Name: De cel van de stam van de intestinale isolatie en cultuur in een varkens Model van gesegmenteerde kleine intestinale ischemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van intestinale stamcellen in een varkensmodel van gesegmenteerde darmischemie. Deze methode onderzoekt epitheliale reparatie na ischemisch letsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door de NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130 NIH P30DK034987 en Dept. of klinische wetenschappen verspreiding Funds

Voor deze experimenten, werden alle dierlijke studies goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de North Carolina State University.
1. voorbereiding voor cultuur
Opmerking: Alle reagentia staan in de Tabel van materialen. Specifieke groeifactor concentraties zijn vermeld in tabel 1.
<ol><li>Bereid een 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing in gedestilleerd gedeïoniseerd water (ddH2van O). Meng voldoende en breng de pH op 7.4 met behulp van NaOH en/of HCl-oplossingen. Opmerking: Make-up EDTA stockoplossing verse vóór elk experiment.</li>
	<li>Dissociatie reagens #1 (DR #1) als volgt voorbereiden en plaatsen op het ijs: combineren met fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (PBS), 0.5 M EDTA, 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT), 10 µM Y27632 en 1 X antibiotica-Antimycotic oplossing (Anti-Anti) met penicilline en streptomycine amfotericine-B. Opmerking: Toevoegen Y27632 onmiddellijk voorafgaand aan de collectie van het weefsel.</li>
	<li>Dissociatie reagens #2 (DR #2) als volgt voorbereiden en plaatsen in een waterbad 37 ° C: PBS combineren zonder Ca2 + en Mg2 +, 0.5 M EDTA, 10 µM Y27632 en 1 X Anti-Anti. Opmerking: Toevoegen Y27632 onmiddellijk voorafgaand aan de collectie van het weefsel.</li>
	<li>Intestinale epitheliale cel van de stam (IESC) media als volgt voorbereiden: Mix 25 mL geavanceerde DMEM/F12 medium met 1 X N2 supplement, 1 X B-27 aanvullen, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax en 1 X Anti-Anti. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Een master mix van verminderde groeifactor kelder membraan matrix (matrix) en aanvullende groeifactoren als volgt voorbereiden: ontdooien van de matrix op ijs. In een microcentrifuge buis, voeg 100 ng/mL recombinante menselijke Noggin, 500 ng/mL recombinante menselijke R-Spondin 1, 50 ng/mL recombinante menselijke epidermale groeifactor (EGF), 100 ng/mL recombinante menselijke Wnt3a, 10 mM Nicotinamide, 10 nM gastrine, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 en 2,5 µM glycogeen synthase 3 kinase inhibitor van de omwenteling (GSK3i, CHIR99021). Wanneer de matrix wordt ontdooid, aan te vullen met de groeifactor mix (waardoor master mix) en sla op ijs. Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen zoals dit artefact binnen de matrix patty tijdens beplating zal maken.</li>
	<li>Vooraf warm een 24-well weefselkweek schotel in een incubator 37 ° C vóór het opstarten van cel isolatie procedures.</li>
</ol>2. de chirurgische Model van ischemie en weefsel collectie
<ol><li>Gebruik acht tot tien weken oude Yorkshire gekruist varkens van beide geslachten (aanbevolen). Verwijder alle diervoeders 16-18 h voorafgaand aan de operatie. Toestaan dat varkens toegang tot water te allen tijde.</li>
	<li>Plannen van de varkens te komen ten minste 48 uur vóór de experimenten met het oog op milieu acclimatisering. Opmerking: Opgeleide veterinaire en/of laboratorium technici begeleid door een vergunning gegeven dierenarts geven routinematige dierenverzorgers en bijstand met verdoving procedures.</li>
	<li>Premedicate van het varken met xylazine (1,5 mg/kg intramuscularly (IM)) en ketamine (11-20 mg/kg (IM)),15. Zodra bezadigd, intubate de orotracheally van het varken.</li>
	<li>Handhaven van varkens onder narcose met Isofluraan (2-5%) verdampt in 100% O2 tot het tijdstip van euthanasie.</li>
	<li>Plaatsen van een intraveneuze (IV) katheter (oor ader aanbevolen) en beheren van een vloeistof vervanging zoals lactated ringers oplossing tegen een tarief onderhoud van 15 mL/kg/h.</li>
	<li>Het uitvoeren van routinematige verdoving toezicht met inbegrip van de pols oxymetrie, electrocardiografie en indirecte bloeddruk metingen15. Toezicht op de ademhaling en de moeite van het varken en ventileren handmatig of mechanisch desgewenst als einde getijde CO2 boven 55-60 mmHg stijgt. Opmerking: Passende verdoving wordt bevestigd door de voortdurende monitoring van trends in hartslag (bereik 80-130 slagen/min), niet-invasieve bloeddruk (gemiddelde arteriële druk 75-100 mmHg), respiratoire tarief (10-25 adem/min)16en periodieke controle afwezigheid van kaak en anale Toon. Diepte van anesthesie kan ook worden beoordeeld door mate van ontspanning van de spier en spier Fasciculatie na chirurgische stimulans. Oogbeschadigingen en/of reflexen zijn meestal van geen waarde16. Analgesia kan worden verstrekt, zoals aangegeven door het beleid van de IACUC instellingen. In dit geval kan een opioïden, zoals buprenorfine, tijdens een operatie worden toegediend.</li>
	<li>Plaats het varken op een verwarming pad en beperken in dorsale lighouding voor de chirurgische ingreep.</li>
	<li>De ventrale buik scheren en prep met behulp van chirurgische scrub (chloorhexidine oplossing) en isopropyl alcohol.</li>
	<li>Maak een insnijding van de 8-10-cm ventral midline toegang krijgen tot de buik met een scalpel blad gecentreerd op de navel.</li>
	<li>Het identificeren van de dunne darm (jejunum) ongeveer 40 cm mondelinge naar de kruising ileocecal. Tien-cm lange lussen van jejunum door omtrek tweemaal ligating de darm af te bakenen, één cm tussen elke ligatuur, vóór het maken van daaropvolgende lussen 10 cm gelegen mondeling (Figuur 1).</li>
	<li>Maak twee lussen per tijdstip van ischemie grenzend aan elkaar, één voor ischemie en één voor ischemie met een extra 1h van reperfusie, indien gewenst. Tot volledige ischemie (geen stroom van slagaders of aders), klem of de mesenterische therapieën met bulldog vasculaire klemmen, gebogen Halstead mosquito hemostats of niet-absorbeerbare zijde van de 2-0 voor 1, 2, 3 en 4h afbinden en verwijder klemmen voor 1h van reperfusie, indien gewenst. Opmerking: De auteurs gemaakt van alle lussen van ischemie in volgorde, beginnend met de ischemische lus van 4h en gevorderd verplaatsen proximally (totale chirurgie om tijd te minimaliseren). Om aan de mogelijkheid dat het naburige ischemische intestinale segmenten aangrenzende lussen kan beschadigen, kan de volgorde van de ischemische lussen worden gevarieerd. Dit kan totale chirurgische tijd wijzigen. Opmerking: Het tijdsbestek van reperfusie kan gevarieerd worden afhankelijk van de onderzoeksvraag van belang of als therapieën wenst te beproeven reperfusie deperiode. Echter zoals weefselschade ernstiger van verhoging van de totale duur van ischemie alleen, reperfusie schade waarschijnlijk draagt niet bij tot verdere epitheliale schade. Reperfusie speelt waarschijnlijk een rol na milde perioden van ischemische schade.</li>
