Name: Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer de ontwikkeling en functionele karakterisering van tolerogene dendritische cellen voor immunotherapie bij auto-immuunziekten zoals multiple sclerose. Deze gestandaardiseerde methode verbetert de reproduceerbaarheid van onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Reata Pharmaceuticals voor het verstrekken van CDDO-DFPA. We erkennen ook de steun van de Jane en Lee Seidman stoel in Pediatric Cancer innovatie (John Letterio). Dit werk werd gesteund door het ministerie van defensie [W81XWH-12-1-0452]; de Angie Fowler Adolescent en jong volwassen kanker onderzoeksinitiatief op de zaak uitgebreid Cancer Center; en de Callahan Graduate geleerde Award voor Hsi-Ju Wei van F.J. Callahan Foundation.

Alle studies werden uitgevoerd met inachtneming van de procedures door de Case Western Reserve University School of Medicine van institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.
1. Prepareer het beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDCs)
<ol><li>Alle chirurgische instrumenten via autoclaaf steriliseren en het uitvoeren van het experiment in klasse II biologische veiligheidskast met geëigende veiligheidsprocedures.</li>
	<li>C57BL/6 muizen 8-10 weken oud met behulp van CO2 kamer euthanaseren. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Accijnzen tibia kuitbeen en dijbeen botten met behulp van een chirurgische scissor en plaats ze met 70% ethanol in een 10 cm cultuur schotel.</li>
	<li>Chirurgische messen en pincet gebruiken om te ontleden weefsel weg zoveel mogelijk op het deksel van de 10 cm schotel cultuur en isoleren zijn verbeend en dijbeen te plaatsen met 70% ethanol in een 6 cm cultuur schotel.</li>
	<li>Hiermee kunt u dat chirurgische messen trim beide uiteinden van zijn verbeend en dijbeen. Gebruik 3 mL PBS in 3 ml injectiespuit met een naald 23G voor het spoelen van de inhoud van het merg van het ene eind van botten aan een conische buis met 12 ml PBS. Herhaal deze stap 3 x voor beide uiteinden van de botten.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 1 ml ACK lysing buffer voor 5 mins aan het verwijderen van rode bloedcellen.</li>
	<li>Voeg 9 ml PBS om te verdunnen ACK lysing buffer en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer met 10 ml gestolde voedingsbodem (RPMI-1640 plus L-glutamine, 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuur (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol en 5% penicilline/streptomycine). Opmerking: Endotoxine niveau moet minder dan 0.1 EU/ml in FBS.</li>
	<li>De celsuspensie passeren door een zeef van de cel 40 μm en nemen 20 µl celsuspensie en meng met 80 µl van trypan blauw aan tellen het aantal levende cellen met behulp van cytometer.</li>
	<li>Aanpassen van de cel nummer 1 x 106 cellen/ml met 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>3 ml 1 x 106 cellen/ml in elk putje van 6-well plaat plaat en Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid in de CO2 incubator. Opmerking: De beenmergcellen van één muis is ongeveer 3-5 x 107 cellen, die aangeeft dat het kan worden geplaatst van 2 naar 3 6-Wells-platen.</li>
	<li>Op dag 3, verwijder alle 3 ml gestolde voedingsbodem uit elk putje, voeg 2 ml verse PBS in elk putje en vervolgens voorzichtig swirl de plaat om ervoor te zorgen dat alle niet-aanhanger cellen verwijderen.</li>
	<li>3 ml verse kweekmedium vervangen door 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4 in elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid in de CO2 incubator.</li>
	<li>Op dag 5, direct een andere 3 ml verse kweekmedium met 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4 in elk putje toevoegen. Incubeer de cellen bij 37° C en 5% CO2, 95% vochtigheid in de CO2 incubator. Opmerking: Het totale volume in elk putje is nu 6 ml.</li>
	<li>Op dag 7, kunt u de hele plaat gezet door ijs voor 10 minuten. Pipetteer zachtjes het kweekmedium in elk putje te verjagen van de losjes-aanhanger BMDCs als iDCs in suspensie. Opmerking: Het aanhangend macrofagen zijn nog steeds gekoppeld aan de plaat. Lage temperatuur en zachtjes procedures zijn de sleutel tot het voorkomen van DC activering om invloed op verdere experimenten.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer met verse voedingsbodem voor verdere experimenten. Opmerking: BMDCs kan worden geïdentificeerd met fluorescentie-label CD11c antilichaam aan stroom cytometry en toonden we onze gating strategie van BMDCs voor verdere experimenten in Figuur 1.</li>
