Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection
13 mei 2018
Smut schimmels veroorzaken vele verwoestende landbouw ziekten. Zij worden verspreid als slapende teliospores die in antwoord op het milieu signalen ontkiemen. Duidelijk naar voren komt twee methoden voor het onderzoek naar moleculaire veranderingen tijdens kieming: meten van verhoging van de ademhaling voor het detecteren van metabole activering en beoordelen van moleculaire gebeurtenissen wijzigen door het isoleren van teliospores in verschillende morfologische stadia.
Het algemene doel van de hier gepresenteerde procedures is om stadia van sporekieming te identificeren, zodat gentranscriptniveaus kunnen worden beoordeeld. Analyse van deze veranderingen zal verdere kennis verschaffen over een kritisch stadium in ziekteverspreiding. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over overgangen tijdens teliosporekieming die verband houden met veranderingen in gentranscriptniveaus en dus reflecteren op verschuivingen in genexpressiecontrole.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het overgangen in ademhalingsniveau identificeert die niet overeenkomen met zichtbare morfologische overgangen en het mogelijk maakt om teliospores fysiek te isoleren in verschillende stadia van kieming. Deze techniek heeft implicaties voor de controle van ziekteverwekkerverspreiding, omdat het ons in staat stelt om belangrijke overgangen in sporekieming te identificeren, die, indien gewijzigd, de verspreiding van ziekten kunnen blokkeren. Begin deze procedure met maïskolbinfectie, teliospore-oogst, evenals teliosporelevensvatbaarheid en kiemingstest, zoals beschreven in het tekstprotocol.
Om kieming te induceren, weeg eerst een gelijke hoeveelheid teliospores voor elk ademhalingsexperiment. Voeg in een bioveiligheidskast de teliospores toe aan een geautoclaveerde ademhalingskamer. Vul de kamer met aardappeldextrosebouillon, aangevuld met streptomycinesulfaat en kanamycinesulfaat.
Pipet op en neer om een teliosporesuspensie te maken. Plaats het kamerdeksel in de kamer om een luchtdichte afsluiting te maken. Om de OCR-meting te verkrijgen, plaats de kamer eerst in de kamerrek binnen een waterbad.
Plaats vervolgens de zuurstofsonde in de opening van de kamer. Bewaak de datapunten die in realtime verschijnen op het sensor trace rate-programma. Laat de sonde ongeveer drie minuten stabiliseren nadat de sonde in de kamer is geplaatst.
Klik op Meten om de zuurstofniveaus continu gedurende zes uur te meten met metingen die om de twee seconden worden geregistreerd. Stop de meting en herhaal deze stappen voor elk te analyseren monster voordat u de gegevens exporteert naar Microsoft Excel en de gegevensanalyse uitvoert zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats ongeveer 10 milligram umatus teliospores in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.
Suspensieer de teliospores in 500 microliters PDB aangevuld met streptomycinesulfaat. Pipet voorzichtig om te mengen totdat er geen klontjes teliospores in het medium zijn. Breng de teliosporesuspensie over naar een geautoclaveerde 250 milliliter Erlen Meyer kolom, die PDB bevat, aangevuld met streptomycinesulfaat.
Incubeer de kolom een nacht bij 28 graden Celsius, schudden bij 90 RPM. Bereid een Petri-schaal voor door vier tot vijf vijf-microliter druppels gedistilleerd water over de bovenkant van de Petri-schaal te pipetten. Pipet vervolgens drie twee-microliter druppels RNA-stabilisatieoplossing op de Petri-schaal die zal worden gebruikt voor monsterverzameling.
Pipet ook 30 vijf-microliter druppels van kiemkomen teliospores op de Petri-schaal. Voeg 15 milliliter minerale olie toe aan de Petri-schaal. Zorg ervoor dat alle druppels bedekt zijn met olie voordat u verder gaat.
Bereid vervolgens een microcapillair voor met een interdiameter van 15 micron, een flens van één millimeter, een lengte van 55 millimeter en een tiphoek van 20 graden. Plaats het in de microcapillairhouder en dompel het onder in de minerale olie, waar capillaire actie de minerale olie in de microcapillair zal laten komen. Laat de druk in de microcapillair los voordat u het naar de waterdruppel brengt.
