Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels
June 16th, 2018
Hier, detail we de experimentele technieken gebruikt om te evalueren van de uitsteeksel krachten die podosomes van toepassing op een compatibele film, vanaf de voorbereiding van de film naar de geautomatiseerde analyse van topografische beelden.
Het algemene doel van deze procedure is om uitsteekselkrachten te kwantificeren met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst de met formvar beklede rasters voor te bereiden en de dikte van deze film te meten. De derde stap van dit proces bestaat uit het plaatsen van cellen op de rasters en ze laten hechten.
De laatste stap van de procedure is om de forma-film onder de cellen te beeldvormen met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Bij het hechten aan het substraat, vormen microfagocyt microscopische hechtingsstructuren, zogenaamde podosomen. Uiteindelijk zal de vervorming van de film door podosomen worden gekwantificeerd en omgezet in krachten met behulp van een zelfgemaakt mechanisch model.
Plaats een met ethanol gereinigd glazen licht in het trechtervormige filmafgietapparaat en dek de bovenkant van de trechter af. Doe de fomvar-oplossing in de trechter tot het niveau twee derde van de dia bereikt. Laat het een minuut staan en laat vervolgens de fomvar-oplossing in een gelijkmatige stroom wegvloeien.
Merk op dat de dikte van de film afhangt van zowel de stroomsnelheid als de concentratie van de fomvar-oplossing. Droog dit licht donker en snijd er rechthoeken uit met een scherp scheermesje. Dompel de dia in uw beker gevuld met gedistilleerd water zodat de fomvar-film op het wateroppervlak drijft.
Plaats voorzichtig met aceton gereinigde rasters op de films, met de glanzende kant naar boven, met een dekglas van 12 millimeter diameter bovenop sommige van hen. Ze zullen worden gebruikt voor het experiment om de dikte te bepalen. Dompel uiteindelijk een met sticker bedekt dia om de hele film en rasters te herstellen.
Gebruik pincetten om de glazen dekglas af te bakenen om de formvar te snijden en deze los te maken van de dia. Monteer de locatie van het raster onder het dekglas en gebruik vervolgens pincetten om het raster af te tekenen om het los te trekken. Het gat in de formvar-film dat hierdoor ontstaat, zal worden afgebeeld om de dikte ervan te meten.
Monteer een siliconen nitraatcont-afgifte in het AFM-glasblok en zorg ervoor dat de gouden streep niet onder de punt van de veer zit. Monteer het glasblok op de AFM-module en plaats deze vervolgens op de microscoopstandaard. Plaats de met fomvar beklede dekglas op de observatiekamer met PBS erop.
Scan de rand tussen fomvar en glas in contactmodus en met een punt van 0,5 nano newton. Gebruik in de dataverwerkingssoftware het glasoppervlak als hoogtereferentie en meet de dikte van de fomvar op de doorsnede. Neem onder een steriele kap een dekglas van 12 millimeter en plak er een strook met gatzijdetape op.
Teken de met fomavr beklede raster af met pincetten en plaats het met de glanzende kant naar boven zodat alleen de zijden aan het plakband hechten. Dit is om te voorkomen dat fomvar scheurt bij het verwijderen van het raster van het plakband. Plaats de dekstrip in een steriele zesputsplaat en pipet een druppel van 10 millimeter serumvrij kweekmedium erin.
Het zou ongeveer 10 duizend cellen moeten bevatten en in dit geval zijn dit microfagocyt gedifferentieerd uit humane monocyten. Zorg ervoor dat u het raster niet aanraakt met de pipettip tijdens het proces, om schade aan de fomvar-coating te voorkomen. Incubeer gedurende een half uur om de cellen te laten hechten, vul vervolgens de put met kweekmedium aangevuld met serum en incubeer opnieuw gedurende twee uur, voordat de AFM-observatie plaatsvindt.
Plaats twee parallelle stroken dubbelzijdig plakband op een glasbodem petrischaal, zorg ervoor dat de breedte ertussen iets kleiner is in vergelijking met uw rasterdiameter. Trek vervolgens het raster dat eerder met cellen is bezaaid los en plaats het op de twee plakbandstrips met de cellen naar beneden. Bevestig het raster door er twee andere stroken bovenop te plaatsen.
Vul de schaal met voorverwarmd kweekmedium aangevuld met hepe's. Plaats de schaal in de schaalverwarmer die eerder op 37 graden Celsius is ingesteld. Installeer de set op de AFM-standaard.
Wanneer de systeemtemperatuur stabiel is op 37 graden Celsius, gaat u verder met het scannen van het fomvar-oppervlak, wat in contactmodus moet worden uitgevoerd, met een setpunt van 0,95 nano newton en visualiseer de protozoa-geassocieerde vervormingen in het weergavevenster van de afwijkingsgegevens. Hier zijn de representatieve resultaten en verwerkingsstappen om vormingen met AFM te verkrijgen tot de grafische metingen. Zoals u op deze afbeelding kunt zien, worden uitstulpingen op het fomvar-oppervlak gedetecteerd.
