Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

Het algemene doel van dit protocol is om toegang te bieden tot embryonale kippenoogen in een in-vitro omgeving om een diepgaande studie van complexe ontwikkelingsroutes in het embryo mogelijk te maken. Bij het embryonale kip is het bestuderen van het oog vaak moeilijk, vanwege de ontwikkeling van de oogleden, de beweging van het embryo en de groei van extra-embryonaal weefsel. Verbindingen zoals medicijnen en remmers kunnen ook dodelijke effecten hebben op het embryo, waardoor het moeilijk wordt om deze verbindingen te gebruiken om genroutes te moduleren.

Vorderingen in in-vitro weefselkweek hebben wetenschappers in staat gesteld om deze weefsels te isoleren en veel van de eerder genoemde belemmeringen te elimineren. Ons protocol heeft het voordeel dat het ons in staat stelt het oog als geheel te bestuderen, inclusief alle weefsels die tijdens de ontwikkeling het potentieel hebben om te interageren, zoals de neurale retina en het retinale pigmentepitheel. Begin door de materialen te autoclaven om ervoor te zorgen dat alle oplossingen en apparatuur steriel zijn voorafgaand aan de procedure.

Om dit te doen, autoclaveer twee liter gedistilleerd water en een liter kippenzout, samen met een doos tissues, semi-poreus filterpapier, gaas, watercontainers en wegwerp glazen pipetten. Steriliseer de incubatorplanken en deur grondig met 70%ethanol, vul vervolgens de containers met geautoclaveerd, gedistilleerd water en verwarm de incubator voor op 37 graden Celsius. Verwarm het voedingsmedium voor, samen met een buis met het antibioticum penicilline-streptomycine in de incubator.

Leg een papieren handdoek over de werkruimte en steriliseer met 70%ethanol. Steriliseer alle pincetten en scharen. Met de kippenkop in geautoclaveerde kippenzout, doorsnijd de kop van de kip in de middenlijn, waarbij wat weefsel rond elk oog intact blijft.

Het extra weefsel zal het oog helpen om wat spanning in de cultuur te behouden, evenals bij het assisteren van voedselinname door het hele oog en het voorkomen dat het oog van het filterpapier afglijdt. Deze weefsels dienen ook als oriëntatiepunten bij het oriënteren van het oog in latere analyse. Laat het gesneden weefsel op kamertemperatuur in kippenzout terwijl je de cultuur voorbereidt.

Bereid de kweekschotel voor. Plaats twee 35-millimeter petrischalen in één 100-millimeter petrischaal. Plaats één gaasplatform in elke kleine schaal.

Plaats de halve kop met het oog op een stuk filterpapier, enigszins kantelen om ervoor te zorgen dat het oog niet van het papier zal glijden. Breng het weefsel en filterpapier over naar de kleine petrischaal bovenop het gaasplatform. Herhaal met de andere helft van de kop van hetzelfde embryo.

Voeg kweekmedium toe aan elk van de twee kleine petrischalen. Breng het medium tot het niveau van het weefselpapier. Dompel het weefsel niet onder in het medium.

Voeg 50 microliter van de antibioticum penicilline-streptomycine stamoplossing toe aan het voedingsmedium in elke schaal om bacteriële infectie te voorkomen. Plaats een gevouwen stuk dun weefsel op de binnenrand van de grotere petrischaal en bevochtig het met gedistilleerd water. Incubeer de cultuur in de donkere incubator bij 37 graden Celsius gedurende maximaal vier dagen.

Na de kweek, verwijder het weefsel van het filterpapier en fixeer het in 4% paraformaldehyde. De eerste kolom toont een HH34-oog, dat het embryonale kippenoog vertegenwoordigt aan het begin van de kweek. De tweede kolom toont een embryonaal kippenoog dat vier dagen is gekweekt, beginnend bij HH34.

De derde kolom toont een HH38-oog, wat overeenkomt met vier dagen in-ovo ontwikkeling na HH34. Panelen A tot F zijn ongekleurd, terwijl panelen G tot I gekleurd zijn voor het alkalische fosfatase-enzym. De bovenste rij, panelen A tot C, toont dat het oog zich gedurende de hele kweek verder ontwikkelt, wat blijkt uit het verschijnen van veerknoppen en de groei van de oogleden, aangegeven met pijlen in elk paneel.

De middelste rij, panelen D tot F, toont dat de conjunctivale papillae in cultuur beginnen te degenereren. De onderste rij, panelen G tot I, toont dat het ruimtelijk-tijdelijke patroon van sclerose inductie in cultuur wordt gehandhaafd, als voorbeeld van een ontwikkelingsroute die met deze methode kan worden bestudeerd. Dit protocol maakt het mogelijk dat weefsels belangrijke ruimtelijke en temporele aspecten van ontwikkeling gedurende de gehele kweek behouden.

Dit protocol vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in het kweken van hele sensorische organen en biedt een alternatieve methodologie voor het bestuderen van de complexe ontwikkelingsroutes die daarin betrokken zijn.