	<li>Houd de buik bedekt of gesloten met behulp van een steriele handdoek en/of een handdoek klem tussen ischemie tijdstippen. Opmerking: Binnen een enkel dier voor dit experiment, acht ischemische segmenten kunnen worden gemaakt. Een extra jejunal segment, ten minste 5-10 cm proximaal aan de laatste ischemische lus, die als een normale internecontrolekader dienen zal identificeren.</li>
	<li>Ongeveer drie mesenterische schepen per bulldog vasculaire klem of gebogen Halstead mosquito hemostat belemmeren. Wees voorzichtig tijdens hemostat toepassing omdat de schepen zijn gemakkelijk getraumatiseerd. Probeer te stapelen de schepen binnen de kaken van de klemmen.</li>
	<li>Aan het einde van het experiment, volgende euthanasie met pentobarbital 85-100 mg/kg IV, verzamelen alle lussen van weefsel met behulp van metzenbaum de schaar, na de dood is bevestigd met geen hartslag auscultated en verlies van de cornea reflex. Begin met het verzamelen van een stuk van de controle van normale jejunum minstens 5 - 10 cm proximaal aan de laatste ischemische lus.</li>
	<li>Scheiden en opslaan van de lussen van elk punt van de tijd schade in kleine recipiënten van ijskoud PBS tot klaar voor crypt isolatie. Opmerking: Indien gewenst, make ischemische lussen lang genoeg om te verdelen in afzonderlijke monsters voor histologie en intestinale cel van de stam cultuur; Nochtans, hebben de auteurs gevonden dat loops groter is dan ongeveer 10 cm lang waarschijnlijk zijn tot hemorragische.</li>
</ol>3. crypt (de cel van de stam) isolatie van ischemische en controlelussen
<ol><li>Elke lus van dunne darm met behulp van een 20-gauge draad en weefsel pincet bloot van de mucosal oppervlakte omkeren. Het binden van de boven- en onderkant van de lus veilig met de draad met hechtdraad (2-0 niet-absorbeerbare zijde of gelijkwaardig).</li>
	<li>Spoel na inversie, elke lus in ijs koud PBS luminal puin te verwijderen.</li>
	<li>Leg monsters onmiddellijk in 50 mL conische buizen met DR #1 op het ijs gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Verzamelen van lussen die beginnen met de controle en volg met lusjes van incrementeel toenemende duur van ischemie. Lussen van minder beschadigde weefsel (d.w.z. controle en 1 h ischemische weefsel) kunnen krachtig, worden geschud breuk van de pols voor de beste resultaten. Weefsels van ernstig beschadigde weefsel (3 en 4 h van ischemie) moeten voorzichtig worden wiegde of omgekeerde alleen als teveel schudden leiden verstoring van de crypte en extra weefselvernietiging tot zal. Buizen moeten worden geschud of omgekeerd elke 5 min terwijl op ijs.</li>
	<li>Pipetteer monsters in DR #2 gedurende 10 minuten in een waterbad 37° C. Schud of omkeren buizen elke 5 min.</li>
	<li>Centrifugeer na het overbrengen van de weefsels, de conische buisjes met DR #1 van de 2-4 h beschadigd lussen te verwijderen van de EDTA supernatant (200 x g gedurende 5 minuten). Als deze weefsels zijn sterk beschadigd is het mogelijk dat de crypten hebben al worden losgekoppeld. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met een klein volume van PBS (5 mL) en ga verder met stap 3.9.</li>
	<li>Monsters uit DR #2 verwijderen en plaatsen van weefselmonsters rechtstreeks in 25 mL koude PBS op ijs (label als Wash #1). Leg de monsters op een roteerschudapparaat op ijs op 60 rpm. Blijven schudden of omkeren van elke buis voor 30 s elke 2 tot en met 5 min.</li>
	<li>Na het overbrengen van de weefsels, draai de conische buisjes met DR #2 van de 2-4 h beschadigd lussen te verwijderen van de EDTA supernatant (200 x g gedurende 5 minuten). Als deze weefsels zijn sterk beschadigd is het mogelijk dat de crypten los moeten worden gezien. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met een klein volume van PBS (5 mL) en ga verder met stap 3.9.</li>
	<li>Verwijderen van een hoeveelheid van 50 µL van Wash #1 (of van de DR) om te controleren of de mate van crypt dissociatie en hoeveelheid puin. Plaats van weefsel in een nieuwe conische tube van 50 mL (Wash #2, #3, etc.) gevuld met 25 mL koude PBS en schud totdat intact crypten geïsoleerd met minimale puin en villi zijn. Opmerking: Het doel is om het isoleren van een schone breuk met intact crypten en minimale puin te kunnen. Elke extra wassen zal het schoonmaken van de cellen echter teveel schudden beginnen zal te resulteren in secundaire weefsel/celbeschadiging. Bovendien zal de beste resultaten met de minste verontreiniging worden bereikt als crypten zijn verguld uit een wassen stap en niet uit een dissociatie reagens stap.</li>
	<li>Verwijder het resterende weefsel en de conische buisjes van 50 mL bij 200 x g Centrifugeer gedurende 5 minuten om te verwijderen van de bovendrijvende substantie en resuspendeer de resterende van de crypte pellet in kleinere hoeveelheid PBS (5 mL).</li>
	<li>Met behulp van een omgekeerde microscope, onderzoeken 50 µL aliquots van elk monster te bepalen aantal crypten/breuk. Het doel is 50-100 crypten/50 µL, omdat dit de grootte van de uiteindelijke matrix patty. Opmerking: Als het monster te geconcentreerd is, blijven koud PBS toevoegen tot de gewenste concentratie wordt bereikt. Als voorbeeld ook verdund is, Bepaal hoeveel aliquots moest bereiken gewenste crypt opbrengst en aan te passen.</li>
	<li>Aliquot passende volumecapaciteit van crypten (bepaald door de hoeveelheid opmerkingen) in een microcentrifuge buis. Bijvoorbeeld, als monster bevat 50 crypten/50 µL dan aliquoot 50 µL per patty X 3 repliceert = 150 µL / microcentrifuge buis. Als het monster alleen bevat 25 crypten/50 µL dan 2 aliquots nodig / patty X 3 repliceert = 300 µL/buis.</li>
	<li>Pellet crypten bij 200 x g gedurende 5 min bij 4° C.</li>
	<li>Zachtjes resuspendeer Ingehuld crypten met passende omvang van master mix (50 µL per putje). Meng door snel pipetteren 15 keer zonder dat er luchtbellen. Opmerking: Cool vooraf het uiteinde van de pipet met koude steriel PBS voorafgaand aan de master mix aspirating. Dit zal helpen voorkomen dat de master mix uitspreiden. Tips kunnen ook in de koelkast bewaard worden en in de kap geplaatst onmiddellijk vóór gebruik.</li>
	<li>Afzien van een 50 µL master mix plus crypt druppel in het midden van elk putje van een voorverwarmde 24 goed plaat.</li>
	<li>Incubeer de plaat van de cultuur gedurende 30 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Overlay elke matrix patty met 500 µL / goed van IESC media (geen extra groeifactoren die nodig zijn op dag 0, zoals zij zijn vervat in de master mix).</li>
	<li>500 µL steriel PBS toevoegen aan elke ongebruikte putjes links op de plaat om vochtigheid.</li>
	<li>Aantal vergulde crypten op dag 0. Opmerking: Het is handig om pre raster elke cel cultuur plaat in kwadranten om ervoor te zorgen dat nauwkeuriger tellen.</li>
