Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in neurowetenschappelijk onderzoek, zoals het karakteriseren van neuropopulaties of het identificeren van bronnen en doelwitten van transmissiesystemen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om snel en eenvoudig het expressieprofiel van een vooraf geselecteerde set genen van een enkele cel te bepalen. Dus deze methode kan inzicht geven in de willekeurige diversiteit van muizen.

Het kan ook worden toegepast op andere celtypen, zoals astrocyten en in veel diermodellen. Deze demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de arresterende en inspirerende stappen moeilijk te leren kunnen zijn omdat de gegevens een hoeveelheid cytoplasma nodig hebben om te worden geanalyseerd. Voor het snijden, bereid een dissectiesetje voor met chirurgische schaar, fijne irisschaar, twee spatels, pincetten, een schijfje papierfilter en cyanoacrylaatlijm.

Verzadig vervolgens de ijskoude snijoplossing met carbogyn en koel de snijdkamer af tot min 20 graden Celsius. Verwijder vervolgens de hoofdhuid van het dier en open de schedel. Trek de hersenen voorzichtig uit en plaats ze in een klein bekertje gevuld met carbogenateerde ijskoude snijoplossing.

Verwijder daarna de snijdkamer uit min 20 graden Celsius en verwijder de vocht met een papieren handdoek. Ontleed voorzichtig de hersenen om het gebied van interesse te isoleren. Lijm het op de snijkamer en voeg de carboginaat, ijskoude snijoplossing toe.

Gebruik een vibratoon om plakken van 300 micrometer dik te snijden. Breng de plakken over naar een rustkamer gevuld met zuurstofrijke snijoplossing op kamertemperatuur en laat ze minstens 30 minuten herstellen. Voor single cell RT-PCR en de gerichte celkarakterisering, beperk de hele cel opname tot maximaal 20 minuten om het mRNAse te behouden.

Aan het einde van de opname bereid een PCR-buisje van 500 microliter voor, gevuld met twee microliters 5xRT-mix en 0,5 microliters 20xDTT. Draai het en bewaar het op ijs. Verzamel vervolgens het cytoplasma van de cel door een zachte negatieve druk toe te passen.

Bewaak en controleer of de inhoud van de cel niet in de pijp komt terwijl u een strakke afdichting handhaaft en vermijd het verzamelen van de kern als sommige genen worden overwogen. In het geval van genen is het essentieel om de verzameling van de kern te vermijden en om een set primers op te nemen die gericht zijn op het versterken van gDNA om voor te bereiden op algemene contaminatie. Als de kern zich dicht bij de punt van de pijp bevindt, laat de negatieve druk los en beweeg de pijp weg.

Zorg ervoor dat de strakke afdichting wordt behouden en start de verzameling van het cytoplasma opnieuw op de nieuwe pijplocatie. Trek vervolgens de pijp voorzichtig terug om een buitenste uitwendige patch te vormen om besmetting door extracellulair puin te beperken en om de sluiting van het celmembraan te bevorderen voor daaropvolgende histochemische analyse. Houd er rekening mee dat knoppen, micro-manipulators, computertoetsenbord of computermuis, proton-geladen bronnen van rnase-besmetting zijn.

Als ze tijdens de opname zijn aangeraakt, verwissel de handschoenen. Verbind vervolgens de pijp aan de verdringer en verdring het inhoud in de PCR-buis door positieve druk toe te passen. Breek de punt van de pijp in de PCR-buis om de verzameling van de inhoud te helpen.

Centrifugeer vervolgens de buis kort, voeg 0,5 microliter RNAse-remmer en 0,5 microliters RTAse toe. Meng voorzichtig, centrifugeer opnieuw en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag draai de buis en bewaar deze tot maximaal enkele maanden bij min 80 graden Celsius.

Tot PCR-analyse en het uitvoeren van de eerste amplificierstap. Om PCR te valideren, meng en verdun een primerpaar, voeg een micromolar toe met de pijp gewijd aan de single cell RTPCR. Stel de thermocycler in voor drie minuten bij 95 graden Celsius, voer 40 cycli uit gevolgd door een laatste verlengingsstap bij 72 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Om de vorming van primerdimers te minimaliseren, voer een hot start uit door de PCR-buizen in de thermocycler te plaatsen die voorverwarmd is op 95 graden Celsius. Na 30 seconden, verdring snel 20 microliter van de primermix op de olie. Zodra het primerpaar is gevalideerd, test het met het multiplexprotocol.

Meng en verdun de externe primer samen bij een micromolar. Bewaar de multiplex-primermix bij min 20 graden Celsius gedurende maximaal enkele weken. Bereid vervolgens een voormix voor en plaats deze op ijs.

Flits de PCR-buis en draai deze en voeg twee druppels minerale olie toe. Na drie minuten bij 95 graden Celsius, voer 20 PCR-cycli uit. Voer een hot start uit zoals beschreven met 20 microliter van multiplex-primermix.

Bereid vervolgens een aantal PCR-buizen voor dat identiek is aan het aantal genen dat wordt geanalyseerd. Bereid een voormix voor met één microliter van het eerste PCR-product per gen als sjabloon. Pas alle volumes aan volgens het aantal genen om te analyseren en overweeg om 10% extra volume te gebruiken om pijpfouten te compenseren.

Schud voorzichtig, draai de buis en verstuur 80 microliter premix in elke PCR-buis. Voeg twee druppels minerale olie per buis toe zonder de muur of de dop van de buizen aan te raken. Voer 35 PCR-cycli uit en voer vervolgens een hot start uit door 20 microliter van interne primermix te verdringen.

Analyseer de tweede PCR-projecten door aragose gelelektroforese. Een laag vijf pyramidale neuron werd visueel geïdentificeerd door zijn grote soma en een prominente apicale dendriet. Pull-cell-opname onthulde typische elektrofysiologische eigenschappen van laag vijf reguliere spike-neuronen met een lage inputweerstand, langdurige actiepotentialen en uitgesproken spike-frequentieaanpassing.

De moleculaire analyse van deze neuron toonde de expressie van vGluT1, die zijn glutamitergic fenotype bevestigde. Deze neuron toonde ook somatostatine en de ATP1-alpha-1 en drie sub-eenheden van de natrium-kalium ATPAs. Biocy