</ol>2. het karakteriseren van TolDC gen- en eiwit profiel
<ol><li>Plaat 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per putje in 6 goed-plaat met gestolde voedingsbodem in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM, CDDO-DFPA voor 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid in de CO2 incubator aan het broeden. Opmerking: CDDO-DFPA, een synthetische triterpenoid, is een nucleaire factor (erythroid afkomstige 2) - zoals - 2 factor (Nrf2) inductor en nucleaire factor-recombination (NF-recombination) remmer. Andere agenten voor inductie van TolDCs uit iDCs, zoals IL-10, vitamine D3, dexamethason of BAY 11-7085, toepassen en wijzigen van deze stap naar een optimale voorwaarde voor elke agent.</li>
	<li>Het toevoegen van 10 of 100 ng/ml van LPS voor 4-24 uur om te induceren mDCs (incubatietijd verschilt als gevolg van de meting van mRNA of eiwitten) aan het broeden.</li>
	<li>Zachtjes Pipetteer het kweekmedium in elk putje en oogst van de celsuspensie met behulp van 1 ml pipet. Centrifugeer bij 300 x g voor 5 mins aan het verzamelen van de cellen en het supernatant, respectievelijk.</li>
	<li>Analyseren van de oppervlakte liganden van de cel pellets door stroom cytometry, zoals stimulerend liganden: interactie CD40 CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL of remmende liganden: PD-L1 PD-L2, ILT3, ILT4.</li>
	<li>Isoleren van RNA van de cel pellets en analyseren van het RNA en supernatant monsters voor de cytokine profiel en gen- en eiwit niveaus door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en ELISA, respectievelijk. Opmerking: als u bijvoorbeeld inflammatoire cytokines: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12, en IL-23 of anti-inflammatoire cytokines: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 en HO-1.</li>
</ol>3. de functie van TolDCs wordt geëvalueerd In Vitro en In Vivo
<ol><li>
T-cel Syngeneic proliferatie Assay
	<ol>
<li>Alle chirurgische instrumenten via autoclaaf steriliseren en het uitvoeren van het experiment in klasse II biologische veiligheidskast met geëigende veiligheidsprocedures.</li>
		<li>Bereiden MACS buffer met behulp van 0,5% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA in 500 ml PBS. Het steriliseren van de buffer door het filteren door middel van een 0,2 µm filter. Opmerking: Houd de buffer op het ijs tijdens het volgende experiment.</li>
		<li>Verkrijgen van CD4+ T cellen, euthanaseren OT-II T-cel receptor (TCR) transgene muizen met behulp van CO2 kamer 8-10 weken oud. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Het isoleren van de milt vanaf de linkerkant van de buik met behulp van chirurgische schaar en pincet.</li>
		<li>Zet de milt met 2 ml PBS in een 6 cm cultuur schotel en gebruik de achterkant van de push-stick van 3 ml spuit mild met de milt door het passeren van een 40 μm cel zeef.</li>
		<li>Het verzamelen van de celsuspensie en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in 400 μl van MACS buffer.</li>
		<li>Voeg 100 µl van CD4+ T cel Biotine-antilichaam Cocktail bij 4° C gedurende 5 minuten. Opmerking: Het antilichaam cocktail bindt op andere celtypes behalve CD4+ T cellen, zoals CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klasse II, Ter-119, en TCRγ/δ.</li>
		<li>Voeg 300 μl van MACS buffer en 200 μl van anti-Biotine kralen (Tabel of Materials) bij 4° C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Plaats de kolom samengesteld van Ferromagnetische bollen (Tabel van materialen) en Filter van de pre scheiding samen in het magnetische veld en spoel het met 3 ml MACS buffer.</li>
		<li>Voeg 9 ml MACS buffer in de cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in 3 ml MACS buffer en toepassen op de kolom. Verzamel doorstroomtest met CD4+ T cellen.</li>
		<li>Was de kolom met een andere 3 ml MACS buffer en verzamelen ook de doorstroming.</li>