	<li>Aantal enterospheres elke 24 h tellen en controleren voor enteroid ontwikkeling dagelijks.</li>
	<li>Het toevoegen van groeifactoren aan elke goed elke 48 h. de IESC media elke 96 h Verwijder en vervang door 500 µL verse media (groeifactoren moet vervolgens worden toegevoegd aan media).</li>
</ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14740765">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury%3A+progress+and+promise+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li>
<li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair%3A+the+best+offense+is+a+good+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li>
<li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+clinical+manifestations%2C+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+models+of+digestive+disease%3A+the+future+of+large+animal+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids-Current+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31(2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li>
<li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="https://www.crcpress.com/Swine-in-the-Laboratory-Surgery-Anesthesia-Imaging-and-Experimental/Swindle-Smith/p/book/9781466553477">Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).</li>
<li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="https://trove.nla.gov.au/work/25432600">Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed</a>. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).</li>
<li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li>
<li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li>
<li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li>
<li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ischemia%2Freperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li>
<li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li>
<li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CCN1+%28Cyr61%29+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li>
<li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27213580">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De ontwikkeling van een varkens model van gesegmenteerde intestinale ischemie breidt op eerdere lymfkliertest modellen doordat voor de studie van meerdere tijdstippen van weefsel schade binnen hetzelfde dier. Er zijn verschillende punten van de kritische bespreking van dit protocol, met inbegrip van juiste schip afbinding, weefsel reperfusie en de cultuur van de cel van de succesvolle crypt.
Juiste schip Afbinding is essentieel voor het creëren van een model van volledige ischemie. Als de hechtdraad ongelijk is gebonden of de klem niet strakker volledig, bloed uit de dikwandige slagader kan blijven invoeren van het weefsel en kan niet afsluiten als gevolg van de ineenstorting van de ader dunwandige. Dit resulteert in extravasation van bloed in de lamina propria extra weefsel schade. Echter, afhankelijk van het soort ischemische schade bestudeerd, volledige of hemorragische ischemie kan wensen. Bijvoorbeeld, in het proces van intestinale transplantatie, de darm is volledig gescheiden blijft van de vasculaire levering (slagader en ader) tijdens de resectie fase van de procedure, die tot volledige intestinale ischemie leidt. Anderzijds echter wordt wanneer het mesenterium is gedraaid tijdens een gebeurtenis zoals een intestinale volvulus, de veneuze terugkeer vaak belemmerd eerst, wat leidt tot extra bloed in het weefsel voorafgaand aan de arteriële levering wordt belemmerd, waardoor hemorragische ischemie.
Ischemische schade resulteert in weefselschade, beginnend bij het uiteinde van de villosités en uit te breiden tot de basis van de crypte3. Tijdens ischemie, energie in de vorm van adenosinetrifosfaat blijft worden gebruikt en genereert de metaboliet hypoxanthine. Wanneer het weefsel is reperfused met zuurstof, hypoxanthine wordt gemetaboliseerd door xanthine oxidase en produceert superoxide vrije radicalen leidt tot mucosal schade en de aantrekkingskracht van weefsel beschadiging van neutrofielen17,18. Soorten verschillen in mucosale vasculaire architectuur evenals de variërende uitdrukking van xanthine oxidase, leiden tot wisselend reperfusie schade3. Katachtige en knaagdier modellen van ischemie-reperfusie zijn meer vatbaar voor reperfusie letsel van reactieve zuurstof metabolieten19,20. Daarentegen is varkens bleken te hebben minder xanthine oxidase, en dus minder reperfusie schade, waardoor dit model meer vergelijkbaar is met die van menselijke intestinale ischemie21. Op dit moment, werd het gebruik van knock-out of transgene varkens modellen om te studeren van intestinale letsel niet genoemd, waardoor dit een belangrijke beperking van dit model. Keuze van de juiste diermodel hangt af van het ziekteproces of specifieke voorwaarde de onderzoeker wil bestuderen. Bijvoorbeeld, zijn varkens modellen van ischemische schade tot 6 h beschreven22, overwegende dat de meest ischemische procedures in lymfkliertest modellen zijn 45-60 min23.
Succesvolle isolatie van intestinale cryptes uit normale en ischemically beschadigde darm zorgt voor de studie van epitheliale herstel in cultuur. Dit systeem kan de onderzoeker te uniek te concentreren op het epithelium alleen, aangezien er geen vasculaire levering of immuun cel component te overwegen. Dit biedt de mogelijkheid te bestuderen van epitheliale cel interacties en herstel na letsel naast het antwoord op verschillende groeifactoren, of behandelingen toegediend tijdens de operatie of de volgende crypt isolatie door aanvulling van de voedingsbodems. Deze stap blijft de moeilijkste, omdat los van de zwaar beschadigde lussen vereist zacht schudden en snelle verwijdering van de oplossingen van EDTA-bevattende ingeval de crypten zijn geworden voortijdig losgekoppeld. Als deze lusjes van de darm niet grondig worden gewassen, hebben de crypten het potentieel om besmet raken in cultuur. Dientengevolge, antibioticum-antimycotic oplossing toevoegde aan beide oplossingen DR naast de IESC media. Een ander punt van discussie richt zich op de darm verzameld als een normale controle. Als de dieren ondergaan anesthesie met mogelijke wijzigingen in de systemische weefsel perfusie, samen met de mogelijkheid van circulerende inflammatoire mediatoren ondergeschikt aan ischemie, kan zelfs "normale" controle weefsel niet vertegenwoordigen een echte controle. In deze experimenten is het voor de opmerking dat het besturingselement weefsel verscheen grove en histologisch vergelijkbaar met weefsel van dieren die niet ondergaan ischemie in andere experimenten (Gonzalez, L.M., niet-gepubliceerde gegevens, 2017).
Kortom beschrijft deze methode een reproduceerbare model van varkens intestinale ischemie, die nauw modellen wat er gebeurt in menselijke ischemische schade. Bovendien, het isolement van intestinale stamcellen uit ischemische lussen wordt beschreven, die dient om epitheliale reparatie en mogelijke respons op behandeling in cultuur te studeren.

