Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Het doel van dit protocol is om het genoom van een microscopisch organisme, genaamd tardigraden, te sequentiëren. We hebben een methode ontwikkeld om het genoom van een tardigraad, Hypsibius dujardini, van één enkel specimen met zo weinig als 50 picogrammen genomisch DNA te sequentiëren met een volledige genoomtoepassing. Na isolatie van een enkele tardigraad, minimaliseren we bacteriële besmetting door antibiotica te gebruiken en visuele inspectie.

We hebben ook twee homogenisatiemethoden gebruikt. Eerst en het meest gebruikt bij C. elegans met bevriezing en ontdooicycli, en ten tweede, een handmatig pletten van de tardigraad met een pipettip. DNA wordt vervolgens gebruikt om een sequencing bibliotheek te construeren en wordt vervolgens gesequentieerd in een MiSeq Instrument.

Een algemeen overzicht van het protocol. Na isolatie van een enkel individu, wordt het onderworpen aan drie bevriezing en ontdooicycli voor homogenisatie. Het genomische DNA wordt geëxtraheerd en gezuiverd en wordt gefragmenteerd door sonificatie.

Vervolgens wordt een sequencing bibliotheek geconstrueerd en na validatie van de bibliotheekgrootteverdeling, wordt deze gesequentieerd met een sequencing instrument. Bereid 2% agarosegel met gedistilleerd water als oplosmiddel in een 90 millimeter plastic kweekschaal en 10 millimeter van 1% penicilline-streptomycine met gedistilleerd water. De gel kan twee tot drie weken in een incubator worden bewaard die ingesteld is op 18 graden.

Verzamel een enkele tardigraad en plaats deze op de voorbereide agarplaat, en was twee tot drie keer met gedistilleerd water om resterende deeltjes te verwijderen. Plaats de enkele tardigraad in penicilline-streptomycine antibiotica gedurende twee tot zes uur om bacteriële besmetting te verwijderen en plaats het gedecontamineerde dier op een schone glazen dia met behulp van een P10 pipette. Observeer de tardigraad onder een microscoop bij 500 keer vergroting en bevestig dat er geen resterende bacteriën zijn.

Verzamel het individu met behulp van een P10 pipette met maximaal vijf microliters vloeistof en plaats deze in een low-binding PCR buis, en verwijder zoveel mogelijk overtollig vocht. Homogenisatie en DNA extractie. Homogeniseer het dier om genomisch DNA te verkrijgen met een van de volgende methoden.

Homogenisatie met bevriezing en ontdooicycli. Direct na stap 2.5, voeg 100 microliters lysisbuffer toe aan de PCR buis die de tardigraad bevat. Plaats de PCR buis gedurende 10 minuten in vloeibare stikstof en verplaats deze vervolgens naar een hitteblok, warm gedurende 10 minuten tot 37 graden.

Herhaal deze stap drie keer. Manuele plettering. Onder een stereomicroscoop, verpletter het individu met een P10 pipette tip door het dier tegen de wand van de PCR buis te drukken en voeg onmiddellijk 100 microliters lysisbuffer toe.

Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor lysis. Breng het volledige volume van de lysismix naar een schone 1,5 milliliters low-binding microbuis. Voeg 100 microliters lysisbuffer toe aan de low-binding PCR buis, die wordt gebruikt voor homogenisatie en nu leeg is.

En na pipetten, breng het mengsel over naar 1,5 low-binding microbuis. Herhaal deze stap twee keer. Voeg 300 microliters lysisbuffer toe aan een low-binding PCR buis en breng na pipetten het mengsel over naar 1,5 milliliter low-binding microbuis.

Voeg het totaal van 600 microliters lysismengsel toe aan de spinkolom geplaatst in de opvangbuis en centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 G. Breng de stroom door toe op de kolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 G. Deze stap is cruciaal om ervoor te zorgen dat het meeste van het genomische DNA aan de kolom is gebonden.

Voeg 500 microliters wasbuffer toe aan de spinkolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 G. Breng de spinkolom over naar een schone 1,5 milliliter microbuis. Breng 20 microliters van 10 millimolar eerste ACL aan op de spinkolom en wacht vijf minuten bij kamertemperatuur.

Centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 G. De verdunningsbuffer mag geen EDTA bevatten, omdat het interfereert met laboratoriumvoorbereidingsenzymen. Breng de stroom door toe op de spinkolom en centrifugeer na vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur gedurende één minuut bij 10.000 G. Sequencing bibliotheekconstructie.

DNA fragmentatie. Breng 15 microliters van genomisch DNA eluaat over naar een 15 microliters microbuis voor DNA fragmentatie en centrifugeer gedurende één minuut met behulp van een tafelcentrifuge. Fragmenteer het genomische DNA tot 550 basenparen.

Na middels pipetten, breng 10 microliters van gefragmenteerd DNA mengsel over naar een schone, low-binding PCR buis. Het experiment kan hier worden gestopt. Bewaar DNA bij vier of min 20 graden.

Sequencing bibliotheekconstructie. Het is absoluut kritisch om het opgegeven kit te gebruiken in de volgende procedures, vanwege laag-input DNA. Bereid de vereiste reagentia voor, volgens het protocol van de fabrikant, en construeer de sequencing bibliotheek zonder enige wijzigingen.

Na het aanbrengen van de bibliotheekversterkingsmix op een bibliotheeksynthesemix, voer de PCR reactie uit in een thermische cycler. De PCR reactie werd uitgevoerd zoals getoond. Zuivering van de PCR reactie.

Voeg 50 microliters magnetische kralen toe en pipet 10 keer, en centrifugeer kort met een tafelcentrifuge. Incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Incubeer op een magnetische standaard gedurende vijf minuten, of totdat de oplossing volledig helder is geworden, en verwijder het supernatant.

Volg het protocol van de fabrikant. Breng het supernatant over zonder het pellet te verstoren naar een nieuwe low-binding PCR buis. DNA kwaliteitscontrole en kwantificering, en sequencing.

Validatie van DNA bibliotheekgrootteverdeling. Voeg drie microliters van monsterswater toe met één microliter van sequencing bibliotheek, en meng grondig gedurende één minuut met een vortex, en centrifugeer kort met een tafel