Name: Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer eencellige multiplex RT-PCR na patch-clamp om genexpressieprofielen van individuele neuronen te analyseren. Deze methode helpt onderzoekers celbiologische diversiteit in de hersenen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr. Alexandre Mourot voor zijn opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gesteund door subsidies van het Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 en ANR-17-CE37-0010-03), BLG wordt ondersteund door de fellowship van de Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Wij danken het dier faciliteit van de IBPS (Parijs, Frankrijk).

De auteurs hebben niets te onthullen.

Single cell multiplex RT-PCR nadat patch-clamp kan gelijktijdig en betrouwbaar sonde de expressie van meer dan 30 genen in electrophysiologically geïdentificeerde cellen5. Analyse van genexpressie eencellige niveau vereist hoogefficiënte PCR inleidingen. Een van de meest beperkende maatregelen is de verzameling van de cel inhoud. Doeltreffendheid ervan is afhankelijk van de diameter van de patch Pipetteer tip, die zo groot mogelijk moet terwijl overeenkomen met de grootte van de cel. Pipetten met ...

De cerebrale cortex bestaat uit vele celtypes die betrokken zijn bij verschillende fysiologische processen. Hun identificatie en karakterisering, een voorwaarde is voor het begrip van hun specifieke functies, kunnen zeer uitdagend gelet op de grote morfologische, fysiologische en moleculaire diversiteit die kenmerkend corticale cel typen1 ,2,3,4.
Eencellige multiplex RT-PCR is gebaseerd op de combinatie van patch-clamp en RT-PCR technieken. Het kan tegelijkertijd de expressie van meer dan 30 vooraf gedefinieerde genen in electrophysiologically geïdentificeerde cellen5sonde. De opname van een neuronale tracer in de opname pipet verder kan de morfologische karakterisering van de opgenomen cellen na histochemische openbaring6,7,8,9, 10. het is een zeer nuttige techniek voor de indeling van neuronale typen op basis van multivariate analyse van hun fenotypische eigenschappen5,9,10,11,12 ,13,14. Eencellige multiplex RT-PCR is ook geschikt voor de karakterisatie van de non-neuronale cellen zoals astrocyten15,16,17, en vrijwel kan worden toegepast op elke hersenen structuur18, 19,20,21,22,23 en cel type, ervan uitgaande dat ze kunnen worden opgenomen in de configuratie van de gehele-cel.
Deze techniek is erg handig voor de identificatie van de cellulaire bronnen en/of doelstellingen van transmissie systemen7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vooral wanneer specifieke antilichamen ontbreken. Het steunt op patch-clamp opnames van visueel geïdentificeerde cellen29, en dus maakt het ook mogelijk de doelgerichtheid van cellen in een specifieke cellulaire omgeving8,15,16. Aangezien de cytoarchitecture van hersenweefsel bewaard in de hersenen segmenten gebleven is, maakt deze aanpak ook bovendien studie van de anatomische relaties van de gekarakteriseerd cellen met neuronale en non-neuronale elements7,8 , 18.
Omdat deze techniek beperkt door de hoeveelheid geoogste cytoplasma en de efficiëntie van de RT is, kan de detectie van mRNA uitgedrukt op lage exemplaaraantal moeilijk zijn. Hoewel andere benaderingen gebaseerd op RNaseq technologie toestaan om te analyseren de hele transcriptome van afzonderlijke cellen3,4,30,31, ze nodig hebben high-throughput dure sequencers niet noodzakelijkerwijs beschikbaar voor elk laboratorium. Aangezien de eencellige multiplex RT-PCR techniek eindpunt PCR gebruikt, vereist het alleen verkrijgbaar thermocyclers. Het kan gemakkelijk worden ontwikkeld in laboratoria die toegerust zijn met elektrofysiologische set-ups en vereist geen dure apparatuur. Het kan bieden, binnen een dag, een kwalitatieve analyse van de uitdrukking van een vooraf gedefinieerde set genen. Dus, deze aanpak biedt een gemakkelijke toegang tot de moleculaire karakterisering van afzonderlijke cellen op een snelle manier.

```html
<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Multiple alignement voor primer design</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Random primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT en PCR</td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / ontzilt en verdund bij 200 &micro;M</td></tr><tr><td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT en PCR</td></tr><tr><td>BT10 Series - 10 &micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT en PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 &micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT en PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 &micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT en PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 &micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT en PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>Agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>Agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>Agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>&Phi;X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>Smooth paper with satin appearance</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Patch clamp interne oplossing</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Patch clamp interne oplossing</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>Patch clamp interne oplossing</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Patch clamp interne oplossing</td></tr><tr><td>Potassium D-gluconate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Patch clamp interne oplossing</td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Patch clamp interne oplossing</td></tr><tr><td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td><td>Wescor</td><td></td><td>Patch clamp interne oplossing</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Patch clamp interne oplossing</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Snede voorbereiding</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Patch Clamp schoonmaak</td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>BX51WI Upright microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td><td>Sony</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Uitpersen</td></tr><tr><td>E Series with Straight Body (Holder)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Uitpersen</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Histochemische onthulling</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Histochemische onthulling</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Histochemische onthulling</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Histochemische onthulling</td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Histochemische onthulling</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Histochemische onthulling</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Histochemische onthulling</td></tr></tbody></table>
```

eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

De cerebrale cortex bestaat uit vele celtypes verschillende morfologische, fysiologische en moleculaire kenmerken vertonen. Deze diversiteit belemmert gemakkelijke identificatie en karakterisering van deze soorten cellen, vereisten voor het bestuderen van hun specifieke taken. Dit artikel beschrijft het multiplex eencellige omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) protocol, waardoor, na patch-clamp opnemen in plakjes, de expressie van tientallen genen in één cel tegelijk te detecteren. Deze eenvoudige methode kan worden geïmplementeerd met morfologische karakterisering en is breed inzetbaar voor het bepalen van de fenotypische kenmerken van verschillende celtypes en hun bijzondere cellulaire omgeving, zoals in de nabijheid van bloedvaten. Het principe van dit protocol is graag een cel met de patch-clamp techniek, oogst en reverse transcriberen cytoplasmatische inhoudelijk en kwalitatief detecteren de uitdrukking van een vooraf gedefinieerde set genen door multiplex PCR. Het vereist een zorgvuldige ontwerp van PCR inleidingen en intracellulaire patch-clamp oplossing compatibel met RT-PCR. Om ervoor te zorgen een selectieve en betrouwbare transcript vereist detectie, deze techniek ook adequate controle van het cytoplasma oogsten naar versterking stappen. Hoewel voorzorgsmaatregelen hier besproken moeten strikt worden gevolgd, kan vrijwel elke elektrofysiologische laboratorium de multiplex eencellige RT-PCR-techniek gebruiken.

Een representatieve validatie van multiplex RT-PCR is afgebeeld in Figuur 3. Het protocol is ontworpen om de sonde gelijktijdig de expressie van 12 verschillende genen. De vesiculaire glutamaat transporter vGluT1 werd opgevat als een positieve controle voor glutamaterge neuronen42. Het GABA synthese enzymen (GAD65 en GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) en Somatostatine (SOM) werden gebruikt als markers van GABAergic interneuronen<sup class="...

Dit protocol beschrijft de kritische stappen en voorzorgsmaatregelen moeten uitvoeren van eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp. Deze techniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het analyseren van het profiel van de expressie van een vooraf vastgesteld samenstel van genen van een enkele cel gekenmerkt door patch-clamp recordings.

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in neurowetenschappelijk onderzoek, zoals het karakteriseren van neuropopulaties of het identificeren van bronnen en doelwitten van transmissiesystemen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om snel en eenvoudig het expressieprofiel van een vooraf geselecteerde set genen van een enkele cel te bepalen. Dus deze methode kan inzicht geven in de willekeurige diversiteit van muizen.Het kan ook worden toegepast op andere celtypen, zoals astrocyten en in veel diermodellen. Deze demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de arresterende en inspirerende stappen moeilijk te leren kunnen zijn omdat de gegevens een hoeveelheid cytoplasma nodig hebben om te worden geanalyseerd. Voor het snijden, bereid een dissectiesetje voor met chirurgische schaar, fijne irisschaar, twee spatels, pincetten, een schijfje papierfilter en cyanoacrylaatlijm.Verzadig vervolgens de ijskoude snijoplossing met carbogyn en koel de snijdkamer af tot min 20 graden Celsius. Verwijder vervolgens de hoofdhuid van het dier en open de schedel. Trek de hersenen voorzichtig uit en plaats ze in een klein bekertje gevuld met carbogenat

single-cell-multiplex-reverse-transcription-polymerase-chain-reaction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Neuronen zijn in de eerste elektrofysiologische gekarakteriseerd. Dan het cytoplasma van de opgenomen neuron is opgezogen en onderworpen aan transcriptie-PCR analyse achteruit om de expressie van mRNA's voor de neurotransmitters synthese enzymen, ion kanalen en receptoren op te sporen.

Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Werkwijze voor het isoleren van een retinacellen en vervolgens amplificatie van de cDNA beschreven. Single-cell transcriptomics onthult de mate van cellulaire heterogeniteit aanwezig is in een tissue en onthult nieuwe marker-genen voor zeldzame celpopulaties. De bijbehorende protocol kan worden aangepast aan verschillende celtypen te passen.

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

Multi-elektrode patch-clamp vormen een complexe taak. Hier laten we zien hoe, door het automatiseren van veel van de experimentele stappen is het mogelijk om het proces dat tot kwalitatieve verbetering van de prestaties en het aantal opnamen versnellen.

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Dit protocol beschrijft hoe de expressie van een groot scala van genen op het klonale niveau te beoordelen. Single-cell RT-qPCR levert zeer betrouwbare resultaten met een sterke gevoeligheid voor honderden monsters en genen.

Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Dit artikel beschrijft hoe de ion-selectiviteit van channelrhodopsine wordt bepaald met elektrofysiologische whole-cell patch-clamp opnames met behulp van HEK293 cellen. Hier wordt de experimentele procedure voor het onderzoeken van chloride-selectiviteit van een anion-selectieve channelrhodopsine gedemonstreerd. De procedure is echter overdraagbaar naar andere channelrhodopsinen met een verschillende selectiviteit.

Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Leer eencellige multiplex RT-PCR na patch-clamp om genexpressieprofielen van individuele neuronen te analyseren. Deze methode helpt onderzoekers celbiologische diversiteit in de hersenen te begrijpen.

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

Meer video's verkennen