Intestinale ischemische schade, het resultaat van verminderde zuurstof beschikbaarheid te wijten aan een vermindering of volledige occlusie van de bloedstroom naar de darm, blijft een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij mens en dier patiënten1,2. Ischemische schade, samen met de latere ontsteking en cellulaire infiltratie, leidt tot mucosal barrière compromis. De mucosal barrière is cruciaal voor de preventie van bacteriële translocatie en bijbehorende toxines in de systemische circulatie3,4. De daaropvolgende reperfusie van ischemische weefsels kan resulteren in de vorming van reactieve zuurstof soorten die letsel5 verergeren kanbeschadigen. Aangezien intestinale ischemie zelden vermijdbare is, is meest recente onderzoek gericht op de bevordering van technieken voor vroegtijdige opsporing van ischemie en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen die reperfusie letsel of doel mucosal reparatie verminderen.
Dierlijke modellen zijn uitvoerig gebruikt te breiden onze kennis van de fundamentele wetenschap van ischemie-reperfusie letsel en blijven noodzakelijk voor translationeel onderzoek. Knaagdier modellen zijn de meest gebruikte vanwege hun vermogen om genetisch gemanipuleerde6. Meer recentelijk echter heeft het gebruik van grote diermodellen, specifiek het varken, gepleit voor toekomstige translationeel studies als gevolg van een aantal voordelen waaronder de varkens anatomische en fysiologische gelijkenissen met mens7,8. Een verscheidenheid van letsel modellen zijn ontwikkeld om te bestuderen van ischemie-reperfusie schade en omvatten volledige vasculaire occlusie, low-flow ischemie en regiogebonden mesenterische vasculaire occlusie. Een volledig overzicht van deze modellen is buiten het domein van dit artikel maar de auteurs directe lezers op een recente test3.
Naast in-vivo modellen biedt het gebruik van ex vivo cellulaire cultuur systemen een veelbelovend instrument om te studeren intestinale homeostase en reparatie na letsel. Intestinale stamcellen zijn verantwoordelijk voor cellulaire proliferatie en omzet van de epitheliale darmwand. Als geïsoleerd uit normale of gewonde darm, intestinale stamcellen kan worden gehandhaafd in de cultuur, en dienen als een gereedschap of model te bestuderen van de cel van de stam en epitheliale celbiologie. Methoden om te isoleren en deze driedimensionale cultuur systemen (enteroids en colonoids als afgeleid van de kleine en grote darm, respectievelijk genoemd) zijn beschreven voor een verscheidenheid van soorten en orgaan systemen9,10 ,11,12,13. In het bijzonder binnen het maag-darmkanaal, zijn de systemen van deze cultuur gebruikt om model gastro-intestinale aandoeningen zoals kanker, pathogen infectie en ontstoken darm ziekte14. Op dit moment zijn er geen verslagen beschrijven de isolatie en het onderhoud van intestinale stamcellen uit ischemically gewonde dunne darm in alle soorten. Daarom beschrijven hier we het proces van intestinale ischemie in een nieuwe, grote varkens diermodel waardoor reproduceerbare verwonding en de mogelijkheid om te isoleren van intestinale stamcellen uit normale en ischemically gewonden darm voor de bijkomende studie van herstel ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP-399</td><td>Verdunn 1:10</td></tr><tr><td>Gedestilleerd, gedeïoniseerd water (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Gebruikt om EDTA en PBS voor te bereiden</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiamenetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Maak vers voor elk experiment; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Anti-Anti oplossing</td></tr><tr><td>Recombinant human Wnt-3a</td><td>R &amp; D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Rspondin1</td><td>R &amp; D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Noggin</td><td>R &amp; D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>R &amp; D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Human [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Water, WFI kwaliteit</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Wordt aangeduid als steriele water (SW); voor groeifactor stocks</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Fenolrood vrij</td></tr><tr><td>24 Well Cultuurschaal</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Conische buis, 50 ml&nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Meshandgreep</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische koolstofstalen mes, nr. 10</td><td>World Precision Instruments</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Weefseltang</td><td>World Precision Instruments</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey weefseltang</td><td>World Precision Instruments</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501752</td><td>Gebogen of recht</td></tr><tr><td>Metzenbaum schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>Mosquitotang, gebogen</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>Gebogen of recht (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldogklem</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>Recht</td></tr><tr><td>Zijde, 2-0&nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>Elk soortgelijk merk is acceptabel</td></tr><tr><td>Handdoekklemmen</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Draaddraad, 20 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Snijden en rechttrekken voor gebruik.</td></tr><tr><td>Chirurgische handdoeken</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Elk soortgelijk product is acceptabel.</td></tr><tr><td>Lactaat Ringers oplossing</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhex antisepticum scrub (4%)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Elk soortgelijk merk is acceptabel</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol 70%</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Elk soortgelijk merk is acceptabel</td></tr><tr><td>IV katheter, 22 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>Mogelijk 20g of 24 g nodig, afhankelijk van de grootte van de ader</td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Gecontroleerde medicatie</td></tr><tr><td>Isofluraanoplossing</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasieoplossing (390 mg/ml))</td><td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>Meerdere merken van Pentobarbital Sodium beschikbaar.</td></tr><tr><td>Verwarmingskussen&nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump Core Warming System; andere zijn beschikbaar.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Elk equivalent stuk controleapparatuur is acceptabel</td></tr><tr><td>Verdamper&nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Aanbevolen om een Circle System met Y-stuk te gebruiken; meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Vloeistofpomp</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; Elke soortgelijke fabrikant wordt aanbevolen.</td></tr></tbody></table>