		<li>Voor het verkrijgen van milt pan DCs, euthanaseren C57BL/6 muizen 8-10 weken oud met behulp van CO2 kamer. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Het isoleren van de milt vanaf de linkerkant van de buik met behulp van chirurgische schaar en pincet. Zet de milt in een 6cm cultuur schotel met collagenase D oplossing 2 ml (2 mg/ml collagenase D opgelost in HBSS met calcium, magnesium).</li>
		<li>1 ml van collagenase D oplossing tot de milt twee keer met een spuit van 1 ml en een 25G naald injecteert. De milt in kleine stukjes gesneden met een kleine schaar.</li>
		<li>Schudden en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.</li>
		<li>Voeg toe 500 μl van EDTA 0.5 M bij kamertemperatuur voor 5 minuten. Opmerking: De stappen van 3.1.13-3.1.14 zijn essentieel voor het verhogen van het rendement van DCs.</li>
		<li>Gebruik nu de achterkant van de push-stick van 3 ml spuit mince de milt drijfmest door het passeren van een 40 μm cel zeef te verzamelen van de celsuspensie door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in 350 μl van MACS buffer 50 µl van FcR blokkeren reagens en 100 µl van Pan dendritische cel Biotine-antilichaam Cocktail bij 4° C gedurende 10 minuten. Opmerking: Het antilichaam tegen antigenen die niet worden uitgedrukt door DCs cocktail.</li>
		<li>De cellen door toevoeging van 9 ml van MACS buffer en centrifuge bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in 800 μl van MACS buffer en voeg 200 μl van anti-Biotine kralen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Herhaal de stappen van de 3.1.9-3.1.11 voor het verzamelen van DCs.</li>
		<li>Was de kolom met een andere 3 ml MACS buffer tweemaal en verzamelen ook de doorstroming.</li>
		<li>Behandelen van de 2 x 10-5 DCs/ml in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM CDDO-DFPA bij 37 ° C gedurende 1 hr. apart, label CD4+ T-cellen (1 x 107/ml) met 1 μM CFSE bij 37 ° C gedurende 15 minuten, wassen met PBS , en passen het volume om de definitieve concentratie van 2 x 106 T cellen/ml.</li>
		<li>Vervolgens in een 96-wells-plaat, cultuur samen 100 µl van de behandelde dendritische cellen met hetzelfde volume van CFSE-label CD4+ T cellen, beide verzameld uit de bovenstaande stappen om 1:10 verhouding. Voeg nu 100 ng/mL ovoalbumine (OVA) peptide 323-329 per goed en meet de intensiteit van de CFSE van de T-cellen door stroom cytometry na 2-3 dagen incubatie. Opmerking: De cel nummers en verhouding van DCs en T cellen uit onze eerdere werk37zijn geoptimaliseerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induceren van passief EAE door het injecteren van de BMDCs Pulsed met myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>Plaat 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per putje in 6 goed-plaat met gestolde voedingsbodem in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM CDDO-DFPA voor 1 uur aan het broeden.</li>
		<li>Voeg 10 ng/ml LPS voor drachtige 24 uur.</li>
		<li>Voeg 100 μg/ml MOG (35-55) voor drachtige 4 uur.</li>
		<li>Oogst de celsuspensie en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel met PBS en cellen tellen.</li>
		<li>Subcutaan injecteren 200 μl van 2 x 106 cellen met 8-10 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen (100 µl in elke achterpoot).</li>
		<li>Op de dag van BMDC injectie en de 48 uur. later, injecteren 200 ng pertussis toxine (PTX) in elke muis.</li>
		<li>Herhaal stappen 3.2.6-3.2.7 eenmaal per week voor 4 opeenvolgende weken.</li>
		<li>De klinische symptomen van EAE dagelijks evalueren met behulp van de criteria van de kwaliteitsnorm37 (0.5-limp staart, staart 1-limp, 2-matig hind-limb zwakte, 3-ernstige hind-limb zwakte, hind-limb 4-volledige verlamming, 5-tetraplegie of stervende state, 6-dood).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Dit witboek beschrijft een efficiënt protocol dat kan worden gebruikt voor reproducibly voor het genereren van iDCs en vervolgens om hen te onderscheiden in TolDCs, en wij stellen voor dat dit kan worden toegepast om te evalueren van de capaciteit van de nieuwe moleculaire doel agenten voor het opwekken van de TolDC fenotype. Zoals beschreven in dit verslag, we hebben een reeks waarin we eerst geanalyseerd TolDC uitdrukking van oppervlakte liganden door stroom cytometry, gevolgd door een evaluatie van het DC cytokine pro...

