Name: Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer hoe je teliosporen van smut-schimmels isoleert met microdissectie en microrespiratie-analyse. Deze methode identificeert metabole overgangen en genexpressieveranderingen tijdens de kieming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Dr. Paul Frost voor gebruik van zijn microrespirometer, en Nicole Wagner en Alex Bell voor technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van NSERC naar B.J.S.

1. corn Cob infectie
<ol><li>Zea mays (cv. Golden Bantam) groeien totdat cobs worden gevormd en zijn begonnen met zijde (ongeveer 60 dagen).</li>
	<li>Cultuur compatibel haploïde U. maydis stammen gebruikt standaard protocollen zoals eerder beschreven7.</li>
	<li>Maïskolven met behulp van standaardprotocollen zoals eerder beschreven7infecteren.</li>
</ol>2. teliospore oogsten
<ol><li>Autoclaaf apparatuur (Büchner trechters, Büchner kolven, blenders, centrifuge flessen van 250 mL, platte spatels en water) met behulp van een standaard droge cyclus met ten minste 30 min sterilisatie bij 121 ° C (vloeibare standaardcyclus voor water).</li>
	<li>Verwijder besmette cobs van planten (ongeveer 28-35 dagen post infectie) met behulp van een scheermes en de cobs instellen op een dienblad bedekt met de beschermer van de Bank.</li>
	<li>Verwijder de tumoren uit kolven met een scheermesje en verzamelen in een bekerglas.</li>
	<li>Vul een 250 mL laboratorium blender beker met tumoren tot ongeveer 1/3 vol en voeg gesteriliseerde met autoclaaf dH2O totdat de blender beker ongeveer 3/4 is volledige. De tumoren verstoren door de blender aan lage, pulserende tot gehomogeniseerd.</li>
	<li>Sluit de vacuümpomp aan een val van water, en dan over in een maatkolf van 1 L Büchner.</li>
	<li>Plaats grote Büchner trechter in de kolf en lijn de bodem van de trechter Büchner met vier lagen voor kaasdoek.</li>
	<li>Zet de vacuümpomp aan.</li>
	<li>Giet een gedeelte van de gehomogeniseerde tumoren door de kaasdoek en schraap met een spatel.</li>
	<li>Giet wat dH2O in de kaasdoek om te spoelen van de teliospores door.</li>
	<li>Herhaal totdat de dH2O komen door de Kaasdoek is duidelijk.</li>
	<li>Wringen uit de kaasdoek met het gehomogeniseerde tumor materiaal in het filter om ervoor te zorgen maximale teliospore herstel.</li>
	<li>Wanneer de Büchner maatkolf van 1 L wordt steeds dicht bij volledige, leeg te maken in een grote erlenmeyer en zet het opzij.</li>
	<li>Een nieuw stuk kaasdoek gestoken in het filter en herhaalt u de stappen (2.7-2.12) totdat alle van de tumoren hebben verstoord en gefilterd.</li>
	<li>Giet de gefilterde teliospores in gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL centrifuge flessen en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Herhaal stap 2.14 totdat alle van de gefilterde teliospores zijn Ingehuld door centrifugeren.</li>
	<li>Schorten de korrels in een kleine hoeveelheid water en overdracht aan 50 mL centrifuge buizen.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Suspendeer de pellet in ongeveer 50 mL dH2O, centrifugeren van de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie. Zachtjes Schraap de grijze bovenlaag met een spatel en de afzet daarvan. Herhaal totdat er niet langer een grijze laag bovenop is.</li>
	<li>Droog de monsters overnachting in een vacuüm exsiccator.</li>
	<li>Gedroogde teliospores bij 4 ° C bewaren tot gebruik.</li>
	<li>
Indien gewenst, behandelen de teliospores met kopersulfaat8 voordat inducerende te ontkiemen. Indien niet behandeld, voer dan grondige microscopische analyse van de teliospores om het monster vertegenwoordigt pure teliospores en is verstoken van bacteriële of andere verontreinigingen te bevestigen.
	<ol>
<li>Weeg ongeveer 50 mg teliospores in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.</li>