de cel van de stam van de intestinale isolatie en cultuur in een varkens model van gesegmenteerde kleine intestinale ischemie

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Intestinale ischemie blijft een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in menselijk en diergeneeskundig patiënten. Vele ziekteprocessen leiden tot intestinale ischemie, wanneer de bloedtoevoer en dus zuurstof is verlaagd naar de darm. Dit leidt tot de intestinale barrière verlies en schade aan het onderliggende weefsel. Intestinale stamcellen bevinden zich aan de voet van de crypten van Lieberkühn en zijn verantwoordelijk voor intestinale verlenging tijdens homeostase en volgende schade. Ex vivo cel cultuur technieken hebben toegestaan voor de succesvolle studie van de cel van de stam van de epitheliale interacties door de oprichting van kweekomstandigheden die ondersteuning bieden voor de groei van drie-dimensionale epitheliale orgel-achtige systemen (aangeduid als "enteroids" en" colonoids"van de kleine en grote darm, respectievelijk). Deze enteroids zijn samengesteld uit crypte en villosités-achtige domeinen en volwassen om alle van de celtypes gevonden binnen het epithelium te bevatten. Historisch, hebben lymfkliertest modellen gebruikt om te bestuderen van intestinale letsel. Een varkens model biedt echter diverse voordelen, waaronder een gelijkenis van grootte, alsmede de gastro-intestinale anatomie en de fysiologie aan die van de mens. Door gebruik te maken van een varkens model, stellen we een protocol waarin regiogebonden lusjes van intestinale ischemie binnen een enkel dier kunnen worden gemaakt, waardoor de studie van de verschillende punten van ischemische schade en herstellen in vivo. Daarnaast beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur van de intestinale stamcellen uit de ischemische lusjes van de darm, waardoor de verdere studie van epitheliale reparatie, gemoduleerd door stamcellen, ex vivo.