Dendritische cellen (DC's) werden zijn een integraal onderdeel van het aangeboren immuunsysteem en eerst ontdekt en gekenmerkt door Ralph Steinman en Zanvil Cohn in 1973 als primaire professionele antigeen presentatie1 cellen. DCs is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de immuunactivatie door de presentatie van verwerkte antigeen aan T-cellen en B cellen via grote comptabiliteit complexen (MHC) in secundaire lymfoïde organen te koppelen van de aangeboren en adaptieve immuunsysteem2. In de zoogdieren immuunsysteem zijn er ten minste twee categorieën van DCs die worden omschreven als myeloïde DCs en plasmacytoid DCs (PDC's)3. Myeloïde DCs, ook bekend als conventionele DCs (cDCs), worden gekenmerkt door de uitdrukking van CD11c en kan worden gedifferentieerd als onvolwassen DCs (iDCs) in vitro van voorlopercellen van het beenmerg of perifere bloed monocyten gebruiken granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) en IL-4 bij lymfkliertest of menselijke diersoorten, respectievelijk4.
Activeren 'gevaar' signalen, zoals pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP) of schade-geassocieerde moleculaire patronen (VOCHTIGE), rijdt iDCs rijping richting immunogene DCs als volwassen DCs (mDCs) via verschillende patroon erkenning receptoren bindt de DC-oppervlakte5. Immunogene DCs verder prime naïef T-celproliferatie en differentiatie via opregulatie van MHCII2, costimulatory liganden (CD80, CD86 en interactie CD40)6, cytokines en andere oplosbare bemiddelaars7. Een cascade van pro-inflammatoire mediator productie van immunogene DCs is essentieel voor de cytokine gemedieerde T celdifferentiatie. Bijvoorbeeld, zowel IFN-γ en IL-12 zijn nodig voor de Th1 differentiatie8 en IL-1, IL-6, en IL-23 zijn kritisch voor de naïeve T cel polarisatie naar Th17 cellen9. Hoewel volwassen DCs op vreemde antigenen reageren, kan ongecontroleerde DC activering door zelf-antigenen leiden tot tolerantie ablatie en bevordering van de ontwikkeling van auto-immune ziekten door het genereren van autoreactieve T cellen waarvan Activering tot weefselvernietiging10 leidt .
Recente rapporten hebben verstrekt duidelijk bewijs van DC plasticiteit, wordt geïllustreerd door hun vermogen om te communiceren met verschillende aanwijzingen binnen hun communicatie weefsel en te onderscheiden in verschillende effector/suppressorgenen DC subsets. De anti-inflammatoire mediatoren, zoals IL-10,11, TGF-β12en HO-113 hebben aangetoond dat een belangrijke rol spelen bij immuun onderdrukking door inducerende tolerogenic DCs (TolDCs). Deze TolDCs verwerven van de regelgevende taken en onderdrukken van T-cel proliferatie14. Bovendien, het gebrek aan co-stimulatie door DCs en de productie van anti-inflammatoire mediatoren van TolDCs zowel bijdragen tot de inductie van regulatoire T-cellen (Tregs) en ook effectief remmen zowel Th1 en Th17 differentiatie en uitbreiding15. In afgelopen twee decennia, is de therapeutische mogelijkheden van TolDCs gemeld door verschillende onderzoekers. In deze studies, het beheer van ex-vivo TolDCs niet alleen verbeterd pathologische symptomen gegenereerd in verschillende preklinische modellen van auto-immune ziekten16 , maar ook geleid tot de ontwikkeling van immune tolerantie bij patiënten17 ,18. Interessant is dat vandaag de TolDCs therapie heeft beschouwd als een alternatieve of adjuvante aanpak voor auto-immune ziekten in verschillende klinische proeven, met inbegrip van type 1 diabetes mellitus19, reumatoïde artritis20, 21, multiple sclerose (MS)22,23,24, en de ziekte van Crohn ziekte25.
Er zijn een verscheidenheid van protocollen die hebben gewerkt aan het ontwikkelen van TolDCs en verschillende laboratoria methoden hebben gemeld voor generatie en fenotypische karakterisering van TolDCs. Deze methoden kunnen worden gebruikt voor het genereren van reproducibly TolDCs in vitro van hematopoietische progenitorcellen en stabiel om ze te bewaren in een tolerogenic staat in vivo26,27,28,29. De iDCs kan worden omgezet in TolDCs door blootstelling aan verschillende immunomodulerende farmacologische agenten of anti-inflammatoire cytokines. Vitamine D3 is bijvoorbeeld een bekende farmacologische agent bekend te vergroten van de productie van de IL-10 en onderdrukken van IL-12 secretie van DCs en te stimuleren waardoor hun immunosuppressieve functie30. Bovendien, wanneer DCs worden blootgesteld aan krachtige inflammatoire stimuli, zoals lipopolysacchariden (LPS), verschillende farmacologische stoffen zoals dexamethason31, rapamycin32en33 van de corticosteroïden is gebleken voor het opwekken van de TolDC fenotype doordat DC oppervlakte expressie van CD40, CD80, CD86 en MHCII34. IL-10 en TGF-β zijn de meest bestudeerde anti-inflammatoire cytokines voor het opwekken van DC tolerantie35 en de daarmee gepaard gaande blootstelling aan beide van deze cytokines voor het opwekken van het fenotype van een tolerogenic in DCs36is gebleken.