Om deze fotografische informatie om te zetten in krachtwaarden is het noodzakelijk om eerst toegang te hebben tot het lokale hoogteverschil. Om dit te doen, moet een polynoomfit van derde graad onafhankelijk van de scanlijn worden afgetrokken. Vervolgens maakt het gebruik van een zelf ontworpen beeldalgoritme het mogelijk om de uitsteekselkrachtwaarden te evalueren uit de AFM-hoogtekaart en het mechanische model van protozoa-gemedieerde uitsteeksels.
Dankzij deze procedure kunnen we de mechanismen onderzoeken die betrokken zijn bij de generatie van uitsteekselkrachten bij protozoa. Bedankt voor het bekijken en veel succes met uw experimenten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de experimentele technieken die worden gebruikt om de uitsteekselkrachten die door podosomen op een compliante film worden uitgeoefend, te kwantificeren met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Het proces omvat filmvoorbereiding, celadhesie en beeldvorming om de vervorming veroorzaakt door podosomen te analyseren.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biofysica
Achtergrond
- Podosomen zijn submicrometrische adhesiestructuren gevormd door macrofagen.
- Inzicht in de krachten die door podosomen worden uitgeoefend, kan inzicht geven in cellulaire mechanica.
- Atomaire krachtmicroscopie is een sleuteltechniek voor het meten van deze krachten.
- Het onderzoek heeft tot doel een mechanisch model te ontwikkelen voor het kwantificeren van krachten op basis van filmvervorming.
Doel van het onderzoek
- Om de uitsteekselkrachten die door podosomen worden uitgeoefend te kwantificeren.
- Om de interactie tussen cellen en compliante substraten te analyseren.
- Om de begrip van cellulaire adhesiemechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van met formule gecoate rasters.
- Meting van de filmdikte.
- Plaatsing van cellen op de rasters voor adhesie.
- Beeldvorming van de film onder cellen met behulp van atoomkrachtmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Kwantificering van filmvervorming veroorzaakt door podosomen.
- Omzetting van vervormingsmetingen in krachtwaarden met behulp van een mechanisch model.
- Inzichten in de mechanische eigenschappen van podosome-interacties met substraten.
- Demonstratie van de effectiviteit van atoomkrachtmicroscopie bij het meten van cellulaire krachten.
Conclusies
- Het onderzoek kwantificeert met succes de uitsteekselkrachten van podosomen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van cellulaire mechanica en adhesie.
- De ontwikkelde methoden kunnen worden toegepast op verder onderzoek in de celbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying protrusion forces provides a direct readout of cellular mechanical activity, enabling mechanistic de-risking in target validation for macrophage-related pathways. This method supports predictive confidence by linking subcellular force generation to functional phenotypes in adhesion and migration. It positions protrusion force measurement as a translational biomarker platform for preclinical model de-risking in immunology and inflammation programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying force generation from subcellular protrusive structures like podosomes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct measurement of force-dependent cellular functions in human macrophages.
- Predictive Value: Links protrusion force dynamics to pathway clarification, aiding portfolio triage in mechanosensitive target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible nanoscale topography maps from compliant substrates for quantitative force extraction.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems (e.g., podosome-forming macrophages) for downstream compound screening.
- Platform Reuse: Facilitates reliable compound evaluation by providing a mechanical phenotype readout orthogonal to biochemical assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage protrusion force measurements to preclinical validation through disease-relevant macrophage models.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by quantifying force generation as a functional output of podosome activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating protrusion force modulation with target engagement in adhesion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing a quantitative, mechanistically grounded readout of cellular protrusion dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring force generation from defined protrusive structures.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible height maps from AFM imaging that enable quantitative comparison of protrusion forces across conditions.
- Analytics: Generates force values via mechanical model conversion of deformation profiles, enabling statistical comparison of protrusive activity.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using human macrophage-derived podosomes as a disease-relevant system for mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing mechanobiology across immune, cancer, and inflammation targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protrusion-driven processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through AFM-based nanoscale deformation mapping and controlled substrate preparation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early biological de-risking of targets involved in force-generating cellular structures.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying protrusion force as a functional biomarker for target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in atomic force microscopy operation, compliant polymer film preparation, and macrophage cell culture.
- Depends on instrumentation capable of nanoscale height mapping and force curve acquisition in liquid environment.
- Necessitates cross-team standardization of film thickness measurement, cell seeding density, and AFM set-point force for reproducible protrusion detection.
- Involves adaptation considerations when applying to non-macrophage cell types or alternative protrusive structures beyond podosomes.
- Limited by the need for homogeneous, defect-free compliant films and accurate mechanical modeling of protrusion-substrate interactions.