Volledige intestinale ischemie ontstond in kleine intestinale lussen door gebruik te maken van de vasculaire occlusie met hechtdraad of klemmen zoals afgebeeld in Figuur 1. Door het vrijgeven van de klemmen, kan een gecontroleerde periode van reperfusie worden uitgevoerd, waardoor aanvullende studie van latere reperfusie schade indien gewenst. Alle dieren overleefde tijdens de procedure met minimale complicatie tot euthanasie. De meest voorkomende chirurgische complicatie was hypotensie, die met suppletie van een positieve-inotrope zoals dobutamine opgelost.
Indien goed uitgevoerd, ischemische schade begint op het puntje van de intestinale villosités en migreren naar beneden in de crypte als de duur van de verhogingen van de ischemie (Figuur 2). Een veel voorkomende fout met de chirurgische techniek kan optreden wanneer de bloedvaten niet worden afgebonden of gelijkmatig geklemd. Het resultaat is een hemorragische ischemie (Figuur 3), waarin de ader dunwandige voordat de slagader instort, waardoor extra bloed naar de weefsels te infiltreren. Schromelijk wordt dit beschouwd als een donkere paarse serosal oppervlak (Figuur 3, links) in vergelijking met een bleker oppervlak tijdens volledige ischemie (Figuur 3, rechts).
Na verwijdering van de ischemische intestinale loops werden intestinale crypten met succes geïsoleerd volgens de dissociatie protocol (Figuur 4). Zoals verwacht, de crypten van meer zwaar beschadigde timepoints werden vaak gebroken (f; fragment) en crypte breuken bevatte meer achtergrond cellulaire puin in vergelijking met degenen die onderging van geen of lichte schade. Tijdens het protocol, moet de ernstig gewonde darm voorzichtig worden geschud Voorkom extra schade aan het onderliggende weefsel. Schudden ook ongeveer kan leiden tot verdere schade van de crypte en de meerderheid van de crypten eindigend in de DR oplossingen met EDTA, wat resulteert in extra verstoring.
Zodra verguld, crypten van alle tijdstippen van ischemie overleven en zijn in staat om zich te vestigen in cultuur (Figuur 5). Wanneer normale en licht beschadigde intestinale crypten zijn verguld in cultuur, enterospheres formulier binnen 24-48 uur. Met ernstige ischemische schade (3 en 4 h), de intestinale crypten overleven maar zijn beschadigd, wat resulteert in de vorming van veel kleinere bollen in eerste instantie. Door 72-120 h complexer enteroids met duidelijk centraal lumen en ontluikende structuren. Over het algemeen is er een verminderde groei efficiëntie van de crypten en een verminderde grootte van enteroids die zijn afgeleid van de zwaar beschadigde intestinale weefsel (Gonzalez, L.M., niet-gepubliceerde gegevens, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Figuur 1 : Chirurgische model van volledige intestinale ischemie in een varkens model. A) normale varkens jejunum die. B) mesenterische vaartuigen hebben zijn afgebonden met hechtdraad maken van intestinale ischemie. C) ischemie gemaakt met behulp van bulldog vasculaire klemmen toe voor weefsel reperfusie indien gewenst. D) intestinale therapieën onmiddellijk na verwijdering van de vasculaire klemmen. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Figuur 2 : Histologische bewijs (haematoxyline en eosine (H & E) vlek) van toenemende epitheliale schade na langere duur van de volledige intestinale ischemie. Schade begint bij het puntje van de villosités met geleidelijk verlies van eencellige epitheliale laag, villosités afstomping en cellulaire schade uit te breiden tot de crypte basis met ernstig letsel (maximaal 4 h duur). 100 µm schaal bar. Ik = ischemie. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Figuur 3 : Bruto en histologische bewijs van hemorragische ischemie. A) bruto foto vergelijken hemorragische ischemie (linker lus) en volledige ischemie (juiste lus). Wanneer de therapieën is niet afgebonden of geklemd gelijkmatig, kan bloed blijven om te infiltreren in de weefsels, resulterend in bijkomende ontstekingen en schade. B) H & E beelden van hemorragische ischemie van het verhogen van de duur van 1-4 h. Naast cellulaire schade gezien met volledige ischemie, is er bewijs van rode bloedcellen infiltratie in de omliggende lamina propria. 100 µm schaal bar. Ik = ischemie. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Figuur 4 : Aliquots van intestinale crypten geïsoleerd van lussen van ischemische en normale darm. Complete, onbeschadigde intestinale crypten (sterretjes) werden met succes geïsoleerd uit elke lus van darm. Zoals verwacht, de crypten van meer zwaar beschadigde tijdstippen werden vaak gebroken (f; fragment) en crypte breuken bevatte meer achtergrond cellulaire puin in vergelijking met degenen die onderging van geen of lichte schade. 100 µm schaal bar. Ik = ischemie. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Figuur 5 : Tijdsverloop van de cel van de stam van de intestinale groei na het isoleren van ischemische lusjes van de dunne darm. Bij het normale intestinale crypten werden uitplaten in cultuur, wordt enterospheres gevormd binnen 24-48 uur. Met ernstige ischemische schade (3 en 4 h), crypten overleven, maar in eerste instantie veel kleinere bollen vormen. Door 72-120 h complexer enteroids met duidelijk centraal lumen en ontluikende structuren. 20 µm schaal bar tenzij vermeld. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Groeifactor</td>
			<td>Verdunningsmiddel</td>
			<td>Voorraad concentratie</td>
			<td>Voorraad verdunning</td>
			<td>Werkende verdunning</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>1 µg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekertje</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EFG</td>
			<td>10mM azijnzuur</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 µg Mo/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrine</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td>2,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µg Mo/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: groeifactor reagens tabel. Samenvatting van de groeifactor stamoplossingen en werkende oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