Aspireer om de microcapillair met water voor te bereiden. Gebruik de bedieningselementen van de micromanipulator om de voorbereide microcapillair naar een van de kiemdruppels te verplaatsen en de druppel te penetreren. Laat de microcapillair zakken en breng de mond van de microcapillair naar een kiemkomen teliospore in het gewenste kiemingstadium.
Aspireer langzaam om de kiemkomen teliospore te vangen. Stop met aspireren zodra de teliospore de microcapillair is binnengegaan. Herhaal tot er ongeveer vijf teliospores in de microcapillair zijn.
Til de microcapillair op met de micromanipulator en breng hem naar de opvangdruppel van RNA-stabilisatieoplossing. Dring de druppel binnen en injecteer de teliospores in de druppel. Herhaal deze stappen totdat ongeveer 1.000 teliospores zijn gevangen.
Om de opvangdruppel te herstellen, pipet de opvangdruppel op en breng deze over naar het deksel van een RNA's DNA's vrije 2,0 milliliter microcentrifugebuis. Pipet voorzichtig de minerale olie zonder de opvangdruppel te verstoren. De teliospores kunnen nu worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals RNA-isolatie.
Deze grafiek illustreert een typisch resultaat van het beoordelen van veranderingen in zuurstofniveau in suspensies van teliospores die tot kieming zijn geïnduceerd. Relatief tot niet-geïnduceerde teliospores, vindt de scheiding die het begin van ademhaling aangeeft plaats na ongeveer 30 minuten. Gezien het feit dat het ongeveer 15 minuten duurt om de steekproef op te zetten en naar de zuurstofsonde te vervoeren, is deze tijd eigenlijk 45 minuten.
Hier getoond, zijn de vijf stadia van teliosporekieming. In stadium een worden teliospores geïnduceerd om te kiemen, maar vertonen geen morfologisch teken van kieming. Teliospores in stadium twee vertonen een uitgekomen promycelium met een lengte minder dan de diameter van de teliospore.
In stadium drie is de lengte van het promycelium groter dan de diameter van de teliospore. Stadium vier wordt gekenmerkt door promycelia met aangehechte basidiosporen. En in stadium vijf zijn er knopvormende basidiosporen.
Hier worden de asynchronisch kiemkomen teliospores getoond en is de microcapillair gepositioneerd nabij een teliospore in stadium drie. De teliospore in stadium drie wordt vervolgens in de microcapillair geaspireerd en overgebracht naar een druppel opvangoplossing. Eenmaal onder de knie, kan deze microdissectietechniek worden gebruikt om 1.000 stadiumspecifieke telios
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt methoden om de moleculaire veranderingen tijdens de kieming van teliosporen van roetschimmels te onderzoeken. Door de respiratie te meten en teliosporen in verschillende stadia te isoleren, kunnen onderzoekers inzicht verkrijgen in de metabole activatie en de controle van genexpressie tijdens deze kritieke fase.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Plantpathologie
- Schimmelbiologie
Achtergrond
- Roestschimmels zijn verantwoordelijk voor aanzienlijke landbouwziekten.
- Teliosporen zijn latent en kiemen in reactie op omgevingsfactoren.
- Inzicht in de kieming is essentieel voor het beheersen van de verspreiding van de ziekte.
- Gen-transcriptieniveaus veranderen tijdens de kieming van sporen.
Doel van de studie
- Om de stadia van sporengerminatie te identificeren.
- Om de niveaus van gentranscripten tijdens de germinatie te beoordelen.
- Om overgangen die gekoppeld zijn aan de controle van genexpressie te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Meting van de toename in respiratie om metabole activering te detecteren.
- Isolatie van teliosporen in verschillende morfologische stadia.
- Beoordeling van de levensvatbaarheid van teliosporen en kiemtesten.
- Analyse van veranderingen in gentranscripten tijdens het kiemen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van respiratoire overgangen die niet gekoppeld zijn aan zichtbare morfologische veranderingen.