		<li>Ongeveer 1,0 mL 0,75% CuSO4 aan de tube van de 1,5 mL-microcentrifuge met de teliospores toevoegen. Pipetteer omhoog en omlaag om op te schorten de teliospores in de CuSO4 oplossing gevolgd door schudden van het monster gedurende 3 uur.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 2.500 x g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de pellet teliospore met steriel water, herhaal het centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Herhaal stap 2.21.3 twee meer tijden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. teliospore levensvatbaarheid en kiemkracht Test
<ol><li>Weeg ongeveer 10 mg van U. maydis teliospores in een tube microcentrifuge 1,5 mL te beoordelen hun levensvatbaarheid en de timing van kiemkracht.</li>
	<li>Bereiden in een kabinet bioveiligheid, aardappel dextrose Bouillon (VOB, 24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL).</li>
	<li>Opschorten van de teliospores in 500 µL van het VOB. Pipetteer zachtjes breken alle klontjes van teliospores te mengen.</li>
	<li>Spoel de suspensie van teliospore tot een gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL conische kolf met 10 mL van het VOB.</li>
	<li>Incubeer de kolf bij 28 ° C schudden bij 90 t/min voor 12-16 h.</li>
	<li>Verwijder in een kabinet bioveiligheid, 20 µL eenmonstervan de teliospores geïnduceerde te ontkiemen en bereiden een microscoopglaasje.</li>
	<li>
Met behulp van een Microscoop, visueel beoordelen stadia van kiemkracht die aanwezig zijn en de aanwezigheid van bacteriële besmetting.
	<ol>
<li>Het aantal teliospores in stadia ik via V met behulp van een hemocytometer en het bepalen van het percentage dat zijn ontkiemd.</li>
		<li>Als enige fase I teliospores aanwezig zijn, blijven broeden de kolf voor een totaal van 24 h vóór teliospore kieming te beoordelen. Incubatie gedurende maximaal 48 uur voordat het monster niet-levensvatbare die blijven.</li>
		<li>Als bacteriële besmetting aanwezig is, vullen van het VOB met kanamycine sulfaat (50 µg/mL) en streptomycine sulfaat (160 µg/mL) en herhaalt u vervolgens stap 3.1 tot en met 3.7. Als bacteriële besmetting aanhoudt, teliospores met koper sulfaat te behandelen en herhaal stap 3.1 tot en met 3.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. de inductie van kiemkracht voor de controle van de ademhaling
<ol><li>Weeg gelijke hoeveelheid (bv., 50 mg) van de teliospores voor elke ademhaling-experiment.</li>
	<li>In een kabinet bioveiligheid, voegt u teliospores toe aan een gesteriliseerde met autoclaaf ademhaling kamer.</li>
	<li>Vul de zaal met VOB (24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL) en kanamycine sulfaat (50 µg/mL).</li>
	<li>Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt maken van de opschorting van een teliospore.</li>
	<li>Plaats het deksel van de kamer in de kamer maken luchtdicht zegel.</li>
</ol>5. het verkrijgen van zuurstof verbruik tarief (OCR) metingen
<ol><li>Plaats het Parlement in het zaal-rek in een waterbad (voorverwarmd tot 28 ° C).</li>
	<li>Plaats de O2 sonde binnen de opening van de kamer.</li>
	<li>Controleren van de gegevenspunten weergegeven in real time op het programma "SensorTrace Rate", en laat de sonde stabiliseren (~ 3 min nadat de sonde is geplaatst in de zaal).</li>
	<li>Klik op "Maatregel" voor het meten van O2 niveaus voortdurend voor 6 h met metingen opgenomen 2 s tussenpozen.</li>
	<li>Stoppen van de meting en herhaalt u stappen 4.1-5.4 voor elk monster te analyseren.</li>
	<li>De gegevens exporteren naar Microsoft Excel door te klikken op "bestand | Exporteren | Opslaan als xls".</li>
</ol>6. de gegevensanalyse
<ol><li>
Berekenen van OCR
	<ol>
<li>Opnemen in het geëxporteerde Excel-bestand onder het tabblad "Within_Rates", de "Rate" voor elke kamer meting (nmol/h).</li>
		<li>Voor elk experimenteel monster, aftrekken van de "Rate" van de lege kamer van de "Rate" van de experimentele monsterkamer om een gecorrigeerde OCR-waarde te verkrijgen, en neem de absolute waarde van dit nummer.</li>