Dit protocol kan lezers te succesvol een varkens model van gesegmenteerde intestinale ischemie en vervolgens isoleren cultuur intestinale stamcellen voor de studie van epitheliale reparatie na letsel.

De cel van de stam van de intestinale isolatie en cultuur in een varkens Model van gesegmenteerde kleine intestinale ischemie

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van intestinale ischemie op intestinale epitheliale stamcellen te evalueren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van stamcelbiologie te beantwoorden, zoals hoe stamcellen weerstand bieden tegen beschadiging en bijdragen aan reparatie na ischemisch letsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een groot dierenmodel is dat kan worden gebruikt voor de studie van klinische darmaandoeningen en reparatie.De procedure wordt gedemonstreerd door Amy Stieler Stewart, een afstudeerstudent, en John Freund, een onderzoeksspecialist uit mijn laboratorium. Begin met het maken van een acht tot tien centimeter lange ventrale midline-incisie op de buik, gecentreerd op de navel van een acht tot tien weken oude Yorkshire-kruising varken, met behulp van een scalpelblad. Lokaliseer het jejunum, ongeveer 40 centimeter oraal van de ileocecale junctie.Leg de darm twee keer circumferentieel vast om tien centimeter lange lussen van jejunum af te bakenen met een centimeter tussen elke ligatuur. Maak twee lussen per tijdstip van ischemie naast elkaar, één voor ischemie en één voor ischemie met een extra uur reperfusion. Gebruik bulldog-vasculaire klemmen of hemostatis om ongeveer drie mesenterische vaten per klem te obstructeren voor de geschikte experimentele tijdsperiode om omkeerbare volledige ischemie te induceren.Houd de buik gedurende de gehele ischemische periode bedekt. Gebruik aan het einde van het experiment Metzenbaum-schaar om eerst een controlestuk van normaal jejunum te verzamelen, minstens vijf tot tien centimeter proximaal van de laatste ischemische lus, gevolgd door het verzamelen van de rest van de lussen. Bewaar de lussen van elk letseltijdstip in kleine bakjes met ijskoud PBS tot cryptisolatie.Gebruik een 20-gauge draad en weefseltang om elke lus van de dunne darm om te draaien zodat het mucosale oppervlak wordt blootgesteld om de crypt-stamcellen te isoleren. Naai de boven- en onderkant van elke lus stevig aan de draad en spoel elke omgekeerde lus in ijskoud PBS. Wanneer al het luminale puin is verwijderd, plaats de monsters onmiddellijk in individuele 50 milliliter conische buisjes met 30 milliliter dissociatiereagens nummer een op ijs gedurende 30 minuten met schudden en omkeren elke vijf minuten.Aan het einde van de incubatieperiode, breng de monsters over in overeenkomstige 50 milliliter buisjes met 30 milliliter dissociatiereagens nummer twee en pellet de twee tot vier uur ischemische lus monsters door centrifugatie. Resuspendeer de pellets in vijf milliliter PBS en gebruik een 50 microliter aliquot van elk monster om de mate van crypt-associatie en hoeveelheid puin te controleren door middel van lichtmicroscopie. Plaats vervolgens de monsters in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten met schudden of omkeren elke vijf minuten.Breng de monsters vervolgens direct over in 25 milliliter ijskoud PBS op ijs in een orbitale shaker ingesteld op 60 RPM gedurende twee tot vijf minuten schudden met extra handmatig schudden of omkeren elke 30 seconden. Controleer aan het einde van de schudincubatie de mate van crypt-associatie en hoeveelheid puin en breng de monsters over in nieuwe 50 milliliter conische buisjes met 25 milliliter koud PBS voor schudden tot intacte crypts zijn geïsoleerd met minimale puinhopen en villi. Wanneer de lussen volledig zijn gedissocieerd, verwijder het resterende weefsel, pellet de monsters door centrifugatie en resuspendeer de resterende crypt-pellets in vijf milliliter vers PBS.Als volgende, verdeel 150 crypts per buisje in individuele microcentrifugebuisjes en pellet de crypts door microcentrifugering. Gebruik een voorgekoelde pipet om de pellets voorzichtig te resuspenderen met 50 microliter mastermix per putje gevolgd door snel pipetten 15 keer om te mengen. Verdeel vervolgens een 50 microliter crypt-druppel in het midden van elke put van een voorgevormde en gerailleerde 24-putsplaat en plaats de plaat in een 37 graden Celsius incubator.Na 30 minuten, plaats 500 microliter per putje van darmepitheliale stamcelmedium bovenop elke matrixpasteitje en voeg 500 microliter steriele PBS toe aan eventuele ongebruikte putjes om de vochtigheid te behouden en tel het aantal geplateerde, dag nul crypts. Voeg elke 48 uur groeifactoren toe aan elk putje en vervang het supernatant elke 96 uur door 500 microliter vers groeifactor-gesupplementeerd medium. Complete intestinale ischemie wordt gecreëerd in kleine darmlussen door vasculaire occlusie met hechtingen of klemmen, zoals getoond.Als correct uitgevoerd, zal ischemische beschadiging beginnen aan de punt van de darmvilli en migreren naar beneden in de crypt naarmate de duur van de ischemie toeneemt. Een veelvoorkomende fout met de chirurgische techniek kan optreden wanneer de bloedvaten niet gelijkmatig worden vastgelegd of geklemd, wat resulteert in een hemorragische ischemie waarbij de dunne wand van de ader voor de slagader instort, waardoor extra bloed in het weefsel kan infiltreren. Na verwijdering van de ischemische darmlussen kunnen de intestinale crypts met succes worden geïsoleerd volgens het dissociatieprotocol zoals zojuist is gedemonstreerd.Crypts van meer ernstig beschadigde tijdstippen zijn vaak gebroken en bevatten meer achtergrondcellulair puin in vergelijking met die welke geen of milde schade ondergaan. Wanneer normale en licht beschadigde intestinale crypts in cultuur worden geplaatst, vormen zich binnen 24 tot 48 uur enterosferen. Bij ernstige ischemische schade overleven de intestinale crypts maar zijn ze beschadigd, wat resulteert in de vorming van aanvankelijk veel kleinere bolletjes.Na 72 tot 120 uur worden enteroïden van alle crypts complexer met duidelijke centrale lumina en ontluikende structuren, en met een algemene verminderde crypt-groei-efficiëntie, evenals verminderde grootte in de enteroïden afgeleid van de ernstig beschadigde darmweefsel. Eenmaal beheerst, kunnen de crypt-isoleerplateerprocedures in ongeveer twee tot drie uur worden voltooid als ze correct worden uitgevoerd. Het is het beste dat de crypts die voor plateren worden verzameld, zijn afgeleid van wasbeurten en niet van dissociatiefracties vanwege de verhoogde kans op cult

