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio101, e47(2011).</li>
<li>Andrews, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndrews%2C+S+%22FastQC+a+quality-control+tool+for+high-throughput+sequence+data%22">FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Hashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremotolerant+tardigrade+genome+and+improved+radiotolerance+of+human+cultured+cells+by+tardigrade-unique+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein.</a> Nature Communications. 7, 12808(2016).</li>
<li>Zimin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaSuRCA+genome+assembler%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The MaSuRCA genome assembler.</a> Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualimap+2%3A+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+rearing+system+of+the+extremotolerant+tardigrade+Ramazzottius+varieornatus%3A+a+new+model+animal+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology.</a> Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bacteriële besmetting vormt een bedreiging voor het genoom sequentiebepaling van microscopisch kleine organismen. Hoewel eerdere studies op tardigrade genoom sequencing hebt gefilterd uit besmetting met behulp van uitgebreide informatica methoden12,20, sequenced we het genoom van een individu om te minimaliseren van het risico van verontreinigingen. Aangezien een individuele beerdiertjes bevat ongeveer 50-200 pg genomic DNA16 en is ingekap...

Beerdiertjes zijn microscopisch kleine dieren die een ametabolic staat genoemd anhydrobiosis wanneer geconfronteerd met uitdroging kunnen worden ingevoerd. Zij herstellen door de absorptie van water1,2. In de ametabolic staat kunnen beerdiertjes gedogen van verschillende extreme omgevingen, waaronder extreme temperaturen3 en druk4,5, een hoge dosering van ultraviolet licht6, x-stralen en gammastralen 7 , 8en9van de kosmische ruimte. Genomic gegevens is een onmisbaar fundament voor de studie van moleculaire mechanismen van anhydrobiosis.
Eerdere pogingen om het genoom van beerdiertjes is gebleken tekenen van bacteriële besmetting10,11,12,13,14. Genoom sequentiebepaling van dergelijke kleine organismen vereist een groot aantal dieren en is gevoelig voor bacteriële besmetting; Daarom hebben we een protocol van de sequencing met behulp van een ultralow invoermethode vanaf een enkel exemplaar van beerdiertjes, tot een minimum beperken van het risico van verontreinigingen15eerder opgericht. Met behulp van deze gegevens, hebben we verder uitgevoerd een kwalitatief hoogwaardige manipulatie en de opbouw van het genoom van H. dujardini16,17. Hier beschrijven we in detail deze methode voor het genomic rangschikken van een individu tardigrade ()Figuur 1). De validatie van deze methode sequencing is voorbij de focus van dit papier en is reeds grondig besproken in ons vorige verslag16.
Deze methode bestaat uit twee delen: de isolatie van een enkele beerdiertjes met de laagst mogelijke verontreiniging en de kwalitatief hoogwaardige extractie van pictogram niveaus van DNA. De beerdiertjes is uitgehongerd en grondig gespoeld met water, evenals antibiotica en waargenomen onder een microscoop met vergroting van 500 X om het verwijderen van eventuele bacteriële besmetting. Eerdere schattingen en metingen tonen aan dat een enkel individu van beerdiertjes ongeveer 50-200 pg genomic DNA16, die is geëxtraheerd bevat door het kraken van chitine exoskeleton door cycli bevriezen-ontdooien of door handmatige homogenisering. Deze genomic DNA is voorgelegd aan de bouw van de bibliotheek en sequenced op een DNA-sequencing-instrument. Een extra informatica-analyse toont kwalitatief hoogwaardige sequencing, evenals lage niveaus van verontreiniging in vergelijking met eerdere tardigrade sequencing projecten.

<table><tbody><tr><td>SZ61 microscoop</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>VHX-5000 Systeem</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2mL Silicone coating tube</td><td>Bio Medical Science</td><td>BC-bmb20200</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Microprep Kit</td><td>ZYMO Research</td><td>D3021</td><td>Gebruik van deze kit is absoluut essentieel; zie stap 3.1</td></tr><tr><td>1.5 mL microbuisje</td><td>greiner bio-one</td><td>616-201</td><td>Zie 4.1.1</td></tr><tr><td>HIgh snelheid gekoelde microcentrifuge</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Covaris M220</td><td>Covaris Inc.</td><td>4482277</td><td></td></tr><tr><td>ThruPLEX DNA-Seq kit</td><td>Rubicon Genomics</td><td>CAT. NR. R400406</td><td>Gebruik van deze kit is absoluut essentieel; zie stap 4.2</td></tr><tr><td>Thermische Cycler</td><td>Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP reagens</td><td>BECKMAN COULTER Life Science</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Wako</td><td>054-027335</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2965AA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagentia</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Buffer/Reagens</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Cubee Mini-Centrifuge</td><td>RecenttecGenereach</td><td>R5-AQBD01aqbd</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 600 cycle v3</td><td>Illumina Inc.</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina Inc.</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

ultralow input genoom sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de tardigrade