		<li>Bereken de totale OCR per mg teliospores door de gecorrigeerde waarde voor absolute OCR te delen door de mobiele massa gebruikt.</li>
		<li>Gemiddelde repliceren "OCR per mg teliospores" waarden voor elke stam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseren van de gegevens met behulp van geschikte statistische methode (bv., student t-test, variantie-analyse) met behulp van Microsoft Excel van andere statistische software.</li>
	<li>Grafiek van de ruwe gegevens te berekenen van het percentage zuurstof resterende voor elk tijdstip dat u wenst te grafiek. Verdelen van de eerste lezing door zelf en vermenigvuldig met 100 (100% zuurstof resterende), vervolgens elke latere lezing verdelen door de eerste lezing en vermenigvuldig met 100 om het percentage zuurstof in de kamer blijft.</li>
</ol>7. de inductie van Teliospore kieming te isoleren van Teliospores in verschillende stadia van kiemkracht
<ol><li>VOB (24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL) in een kabinet bioveiligheid voor te bereiden.</li>
	<li>Plaats ongeveer 10 mg van U. maydis teliospores in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.</li>
	<li>Opschorten van de teliospores in 500 µL van het VOB. Pipet zachtjes te mengen zolang er geen klontjes van teliospores in het medium niet zijn.</li>
	<li>Breng de teliospore een gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL-kolf met VOB aangevuld met streptomycine sulfaat.</li>
	<li>Incubeer de kolf 's nachts bij 28 ° C schudden bij 90 t/min.</li>
</ol>8. bereiding van de petrischaal en Micromanipulator
<ol><li>
Voorbereiden op een petrischaal (57 cm2) door pipetting rijen van druppeltjes microcapillary voorbereiding en sample collectie.
	<ol>
<li>Pipetteer 5 µL (x 4) dH2O druppels aan de bovenkant van de petrischaal.</li>
		<li>Pipetteer 2 µL (x3) van RNA stabilisatie oplossing op de petrischaal voor sample collectie moet worden gebruikt.</li>
		<li>Pipetteer 5 µL (x 30) druppels met teliospores op de petrischaal ontkiemen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 15 mL minerale olie tot de petrischaal. Zorg ervoor dat alle druppels olie alvorens vallen.</li>
	<li>Bereid een microcapillary met een 15 µm inwendige diameter, 1 mm flens, 55 mm lengte en een hoek van 20° tip door plaatsen in de microcapillary houder en dompelen het in de minerale olie waar capillaire actie zorgt ervoor dat de minerale olie om in te voeren van de microcapillary. Laat de druk in de microcapillary alvorens het naar de druppel water. Gecombineerd om voor te bereiden van het microcapillary met water.</li>
</ol>9. isolatie van fase-specifieke ontkiemen Teliospores
<ol><li>Met behulp van de besturingselementen van de micromanipulator, de bereid microcapillary naar één van de kiemkracht druppels verplaatsen. Doordringen de druppel, verlaag de microcapillary en brengen van de monding van de microcapillary tot een kiemende teliospore het stadium van kieming van belang.</li>
	<li>Langzaam gecombineerd om vast te leggen van de ontkiemende teliospore. Stoppen met zuigen zodra de teliospore is de microcapillary. Herhaal totdat er ongeveer vijf teliospores in de microcapillary zijn.</li>
	<li>Verhogen van de microcapillary met de micromanipulator en breng het aan de collectie druppel van RNA stabilisatie oplossing. Doordringen van de druppel en injecteren van de teliospores in de druppel.</li>
	<li>Herhaal stap 8.1 naar 8.3 tot ongeveer 1000 teliospores zijn vastgelegd.</li>
</ol>10. invordering van collectie druppel
<ol><li>Pipetteer van de collectie druppel en het overbrengen naar het deksel van een tube RNase/DNase-gratis 2,0 mL microcentrifuge. Verwijder voorzichtig de minerale olie met een pipet zonder verstoring van de collectie druppel.</li>
	<li>Gebruik de teliospores voor downstream toepassingen zoals RNA isolatie.</li>
</ol>