- Fysieke isolatie van teliosporen in verschillende kiemstadia.
- Inzichten in cruciale overgangen die de verspreiding van de ziekte kunnen blokkeren.
- Verbeterd begrip van het kiemproces bij roetschimmels.
Conclusies
- De gepresenteerde methoden bieden een kader voor het bestuderen van sporengerminitatie.
- Het identificeren van metabolische veranderingen kan bijdragen aan strategieën voor ziektebestrijding.
- Verder onderzoek zou kunnen leiden tot een verbeterde beheersing van landbouwkundige ziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Precieze meting van de teliosporenrespiratie en stadiumspecifieke microdissectie maken mechanistische risicoreductie mogelijk in onderzoek naar schimmelpathogenen, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid in vroege ontdekkingsfasen. Deze workflow verduidelijkt metabole en morfologische overgangen die cruciaal zijn voor targetvalidatie en de afstemming van translationele biomarkers bij de bestrijding van plantenpathogenen. De aanpak ondersteert risicogebaseerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van antifungale strategieën in biotechnologische portfolio's voor de landbouw.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar metabole activering en overgangen in genexpressie tijdens de kieming van teliosporen.
- Ondersteunt functionele validatie van doelwitten door respiratoire veranderingen te koppelen aan moleculaire gebeurtenissen.
- Faciliteert biologische risicoreductie door asynchrone kiemingsstadia te isoleren voor downstream-analyse.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het identificeren van interventiepunten om de verspreiding van pathogenen te blokkeren.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt stadiumspecifieke teliospoormonsters voor voor gestandaardiseerde downstream moleculaire analyses.
- Maakt reproduceerbare kwantificering van het zuurstofverbruik als functionele readout mogelijk.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van de analyse door het mogelijk maken van de verzameling van grote aantallen gesynchroniseerde sporen.
- Biedt gevalideerd biologisch materiaal voor compound screening of transcriptomische profilering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt metabolische en morfologische markers uit met ziekte-relevante overgangen bij schimmelpathogenen.
- Maakt continuïteit mogelijk van metabolische profilering in de ontdekkingsfase tot preklinische validatie van antifungale targets.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen door de timing en volgorde van kiemingsgebeurtenissen die relevant zijn voor de verspreiding van de ziekte te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert de fasen van vroege ontdekking tot lead-identificatie door hypothesetesten op metabole activatie mogelijk te maken en ondersteuning te bieden voor downstream moleculaire analyses.
- Ontdekkingsbiologie: Levert kwantitatieve respiratiegegevens om de activering van kiempaden en biologische risicoreductie te verduidelijken.
- Screening: Levert stadiumspecifieke, reproduceerbare monsters voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Genereert continue zuurstofconsumptiemetingen voor een robuuste statistische vergelijking van kiemingscondities.
- Translationeel onderzoek: Koppelt metabole en morfologische overgangen aan ziekterelateerde fenotypes bij plantpathogenen.
- Bedrijfbrede herutilisatie: Vestigt een herbruikbare workflow voor het onderzoeken van kieming in diverse schimmelsoorten die impact hebben op de landbouw.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert monsterbereiding en meting voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door interventiepunten te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van antifungale targets en strategieën.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microdissectie en steriele techniek voor stadiumspecifieke isolatie.
- Toegang tot respirometrie van het Clark-type en instrumentatie voor micromanipulatie is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams voor monsterbehandeling en data-analyse is vereist.
- Aanpasbaar aan andere schimmelpathogenen met een vergelijkbare ontkiemingsbiologie.
- De initiële leercurve voor microdissectie kan de doorvoersnelheid voor nieuwe gebruikers beïnvloeden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
TItle
1:01
Induction of Germination for Respiration Monitoring and Obtaining Oxygen Consumption Rate (OCR) Measurements
2:34
Induction of Teliospore Germination to Isolate Teliospores at Distinct Stages of Germination and Preparation of Micromanipulator
4:34
Isolation of Stage-specific Germinating Teliospores
6:01
Results: Microrespiration Analysis and Microdissection for Assessing Teliospore Germination
7:32
Conclusion