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Beerdiertjes zijn microscopisch kleine dieren die worden ingevoerd door de staat van een ametabolic genaamd anhydrobiosis wanneer geconfronteerd met uitdroging en kan hun oorspronkelijke staat te herstellen wanneer water wordt aangevoerd. Het genoom sequentiebepaling van microscopisch kleine dieren zoals beerdiertjes risico's bacteriële besmetting dat soms tot verkeerde interpretaties, bijvoorbeeld met betrekking tot de omvang van horizontale genoverdracht in deze dieren leidt. Hier bieden we een ultralow input-methode om het genoom van de beerdiertjes, Hypsibius dujardini, van een enkel exemplaar. Door gebruik te maken van strenge wassen en verontreinigingen uitsluiting samen met een efficiënte winning van de 50 ~ 200 pg genomic DNA van een enkel individu, we gebouwd een bibliotheek sequenced met een DNA-sequencing-instrument. Deze bibliotheken waren zeer reproduceerbaar en onbevooroordeelde, en een analyse van de informatica van de gesequenceerd luidt met andere H. dujardini -genoom toonden een minimale hoeveelheid verontreiniging. Deze methode kan worden toegepast op unculturable beerdiertjes die niet kon worden sequenced met behulp van de vorige methoden.

Verontreinigingen uitsluiting:
Dit protocol omvat een grondige wassen van de beerdiertjes en een sterilisatie met antibiotica behandeling tot een minimum beperken van verontreiniging. Het gaat ook om een visuele controle proces om ervoor te zorgen de volledigheid van deze processen. Een afbeelding van de Microscoop gemaakt tijdens de validatie (stap 2.4 van het protocol) is afgebeeld in Figu...

Besmetting tijdens de genomic sequencing van microscopische organismen blijft een groot probleem. Hier, laten we een methode om het genoom van een beerdiertjes uit een enkel exemplaar met zo weinig als 50 pg van genomic DNA zonder het hele genoom versterking om te minimaliseren van het risico van besmetting.

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Het doel van dit protocol is om het genoom van een microscopisch organisme, genaamd tardigraden, te sequentiëren. We hebben een methode ontwikkeld om het genoom van een tardigraad, Hypsibius dujardini, van één enkel specimen met zo weinig als 50 picogrammen genomisch DNA te sequentiëren met een volledige genoomtoepassing. Na isolatie van een enkele tardigraad, minimaliseren we bacteriële besmetting door antibiotica te gebruiken en visuele inspectie.We hebben ook twee homogenisatiemethoden gebruikt. Eerst en het meest gebruikt bij C. elegans met bevriezing en ontdooicycli, en ten tweede, een handmatig pletten van de tardigraad met een pipettip. DNA wordt vervolgens gebruikt om een sequencing bibliotheek te construeren en wordt vervolgens gesequentieerd in een MiSeq Instrument.Een algemeen overzicht van het protocol. Na isolatie van een enkel individu, wordt het onderworpen aan drie bevriezing en ontdooicycli voor homogenisatie. Het genomische DNA wordt geëxtraheerd en gezuiverd en wordt gefragmenteerd door sonificatie.Vervolgens wordt een sequencing bibliotheek geconstrueerd en na validatie van de bibliotheekgrootteverdeling, wordt deze gesequentieerd met een sequencing instrument.

ultralow-input-genome-sequencing-library-preparation-from-single

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Dit artikel demonstreert een gedetailleerd protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer sequencing bibliotheek bouw van herbarium materiaal met inbegrip van de redding van uitzonderlijk slechte kwaliteit DNA.

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Lange-lezen sequenties vergemakkelijken aanzienlijk de assemblage van complexe genomen en karakterisering van structurele variatie. Beschrijven we een methode voor het genereren van ultra lange reeksen door sequentiebepaling nanopore gebaseerde platformen. De benadering neemt een geoptimaliseerde DNA-extractie, gevolgd door de gewijzigde bibliotheek preparaten voor het genereren van honderden kilobase leest met gematigde dekking van menselijke cellen.

Ultra lange lezen Sequencing voor hele Genomic DNA-analyse

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Dit protocol beschrijft een alomvattende aanpak voor het kweken, sequentiëren en de novo hybride genoomassemblage van urinebacteriën. Het biedt een reproduceerbare procedure voor het genereren van volledige, circulaire genoomsequenties die nuttig zijn bij het bestuderen van zowel chromosomale als extrachromosomale genetische elementen die bijdragen aan urinaire kolonisatie, pathogenese en verspreiding van antimicrobiële resistentie.

Hybride de novo genoomassemblage voor het genereren van complete genomen van urinebacteriën met behulp van short- en long-read sequencing-technologieën

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

Dit werk presenteert een snelle RNA-extractie- en vergelijkingsmethode op transcriptniveau voor het analyseren van genexpressie in het beerdiertje Hypsibius exemplaris. Met behulp van fysische lysis vereist deze high-throughput-methode een enkel beerdiertje als uitgangsmateriaal en resulteert in een robuuste productie van cDNA voor kwantitatieve reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR).

RNA-extractie met één dier en één buis voor vergelijking van relatieve transcriptieniveaus via qRT-PCR in het beerdiertje Hypsibius exemplaris

Leer een ultralage-invoer genoomsequencingmethode voor tardigraden met minimale DNA-hoeveelheden. Deze techniek vermindert contaminatie en maakt genoomanalyse van enkele Hypsibius dujardini exemplaren mogelijk.

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Meer video's verkennen