Sinds de tolerogenic die DC wordt bepaald door functionele eigenschappen in plaats van door fenotypische markers, er is behoefte een grote een consistente methode voor cellulaire en functionele karakterisering van TolDCs te ontwikkelen. Bovendien een strenge en consequente protocol moet worden vastgesteld voor de consistente beoordeling en de karakterisering van het tolerogenic DC fenotype als wij gaan effectief en reproducibly vergelijken het vermogen van de nieuwe agenten voor het opwekken van het fenotype van de TolDC in de laboratorium. Hier voorzien wij een gedetailleerd protocol met stapsgewijze methoden beschreven om te isoleren iDCs van hematopoietische progenitorcellen van muizen en vervolgens analyseren van de werkzaamheid van nieuwe agenten onder evaluatie voor hun capaciteit iDCs omzetten in TolDCs, die bieden een robuuste functionele en fenotypische karakterisatie van TolDCs zowel in vitro als in vivo. Deze beschrijving bevat een uitgebreide methode karakteriseren de TolDCs door hun oppervlakte liganden, cytokine profiel en immunosuppressieve functies in vitro. We bieden ook een voorbeeld van een methode om te verkennen van de mogelijke therapeutische toepassing van deze TolDCs in een preklinische model van MS, experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE). Deze gangbaar protocol helpt onderzoekers om de capaciteit van de nieuwe agenten ter bevordering van de inductie van TolDCs en vergemakkelijkt de inspanning uit te breiden het bereik van TolDC therapeutische ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>in house synthese</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Mouse GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>BMDC differentiatie</td></tr><tr><td>Mouse IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td><td>BMDC differentiatie</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides (LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Pertussis toxine (PTX)</td><td>R&amp;D systems</td><td>3097</td><td>EAE-inductie</td></tr><tr><td>MOG (35&ndash;55) peptide</td><td>21stCentury Biochemicals</td><td>in house synthese</td><td>EAE-inductie</td></tr><tr><td>Trypan blauw</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Niet-essentieel aminozuur (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>penicilline/streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>40 &#956;m celzevener</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Celisolatie</td></tr><tr><td>PE-geconjugeerd CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>PE-geconjugeerd CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>PE-geconjugeerd PD-L1</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>APC-geconjugeerd MHCII</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>APC-geconjugeerd CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>Isotype-gematcht PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>Isotype-gematcht APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>Flowcytometrie</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>Pan dendritische cel-isolatiekit</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>Pan Dendritische Cel Biotin-Antilichaam Cocktail</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>CD4+ T-celisolatiekit</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>CD4+ T-cel Biotin-Antilichaam Cocktail</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>ACK-lyse buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>BMDC differentiatie</td></tr><tr><td>1 ml-sering</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>3 ml-sering</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC differentiatie</td></tr><tr><td>25G-naald</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>23G-naald</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC differentiatie</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>LS-kolom</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>Pre-scheidingsfilter</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>collageenase D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>ovalbumine (OVA) peptide 323&ndash;329</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>O1641</td><td>T-celproliferatie-assay</td></tr><tr><td>Mouse IFN-&gamma; TaqMan-sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-12a TaqMan-sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R&amp;D systems</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Mouse EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alpha; TaqMan-sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse TNF-&alpha; Quantikine ELISA Kit</td><td>R&amp;D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan-sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R&amp;D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a TaqMan-sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R&amp;D systems</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 TaqMan-sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 TaqMan-sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta; TaqMan-sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Heme Oxygenase 1-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actine-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>

ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest tolerogenic dendritische cellen

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Het immuunsysteem werkt door een strakke evenwicht tussen coördinerende reacties tegen buitenlandse antigenen en handhaven van een niet-reagerende staat tegen zelf-antigenen en antigenen afkomstig van commensale organismen. De verstoring van deze immuun homeostase kan leiden tot chronische ontsteking en voor de ontwikkeling van auto-immuniteit. Dendritische cellen (DC's) zijn de professionele presentatie van antigeen cellen van het aangeboren immuunsysteem betrokken bij het activeren van de naïeve T cellen om te starten van de immuunrespons tegen vreemde antigenen. DCs kunnen echter ook worden onderscheiden in TolDCs die handelen te handhaven en T cel tolerantie te bevorderen en te onderdrukken effector cellen bij te dragen tot de ontwikkeling van beide voorwaarden van auto-immuunziekten of chronische ontsteking. De recente vooruitgang in ons begrip van TolDCs suggereert dat DC tolerantie kan worden bereikt door het moduleren van de voorwaarden van hun differentiatie. Dit verschijnsel heeft geleid tot een enorme groei in TolDC therapieën voor talrijke immuun aandoeningen veroorzaakt door te breken in immuun tolerantie te ontwikkelen. Succesvolle studies in preklinische autoimmuniteit lymfkliertest modellen hebben verder de immunotherapeutische nut van TolDCs in de behandeling van auto-immune aandoeningen gevalideerd. TolDCs hebben tegenwoordig een veelbelovende immunotherapeutische hulpmiddel in de kliniek voor herstel van immuun tolerantie in verschillende immuun aandoeningen door pathogene auto-immune reacties zich te richten terwijl protectieve immuniteit intact blijven. Hoewel een array van strategieën heeft voorgesteld door meerdere labs voor het opwekken van TolDCs, is er geen consistentie in het karakteriseren van de cellulaire en functionele fenotype van deze cellen. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de ontwikkeling van beenmerg-afgeleide DCs in grote aantallen, een unieke methode die wordt gebruikt om hen te onderscheiden in TolDCs met een synthetische triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic zuur-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), en de technieken gebruikt om te bevestigen hun fenotype, met inbegrip van analyses van essentiële moleculaire signaturen van TolDCs. Tot slot laten we zien een methode om te beoordelen van de TolDC functie door het testen van hun immunosuppressieve reactie in vitro en in vivo in een preklinische model van multiple sclerose.