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit artikel en de bijbehorende video presenteren ons protocol voor het genereren van weefsel-engineered darm in muizen, waarbij een organoid units-on-scaffold benadering.

Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel

Hier beschrijven we de gedetailleerde procedure van intestinale ischemie-reperfusie bij muizen waardoor reproduceerbaar letsel zonder sterfte aan de standaardisatie van deze techniek in het veld bevorderen. Dit model van intestinale ischemie-reperfusieschade kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.

Muizenmodel van Intestinale ischemie-reperfusie schade

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Hier presenteren we een protocol om muizendarmmesenchym te isoleren, inclusief telocyten. Deze kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, zoals co-cultuur met muis of van de mens afgeleide organoïden, om de groei te ondersteunen en de situatie in het oorspronkelijke weefsel beter weer te geven.

Isolatie van muizendarmmesenchym resulterend in een hoge opbrengst van telocyten

We beschrijven hoe we een veelgebruikt chirurgisch model van intestinale ischemie-reperfusieschade (IRI) bij knaagdieren kunnen genereren. De procedure omvat occlusie van de superieure mesenteriale slagader, gevolgd door het herstel van de bloedstroom. Dit model is nuttig voor studies die occlusieve oorzaken van intestinale IRI in zowel de diergeneeskunde als de menselijke geneeskunde onderzoeken.

Knaagdiermodel van intestinale ischemie-reperfusieschade via occlusie van de superieure mesenteriale slagader

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

Hier beschrijven we een protocol om varkensdarm 3D-organoïden te kweken uit gecryopreserveerde epitheelcrypten. We beschrijven ook een methode om celmonolagen vast te stellen die zijn afgeleid van 3D-organoïden, waardoor toegang wordt verkregen tot de apicale kant van epitheelcellen.

Kweek van biggendarm 3D-organoïden uit gecryopreserveerde epitheliale crypten en oprichting van celmonolagen

We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de aanschaf van een alvleesklier van varkens voor isolatie en zuivering van eilandjes.

Chirurgische perfusie en isolatie van de alvleesklier van varkens voor isolatie van eilandjes

Deze studie schetst een protocol voor het genereren van 2D-monolagen van varkensorganoïden afkomstig van de dunne en dikke darm. De groei van deze monolagen wordt gekenmerkt door toenemende TEER-waarden, wat wijst op een robuuste epitheliale integriteit. Bovendien vertonen deze monolagen fysiologische secretoire reacties in Ussing-kamerexperimenten na de toepassing van forskolin.

Tweedimensionale darmorganoïden van varkens die de fysiologische eigenschappen van de inheemse darm weerspiegelen

Leer de isolatie en cultuur van intestinale stamcellen in een varkensmodel van gesegmenteerde darmischemie. Deze methode onderzoekt epitheliale reparatie na ischemisch letsel.

De cel van de stam van de intestinale isolatie en cultuur in een varkens Model van gesegmenteerde kleine intestinale ischemie

Meer video's verkennen