Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1⁺ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat vóór stimulatie, cellen gelijkmatig worden verspreid en vervolgens gelijkmatig worden gestimuleerd in tandemcelhechting. Het aantonen van de procedure zal Azuma Kimura, een afgestudeerde student uit ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen, breng zes milliliter RPMI 1640 in een buis gekoeld tot vier graden Celsius op ijs.

Met behulp van gekoelde een milliliter pipet tips, voeg twee milligram van kelder membraan matrix. Meng goed door zachte pipetting om er een kelder membraan matrix met een concentratie van 0,33 milligram per milliliter. Gebruik vervolgens een pipet om twee milliliter van de verdunde keldermembraanmatrix over te brengen in elke put van een celkweekplaat met zes putten.

Broed de plaat in op 37 graden Celsius gedurende 60 tot 90 minuten. Houd de plaat hierna maximaal drie uur op kamertemperatuur, tot deze klaar is voor gebruik. Eerst, aspirate het gebruikte medium en gebruik een pipet om twee milliliter van 0,5 millimolar EDTA toe te voegen aan elke put om de hPCS's gekweekt in de zes-put plaat te wassen.

Dan, aspirate de EDTA uit de putten en voeg twee milliliter verse 0,5 millimolar EDTA aan elke put. Broed de plaat vijf minuten lang op 37 graden Celsius. Na deze, aspirate de EDTA van elke put.

Voeg een milliliter hPSC-onderhoudsmedium toe bij kamertemperatuur, aangevuld met 10 micromolar Y27632 aan elke put. Pipette voorzichtig maar snel af te blazen van de bijgevoegde cellen op de plaat en om eventuele samengeklonterde cellen te scheiden in enkele cellen. Breng de celsuspensie over in een 50 milliliter centrifugebuis met vier milliliter hPSC-onderhoudsmedium aangevuld met 10 micromolar Y27632 per put en meng door pipetting.

Meng vervolgens 15 microliter celsuspensie met 15 microliter trypanblauw in de buis. Gebruik een pipet van 10 microliter om 10 microliter van de verdunde celopsusopening in dubbele celtellingsdia's over te brengen. Met behulp van een geautomatiseerde celteller telt u het celnummer en berekent u de celdichtheid in de celsuspensie.

Wijs de celsuspensie toe in een buis van 50 milliliter met een dichtheid van één tot anderhalf miljoen cellen voor elke te gebruiken put. Centrifugeren de buis op 200 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gebruik hierna een pipet om de supernatant aan tezuiden en de cellen opnieuw op te schorten met behulp van een milliliter fase 1A-medium per put.

Voorzichtig pipette de cel suspensie en voeg dan nog een milliliter van fase 1A medium per goed. Met behulp van een 1000 microliter pipet, aspirate de verdunde kelder membraan matrix uit de putten van de eerder voorbereide celkweekplaat. Onmiddellijk pipette de schorsing in de buis voorzichtig en breng twee milliliter in elke put van een zes-put plaat.

Bedek de plaat met aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht en plaats de plaat op een schone bank op kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten. Breng hierna de plaat voorzichtig over naar een couveuse bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en een bevochtigde atmosfeer gedurende 24 uur. Schud eerst voorzichtig de plaat en gebruik een pipet om het gebruikte medium aan te wakkeren.

Voeg vervolgens twee milliliter DPBS toe aan elke put. Schud de plaat voorzichtig nog eens en knijp de gebruikte DPBS aan. Voeg vier milliliter van fase 1B medium, voorverwarmd tot 37 graden Celsius, om elke put.

Breng de plaat voorzichtig over naar een couveuse bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en een bevochtigde atmosfeer op cultuur gedurende 48 uur. Schud hierna voorzichtig de plaat en aspiraat het gebruikte medium. Voeg twee milliliter DPBS toe aan elke put.

Herhaal deze aspiratie en toevoeging van DPBS een extra tijd. Schud de plaat voorzichtig en knijp de gebruikte DPBS aan. Voeg vier milliliter van fase 1B medium, voorverwarmd tot 37 graden Celsius, om elke put.

Breng de plaat voorzichtig over naar een couveuse, bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en een bevochtigde atmosfeer op cultuur gedurende 24 uur. Schud eerst voorzichtig de plaat en aspiraat het gebruikte medium. Voeg twee milliliter DPBS toe aan elke put van de zes-put plaat.

Schud vervolgens voorzichtig de plaat en aspirate de gebruikte DPBS. Voeg vier milliliter van fase twee medium, voorverwarmd tot 37 graden Celsius, om elke put. Breng de plaat voorzichtig over naar een couveuse bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en een bevochtigde atmosfeer op de cultuur van vier dagen.

Schud de plaat voorzichtig en knijp het gebruikte medium aan. Voeg twee milliliter DPBS toe aan elke put. Herhaal dit proces van aspirating en het toevoegen van DPPS nogmaals.

Schud hierna voorzichtig de plaat en aspiraat van de gebruikte DPBS. Voeg vier milliliter van fase drie medium, voorverwarmd tot 37 graden Celsius, om elke put. Breng de plaat voorzichtig over naar een couveuse bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en een bevochtigde atmosfeer op cultuur gedurende drie dagen.

In deze studie worden propagerende hIPSEs gecondenseerd en vormen ze een homogene monolaag die geschikt is voor differentiatie. Ongedifferentieerde hIPSEs worden gescheiden en opnieuw als enkele cellen bij lage celdichtheden. Binnen een uur worden de cellen aan de plaat bevestigd en beginnen ze uitsteeksel te vertonen.

Op dag één worden de cellen vermenigvuldigd en goed verdeeld om 80 tot 90% van het oppervlak te bedekken. Op dag drie en vier vormen de cellen een homogeen monolaagblad dat kan worden omschreven als een geplaveide verschijning. Op dit punt stoppen de meeste cellen met het uitdrukken van SOX2, een marker voor ongedifferentieerde cellen, en drukken in plaats daarvan een definitieve endodermmarker, SOX17, uit op meer dan 90%De meeste SOX17-positieve cellen drukken FOXA2 uit.

Dan beginnen de cellen de primitieve goptupemarkers, HNF1-bèta en HNF4-alpha uit te drukken, en uiteindelijk een achterste foregrate pancreatische voorlopermarkering, PDX1, bij meer dan 90%uit te drukken De PDX1-positieve celinductie is reproduceerbaar in een andere hIPSE lijn, 1231A3, en een hESE lijn, KhES-3. QRTPCR-resultaten van de MRNA-expressie van fasemarkeringen komen overeen met immunostaining en de MRNA-expressie van PDX1 is duidelijk in fase drie en neemt daarna aanzienlijk toe. Aangezien ongedifferentieerde ESIPS-cellen als kolonies worden gekweekt, zijn individuele cellen lokaal in een andere staat.

Dit protocol biedt een manier om cellen gelijkmatig te stimuleren voor de gekozen differentiatie.