De differentiatie en de selectie van BMDCs:
Het beenmerg voorlopercellen werden gekweekt in volledige RPMI medium in het bijzijn van GM-CSF en IL-4 te onderscheiden in iDCs gedurende 7 dagen (figuur 1A). Op dag 1, cellen waren klein in omvang en toonde sferische morfologie. Wassen met PBS voordat de vervanging van verse medium op dag 3 cellen hielp vorm clusters en ook steeg de bevo...

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Het algemene doel van dit protocol is om tolerogeen gemuteerde dendritische cellen te ontwikkelen en te karakteriseren voor de evaluatie van hun immunotherapeutische nut bij de behandeling van auto-immuunziekten, zoals multiple sclerose. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van tolerogeen dendritische celtherapie te beantwoorden door een gestandaardiseerde methode te bieden voor het ontwikkelen en functioneel karakteriseren van tolerogeen gemuteerde dendritische cellen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze kan worden gebruikt voor succesvolle ontwikkeling van tolerogeen gemuteerde dendritische cellen en voor functioneel tolerogeen gemuteerde dendritische celeffectiviteitstests.De implicaties van deze techniek zijn significant. Ze strekken zich uit tot de ontwikkeling van cellulaire immunotherapie voor auto-immuunziekten, aangezien tolerogeen gemuteerde dendritische cellen een abnormale immuunrespons kunnen resetten terwijl ze onderhevig blijven aan intrinsieke immuunregulatoire mechanismen. Na het verzamelen van de achterbeenbotten van acht tot 10 weken oude C57BL/6 muizen, volgens standaardprotocollen, gebruik chirurgische bladen en pincetten om zoveel mogelijk weefsel te dissekteren en plaats de schone tibia's en femurs in een zes centimeter grote kweekschaal met 70% ethanol.Trim beide uiteinden van de botten met een chirurgisch mes en gebruik een drie milliliter spuit, uitgerust met een 23 gauge naald, om het beenmerg uit het eerste bot te spoelen met drie milliliter PBS in een 15 milliliter conische buis. Wanneer al het beenmerg is verzameld, centrifugeer de celsuspensie en resuspendeer de pellet in een milliliter rode bloedcel lysis buffer. Na vijf minuten, stop de lysis met negen milliliter PBS en verzamel de cellen door centrifugatie.Resuspendeer de witte beenmergcel pellet in 10 milliliter kweekmedium en filter de cellen door een 40 micrometer cel strainer in een nieuwe buis. Pas de cellen aan tot een eenmaal 10 tot de zesde cellen per milliliter concentratie in kweekmedium gesupplementeerd met GM-CSF en IL-4. En plateer drie milliliter cellen in elke put van een 6-puts plaat voor een drietal dagen incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Op de derde dag, was de cellen in elke put met twee milliliter PBS en zachtjes slingerend om de niet-aderente cellen te verwijderen. Voer vervolgens de cellen met drie milliliter vers kweekmedium gesupplementeerd met GM-CSF en IL-4 en breng de cellen terug naar de celkweekincubator, door nog drie milliliter vers kweekmedium toe te voegen, gesupplementeerd met cytokinen aan elke put na twee dagen. Op dag zeven van de kweek, plaats de plaat op ijs.Na 10 minuten, pipet gedurende de kweek in elke put om de losjes adherente, onrijpe, beenmerg-afgeleide dendritische cellen in suspensie te brengen. Pool vervolgens de cellen voor verzameling door centrifugatie en resuspendeer de pellet in het juiste volume vers kweekmedium voor daaropvolgende downstream analyse. Om syngeneïsche T-cel proliferatie te meten, gebruik eerst de achterkant van een drie milliliter spuitplunger om een milt van een acht tot 10 weken oude OT2 C57BL/6 muis door een 40 micrometer cel strainer te pletten en spoel de strainer af met PBS.Pellet de gepoolde celsuspensie door centrifugatie en resuspendeer de pellet in 400 microliter magnetische cel sorteer buffer en 100 microliter CD4 positieve T-cel biotin-antilichaam cocktail bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, voeg 300 microliter sorteer buffer en 200 microliter anti-biotine bead toe aan de cellen voor een 10 minuten, vier graden Celsius incubatie en plaats een magnetische bead kolom en een voorafscheidingsfilter in een geschikt gedimensioneerde celscheidingsmagneet. Spoel de kolom af met drie milliliter sorteer buffer en voeg negen milliliter sorteer buffer toe aan de cellen.Na centrifugatie, resuspendeer de cel en bead pellet in drie milliliter sorteer buffer en voeg de celsuspensie toe aan de kolom om het CD4 positieve T-cel eluaat in een geschikte container te verzamelen. Was vervolgens de kolom met nog eens drie milliliter sorteer buffer, verzamel de flow-through en plaats de T-cellen op ijs. Voor syngeneïsche splenische pan dendritische cel isolatie, plaats de milt van een acht tot tien weken oude C57BL/6 muis in een zes centimeter grote kweekschaal en gebruik een een milliliter spuit, uitgerust met een 25 gauge naald, om een milliliter Collagenase D oplossing twee keer in de milt te injecteren.Gebruik vervolgens schaar om de milt in kleine stukjes te snijden en incubeer de stukjes met schudden bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten. Aan het einde van de incubatie, voeg 500 microliter 0.5 molair EDTA toe aan de weefselslurry voor een laatste vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, gebruik de achterkant van een drie milliliter spuitplunger om de milt slurry door een 40 micrometer cel strainer te pletten en verzamel de cellen door centrifugatie.Resuspendeer de pellet in 350 microliter magnetische cel sorteer buffer, 50 microliter Fc receptor blokkeer reagens, en 100 microliter pan dendritische cel biotin-antilichaam cocktail voor een 10 minuten incubatie bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen in negen milliliter sorteer buffer en resuspendeer de pellet in 800 microliter vers sorteer buffer met 200 microliter anti-biotine bead bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten voor isolatie van de splenische pan dendritische cel populatie door magnetische bead sorteer, zoals zojuist aangetoond. Resuspendeer de cellen op een tweemaal 10 tot de vijfde dendritische cellen per milliliter concentratie en behandel ze met de geschikte experimentele concentratie van de triterpenoïde van belang gedurende een uur bij 37 graden Celsius.Gedurende het laatste derde deel van de incubatie, resuspendeer de T-cellen op een eenmaal 10 tot de zevende cellen per milliliter concentratie in één micromolar CFSE gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Was vervolgens de cellen met PBS en pas het volume opnieuw aan tot een eindconcentratie van tweemaal 10 tot de zesde T-cellen per milliliter. Co-kweek 100 microliter van de behandelde dendritische cellen met 100 microliter van de CFSE-gelabelde CD4 positieve T-cellen in elke put van een 96-puts plaat en voeg 100 nanogram per m