<ol><li>Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaville%2C+BJ+%22Meiosis+-+Molecular+Mechanisms+and+Cytogenetic+Diversity%22">Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity</a>. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).</li>
<li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="https://trove.nla.gov.au/work/14819898">Monograph Number 2</a>. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).</li>
<li>Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).</li>
<li>Allen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.py.03.090165.001525">Metabolic aspects of spore germination in fungi.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).</li>
<li>Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).</li>
<li>Ostrowski, L. A., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antisense+transcripts+are+linked+to+the+modulation+of+mitochondrial+function+and+teliospore+dormancy+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis.</a> Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).</li>
<li>Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/07060661.2012.697077">Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).</li>
<li>Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unh1%2C+an+Ustilago+maydis+Ndt80-like+protein%2C+controls+completion+of+tumor+maturation%2C+teliospore+development%2C+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis.</a> Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).</li>
<li>Stade, S., Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+during+fungal+spore+germination%3A+respiration+and+cytochrome+c+oxidase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa.</a> J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).</li>
<li>Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+developing+mitochondrial+genetic+and+respiratory+functions+in+germinating+fungal+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).</li>
<li>Sacadura, N. T., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+EST+analyses+of+Ustilago+maydis+germinating+teliospores%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores.</a> Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).</li>
<li>Hilderbrand, E. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4353196">Techniques for the isolation of single microorganisms.</a> Botanical Review. 4 (12), 38(1938).</li>
<li>Seto, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Analysis+of+gene+transcripts+during+Ustilago+maydis+teliospore+dormancy+and+germination%22">Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination</a>. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).</li>
<li>Fröhlich, J., König, H. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783540281801">Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates</a>. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).</li>
<li>Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/cca7/01a80499de99d3bb5f3bbf4ead24b6bf3d5d.pdf">Single spore isolation of fungi.</a> Fungal Diversity. 3, 11(1999).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S007668790250954X">Getting started with yeast.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).</li>
<li>Chen, Y., Seguin-Swartz, G. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/07060660309507000">A rapid method for assessing the viability of fungal spores.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten bekend te maken.

