Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

Het algemene doel van dit protocol is om tolerogeen gemuteerde dendritische cellen te ontwikkelen en te karakteriseren voor de evaluatie van hun immunotherapeutische nut bij de behandeling van auto-immuunziekten, zoals multiple sclerose. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van tolerogeen dendritische celtherapie te beantwoorden door een gestandaardiseerde methode te bieden voor het ontwikkelen en functioneel karakteriseren van tolerogeen gemuteerde dendritische cellen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze kan worden gebruikt voor succesvolle ontwikkeling van tolerogeen gemuteerde dendritische cellen en voor functioneel tolerogeen gemuteerde dendritische celeffectiviteitstests.

De implicaties van deze techniek zijn significant. Ze strekken zich uit tot de ontwikkeling van cellulaire immunotherapie voor auto-immuunziekten, aangezien tolerogeen gemuteerde dendritische cellen een abnormale immuunrespons kunnen resetten terwijl ze onderhevig blijven aan intrinsieke immuunregulatoire mechanismen. Na het verzamelen van de achterbeenbotten van acht tot 10 weken oude C57BL/6 muizen, volgens standaardprotocollen, gebruik chirurgische bladen en pincetten om zoveel mogelijk weefsel te dissekteren en plaats de schone tibia's en femurs in een zes centimeter grote kweekschaal met 70% ethanol.

Trim beide uiteinden van de botten met een chirurgisch mes en gebruik een drie milliliter spuit, uitgerust met een 23 gauge naald, om het beenmerg uit het eerste bot te spoelen met drie milliliter PBS in een 15 milliliter conische buis. Wanneer al het beenmerg is verzameld, centrifugeer de celsuspensie en resuspendeer de pellet in een milliliter rode bloedcel lysis buffer. Na vijf minuten, stop de lysis met negen milliliter PBS en verzamel de cellen door centrifugatie.

Resuspendeer de witte beenmergcel pellet in 10 milliliter kweekmedium en filter de cellen door een 40 micrometer cel strainer in een nieuwe buis. Pas de cellen aan tot een eenmaal 10 tot de zesde cellen per milliliter concentratie in kweekmedium gesupplementeerd met GM-CSF en IL-4. En plateer drie milliliter cellen in elke put van een 6-puts plaat voor een drietal dagen incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Op de derde dag, was de cellen in elke put met twee milliliter PBS en zachtjes slingerend om de niet-aderente cellen te verwijderen. Voer vervolgens de cellen met drie milliliter vers kweekmedium gesupplementeerd met GM-CSF en IL-4 en breng de cellen terug naar de celkweekincubator, door nog drie milliliter vers kweekmedium toe te voegen, gesupplementeerd met cytokinen aan elke put na twee dagen. Op dag zeven van de kweek, plaats de plaat op ijs.

Na 10 minuten, pipet gedurende de kweek in elke put om de losjes adherente, onrijpe, beenmerg-afgeleide dendritische cellen in suspensie te brengen. Pool vervolgens de cellen voor verzameling door centrifugatie en resuspendeer de pellet in het juiste volume vers kweekmedium voor daaropvolgende downstream analyse. Om syngeneïsche T-cel proliferatie te meten, gebruik eerst de achterkant van een drie milliliter spuitplunger om een milt van een acht tot 10 weken oude OT2 C57BL/6 muis door een 40 micrometer cel strainer te pletten en spoel de strainer af met PBS.

Pellet de gepoolde celsuspensie door centrifugatie en resuspendeer de pellet in 400 microliter magnetische cel sorteer buffer en 100 microliter CD4 positieve T-cel biotin-antilichaam cocktail bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, voeg 300 microliter sorteer buffer en 200 microliter anti-biotine bead toe aan de cellen voor een 10 minuten, vier graden Celsius incubatie en plaats een magnetische bead kolom en een voorafscheidingsfilter in een geschikt gedimensioneerde celscheidingsmagneet. Spoel de kolom af met drie milliliter sorteer buffer en voeg negen milliliter sorteer buffer toe aan de cellen.

Na centrifugatie, resuspendeer de cel en bead pellet in drie milliliter sorteer buffer en voeg de celsuspensie toe aan de kolom om het CD4 positieve T-cel eluaat in een geschikte container te verzamelen. Was vervolgens de kolom met nog eens drie milliliter sorteer buffer, verzamel de flow-through en plaats de T-cellen op ijs. Voor syngeneïsche splenische pan dendritische cel isolatie, plaats de milt van een acht tot tien weken oude C57BL/6 muis in een zes centimeter grote kweekschaal en gebruik een een milliliter spuit, uitgerust met een 25 gauge naald, om een milliliter Collagenase D oplossing twee keer in de milt te injecteren.

Gebruik vervolgens schaar om de milt in kleine stukjes te snijden en incubeer de stukjes met schudden bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten. Aan het einde van de incubatie, voeg 500 microliter 0.5 molair EDTA toe aan de weefselslurry voor een laatste vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, gebruik de achterkant van een drie milliliter spuitplunger om de milt slurry door een 40 micrometer cel strainer te pletten en verzamel de cellen door centrifugatie.

Resuspendeer de pellet in 350 microliter magnetische cel sorteer buffer, 50 microliter Fc receptor blokkeer reagens, en 100 microliter pan dendritische cel biotin-antilichaam cocktail voor een 10 minuten incubatie bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen in negen milliliter sorteer buffer en resuspendeer de pellet in 800 microliter vers sorteer buffer met 200 microliter anti-biotine bead bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten voor isolatie van de splenische pan dendritische cel populatie door magnetische bead sorteer, zoals zojuist aangetoond. Resuspendeer de cellen op een tweemaal 10 tot de vijfde dendritische cellen per milliliter concentratie en behandel ze met de geschikte experimentele concentratie van de triterpenoïde van belang gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Gedurende het laatste derde deel van de incubatie, resuspendeer de T-cellen op een eenmaal 10 tot de zevende cellen per milliliter concentratie in één micromolar CFSE gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Was vervolgens de cellen met PBS en pas het volume opnieuw aan tot een eindconcentratie van tweemaal 10 tot de zesde T-cellen per milliliter. Co-kweek 100 microliter van de behandelde dendritische cellen met 100 microliter van de CFSE-gelabelde CD4 positieve T-cellen in elke put van een 96-puts plaat en voeg 100 nanogram per m