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Antigeen presentatie in secundaire lymfoïde organen door de dendritische cellen is cruciaal voor de opening van het T-cel gemedieerde adaptieve immuunrespons. Hier laten we zien de cultuur van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, activering, en de etikettering voor 2-photon imaging.

Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

This video demonstrates the generation of immature, mature, and tolerogenic dendritic cells, or DCs, from human monocytes. The incubation of monocytes with growth factors and cytokines leads to the production of immature DCs. In response to immune regulatory molecules, immature DCs differentiate into tolerogenic and mature DCs.

Generation of Immature, Mature, and Tolerogenic Dendritic Cells from Monocytes

This video demonstrates a method of converting dendritic cells (DCs) to tolerogenic DCs (TolDCs) using an immunomodulatory pharmacological agent. This conversion is confirmed by evaluating the TolDC function through their immunosuppressive effect on CD4+ T cells.

Effect of an Immunomodulatory Pharmacological Agent on the Interaction Between Dendritic Cells and CD4+ T Cells

Dit protocol beschrijft experimentele procedures om de differentiatie van plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer's patch van zachte dendritische celvoorlopers nagegaan met behulp van technieken met FACS-gemedieerde isolatie hydrodynamische gentransfer en flow-analyse van immune subsets in Peyer's patch.

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

In deze studie presenteren we een in vitro kweeksysteem dat efficiënt pDC's kan genereren door co-cultiveren van gemeenschappelijke lymfoïde progenitorcellen met AC-6 feedercellen in aanwezigheid van Flt3-ligand.

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Immature dendritische cellen kunnen selectief worden gedifferentieerd in tolerogeen of rijpe dendritische cellen om het evenwicht tussen immuniteit en tolerantie te reguleren. Dit werk presenteert een manier om vanuit onrijpe, uit monocyten afgeleide dendritische cellen (moDC's) in vitro tolerogeen en rijpe moDC's te genereren die verschillen in metabolische fenotypen.

Generatie van onrijpe, Ouder en tolerogene dendritische cellen met verschillende Metabolic Phenotypes

Hier bieden we een protocol voor het screenen van potentiële transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dendritische cel (DC) met behulp van lentivirale transductie van shRNA om stabiele knockdown-cellijnen te verkrijgen voor in vitro DC-differentiatie.

Studie van dendritische celontwikkeling door korte haarspeld RNA-gemedieerde gen knockdown in een hematopoëtische stam en voorlopercellijn in vitro

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

Leer de ontwikkeling en functionele karakterisering van tolerogene dendritische cellen voor immunotherapie bij auto-immuunziekten zoals multiple sclerose. Deze gestandaardiseerde methode verbetert de reproduceerbaarheid van onderzoek.

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

Meer video's verkennen