Lange biotrophic plant ziekteverwekkers worden jaarlijks miljarden dollars in gewas verliezen veroorzaken. De overgrote meerderheid van deze ziekteverwekkers produceren teliospores, die integraal deel van de schimmel versnippering en geslachtelijke voortplanting uitmaken. Verkrijgen van kennis van de ontwikkeling en de kiemkracht van teliospores is van cruciaal belang voor het begrip van de verspreiding van de verwoestende ziekten veroorzaakt door deze schimmels. Teneinde de moleculaire veranderingen op belangrijke contr...

De vuiligheid schimmels (Ustilaginales) bestaan uit meer dan 1600 soorten die grassen met inbegrip van de belangrijke graan, maïs, gerst en tarwe infecteren, waardoor miljarden dollars in gewas verliezen jaarlijks1. Deze schimmels worden gekenmerkt door de productie van teliospores, die hebben darkly gepigmenteerde celwanden en de versnippering agenten. Teliospores functie voor het beschermen van genetisch materiaal tijdens de stress van verspreiding tussen waardplanten, en in een slapende toestand van jaar2kan aanhouden. Zo, zijn teliospores een essentieel onderdeel van de verspreiding van de ziekte.
Om te kunnen studeren teliospore biologie, ons laboratorium maakt gebruik van de model smut schimmel Ustilago maydis (U. maydis), oftewel het oorzakelijke agens van de ziekte 'gemeenschappelijk vuiligheid van maïs'. Oudere U. maydis teliospores worden gekenmerkt door groei arrestatie, verminderde cellulaire metabolisme en lage niveaus van cellulaire ademhaling3. In gunstige milieu-omstandigheden (bijv., de aanwezigheid van specifieke suikers), U. maydis teliospores ontkiemen en voltooien van meiose, produceren basidiospores, die dit leiden nieuwe rondes van infectie tot kunnen. Kieming wordt gekenmerkt door de verhoogde ademhaling, de terugkeer naar de metabole activiteit en de progressie door waarneembare morfologische stadia van kiemkracht4.
De eerste fase van kiemkracht omvat verhoogde ademhaling en metabole functie, er zijn echter geen morfologische aanwijzingen van verandering. De oorspronkelijke metingen van respiratoire verandering in U. maydis werden uitgevoerd meer dan 50 jaar geleden, meten van zuurstofverbruik manometrically met een Warburg kolf apparaat5. We hebben een nieuwe, eenvoudige methode voor het bestuderen van de precieze veranderingen in de ademhaling tijdens de kieming van het teliospore door het meten van zuurstofverbruik over een tijdsverloop van kieming met behulp van een Clark-type microrespirometer ontwikkeld. Wij eerder gebruikt deze methode bij het bestuderen van de veranderingen in respiratoire tarief tussen wild-type U. maydis haploïde cellen en mutanten met defecte mitochondriën6, en hebben het protocol hier aangepast om veranderingen in teliospore ademhaling tijdens studie kieming. Dit biedt een manier om de timing van ademhaling verandering nauwkeurig te identificeren zodat we teliospores op het juiste moment na de inleiding van kieming richten kunnen te onderzoeken van vroege moleculaire gebeurtenissen. De progressie van kieming kan microscopisch worden gevolgd, zodra de promycelia naar voren uit de teliospore komt, maar de asynchrone aard geremd het isolement van genoeg teliospores op een gegeven moment voor onderzoek. Wij ontwikkelden een microdissection techniek vergelijkbaar met die voor in vitro bevruchting gewend fysiek teliospores te verzamelen in verschillende morfologische stadia van kiemkracht.

<table><tbody><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>BioShop</td><td>STP101</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>BioShop</td><td>KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Potato Dextrose Broth</td><td>BD Difco</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>1 L Waring Laboratory blender</td><td>Waring</td><td>7011S</td><td></td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>VWR</td><td>470150-438</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>Unisense MicroRespiration system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroRespiration Sensor (O2)</td><td>Unisense</td><td>OX10</td><td></td></tr><tr><td>MicroOptode Meter Amplifier</td><td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MR-Ch Small</td><td>Unisense</td><td>MR-Ch</td><td></td></tr><tr><td>SensorTrace Rate Software</td><td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MicroRespiration Rack</td><td>Unisense</td><td>MR2-Rack</td><td></td></tr><tr><td>MicroRespiration Stirrer</td><td>Unisense</td><td>MR2-Co</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse Manipulator</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>TransferTip (ES)</td><td>Eppendorf</td><td>5175107004</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek naar teliospore kieming met behulp van microrespiration analyse en microdissection

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut schimmels zijn de etiologische agenten van verschillende verwoestende landbouw ziekten. Ze worden gekenmerkt door de productie van teliospores, die verspreiding dikwandige agenten. Teliospores kunnen slapende blijven voor decennia. De rustperiode wordt gekenmerkt door lage stofwisseling, onderbroken macromoleculaire biosynthese en sterk verlagingen van de ademhaling. Na ontvangst vereist Milieusignalen, ontkiemen teliospores te produceren haploïde cellen, die dit leiden nieuwe rondes van infectie tot kunnen. Teliospore kiemkracht wordt gekenmerkt door de hervatting van de macromoleculaire biosynthese, verhoogde ademhaling en dramatische morfologische veranderingen. Om te precies meten veranderingen in cellulaire ademhaling tijdens de vroege stadia van kiemkracht, hebben we een eenvoudig protocol met een Clark-type respirometer ontwikkeld. De latere stadia van kiemkracht worden onderscheiden door specifieke morfologische veranderingen, maar kiemkracht asynchroon is. We ontwikkelden een techniek van de microdissection waarmee we kunnen verzamelen van teliospores in verschillende kiemkracht stadia.

Met behulp van de Clark-type microrespirometer gebaseerde methode voor het meten van veranderingen in de ademhaling tijdens de rustperiode van de teliospore en de kiemkracht, bevestigd we dat slapende teliospores een lage niveau van de ademhaling (~ 1.075 µmol/h/mg vertonen) vergeleken met ontkiemen teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figuur 1A). Dit betekent een ~2.4-fold verandering in gemiddelde snelheid van de ademhaling tussen slapende teliospores en teliosp...

Smut schimmels veroorzaken vele verwoestende landbouw ziekten. Zij worden verspreid als slapende teliospores die in antwoord op het milieu signalen ontkiemen. Duidelijk naar voren komt twee methoden voor het onderzoek naar moleculaire veranderingen tijdens kieming: meten van verhoging van de ademhaling voor het detecteren van metabole activering en beoordelen van moleculaire gebeurtenissen wijzigen door het isoleren van teliospores in verschillende morfologische stadia.

Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Het algemene doel van de hier gepresenteerde procedures is om stadia van sporekieming te identificeren, zodat gentranscriptniveaus kunnen worden beoordeeld. Analyse van deze veranderingen zal verdere kennis verschaffen over een kritisch stadium in ziekteverspreiding. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over overgangen tijdens teliosporekieming die verband houden met veranderingen in gentranscriptniveaus en dus reflecteren op verschuivingen in genexpressiecontrole.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het overgangen in ademhalingsniveau identificeert die niet overeenkomen met zichtbare morfologische overgangen en het mogelijk maakt om teliospores fysiek te isoleren in verschillende stadia van kieming. Deze techniek heeft implicaties voor de controle van ziekteverwekkerverspreiding, omdat het ons in staat stelt om belangrijke overgangen in sporekieming te identificeren, die, indien gewijzigd, de verspreiding van ziekten kunnen blokkeren. Begin deze procedure met maïskolbinfectie, teliospore-oogst, evenals teliosporelevensvatbaarheid en kiemingstest, zoals beschreven in het tekstprotocol.Om kieming te induceren, weeg eerst een gelijke ho

investigating-teliospore-germination-using-microrespiration-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Micromanipulatie van de gistcellen is nodig voor de meiose genetische analyse of om diploïde zygoten te selecteren. Deze micromanipulations worden uitgevoerd met behulp van de microneedle van een dissectie microscoop. De microneedle wordt gebruikt om de cellen te verplaatsen en wordt gecontroleerd door een micromanipulator die beschikbaar zijn met een verschillende mate van automatisering.

Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Source: Wen, J., Pasman, et. al., Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of structured illumination microscopy to acquire three-dimensional fluorescence images that reveal the organization of germination proteins within the bacterial spore.

Visualization of Germination Proteins in the Inner Membrane of Bacterial Spores

Hier beschrijven we een colorimetrische test om de aanwezigheid van reducerende suikers te detecteren tijdens de kieming van bacteriële sporen.

Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

Dit protocol illustreert de belangrijke opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de beoordeling van de relevantie van het toezicht op de parameter van de vitaliteit en DNA-herstelsynthese in de heropleving van sporen van Bacillus subtilis na behandeling met lage druk plasma door tracking fluorescentie-gelabelde DNA repair eiwitten via time-resolved confocale microscopie en elektronenmicroscopie scannen.

Onderzoek naar de nadelige effecten van lage druk Plasma sterilisatie op het voortbestaan van Bacillus subtilis sporen met behulp van Live cel microscopie

Beschrijven we een methode voor het onderzoeken van de mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, naar elongate via zeer smalle openingen (~ 1 µm) in een microfluidic apparaat.

Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes

Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Germinant receptor eiwitten cluster in 'germinosomes' in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Leer hoe je teliosporen van smut-schimmels isoleert met microdissectie en microrespiratie-analyse. Deze methode identificeert metabole overgangen en genexpressieveranderingen tijdens de kieming.

Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection

Meer video's verkennen