Name: Kwantificeren van Microglia morfologie van Photomicrographs van Immunohistochemistry bereid van weefsel met behulp van ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer microglia-morfologie kwantificeren van immunohistochemie-weefsel met ImageJ. Deze methode gebruikt skelet- en fractalanalyse voor hoogdoorvoets onderzoek naar neuro-inflammatie en celvorm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie kreeg financiële steun van de NINR (F32NR013611). Wij willen verder erkennen en dank de ontwikkelaars van AnalyzeSkeleton(2D/3D) en FracLac (Arganda-Carreras et al. en Karperien et al., respectievelijk) zonder dat de hierin beschreven analyse niet mogelijk zou zijn.

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection(2013).</li>
<li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+microglia%3A+a+morphological+definition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096(2014).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients%2C+Impairs+Microglial+Motility%2C+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis%2FMicroglial+Phagocytosis+Uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466(2016).</li>
<li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection(2017).</li>
<li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211(2017).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li>
<li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li>
<li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+response+to+Alzheimer%27s+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li>
<li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li>
<li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections%3A+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm</a> (2013).</li>
<li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+microglia+activation%3A+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576(2017).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2014).</li>
<li>Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal%2C+Multifractal%2C+and+Lacunarity+Analysis+of+Microglia+in+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection(2015).</li>
<li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/283055226_3D_quantitative_analysis_of_microglial_morphology">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li>
<li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microglia cellen zijn fijn afgestemd op de Fysiologie en pathologie binnen hun micro-domeinen en een breed scala van morphologies-2 weer te geven in zowel subtiele7,14 en bruto letsel8. Het gebruik van ImageJ protocollen microglia morfologie kwantificering toegankelijk maakt voor alle laboratoria als platform en plugins zijn een open-source software voor beeldverwerking. Terwijl het beschreven protocol is gericht op de beeldverwerking en de analyse met behulp van deze software, begint de consistentie van gegevensverzameling, geldigheid en betrouwbaarheid met uitstekende IHC en microscopie. Dit protocol wordt gebruikt om binaire, skelet, en overzicht representaties van de hele photomicrographs en afzonderlijke cellen te verbeteren, maar kan niet de plaats innemen van arme IHC kleuring en microscopie die resulteert in een laag contrast, wazig of vervormd beelden. Als een extra vergoeding, wees voorzichtig niet om plat van het hersenweefsel tijdens opslag, vóór het segmenteren, die onherroepelijk microglia morfologie verandert. Tot slot, binnen elk experiment, microglia moet worden beeld met behulp van dezelfde schaal, evenals de dezelfde Microscoop. Instrumentatie, doelstellingen en software verschillen onder microscopen die zal resulteren in verschillende grootte photomicrographs ondanks soortgelijke doelstellingen en wijzigen van de details, alsmede het aantal cellen binnen elk frame. Beeldacquisitie met behulp van een 40 X-doelstelling op een Leica SPII resulteert bijvoorbeeld in tweemaal het aantal cellen en minder detail dan overname met behulp van een Zeiss-880. Dit is vooral belangrijk voor cel restanten gegevens verzameld uit het gehele frame in plaats van een enkele cel, zoals dit een probleem voor de bemonstering van de gegevens wordt.
In het algemeen, skeleton analyse die gebruik maakt van de hele gekleurd wordt voorafgegaan door de eencellige fractal analyse om twee redenen. Bepalende cel restanten van alle cellen in een gekleurd is snel in vergelijking met de eencellige fractal analyse en kan worden beschouwd als een screening tool als tijd een factor is. Daarnaast worden de binaire afbeeldingen afgeleid tijdens de skeleton analyse gebruikt voor analyse van de fractal. Zodra het beeld, zijn er een aantal essentiële stappen die kunnen beïnvloeden skelet analyseresultaten en de invoering van gebruiker-invloed. Het protocol stappen die meeste variabel tussen gebruikers zijn zijn stap 4.2 (toenemende helderheid van de afbeelding) en stap 4.5 (bepalen van de drempel). Waar mogelijk, is een optimale nummer te verhogen van de helderheid (max of min schuifregelaar tussen 0-255) vastgesteld en constant voor alle afbeeldingen en gebruikers gehouden. Waar beeld variabiliteit groot is, kan de gebruiker in plaats daarvan een helderheid die tussen de afbeeldingen variëren zal kiezen. Als afbeeldingen licht zijn en contrast hoog is, dan meer helderheid kan worden weggelaten en drempelmethode kan worden herleid met behulp van een speciale drempel filter (bv., Huang) in plaats van de meer variabele standaard. Zodra geoptimaliseerd, de parameters moeten in acht worden genomen om het minimaliseren van extra gebruiker-invloed.
Een voorbeeld van de variabiliteit van de gebruiker is opgenomen in afbeelding 5. Gegevenswaarden in gebruiker 1 versus gebruiker 2 werden verhoogd en daarom variabiliteit zou worden verhoogd als zowel gebruiker 1 en 2 van de gebruiker aan het verzamelen van gegevens bijgedragen. Een voorbeeld van de verschillen in gebruiker 1 en gebruiker 2 binaire en skeletonized beelden worden aangegeven met gekleurde cirkels (Figuur 5). In dit geval waren beide gebruikers kort opgeleide studenten met beperkte expertise in microglia. Regelmatig toezicht en begeleiding door een deskundige samen met verhoogde protocol opleiding2 microglia kunnen verminderen tussen gebruiker variabiliteit. Hoewel hier niet beoordeeld, immers fractal analyse minder afhankelijk van Inter gebruiker variabiliteit binaire cellen zijn handmatig en individueel geïsoleerd van een gekleurd in plaats van te vertrouwen alleen op drempelmethode om microglia vormen. Echter bezitten alle methoden sommige variabiliteit tussen de gebruikers. Dus, een enkele gebruiker (in het ideale geval getraind door enkele expertise in microglia cellen) het verzamelen van de gegevens voor een gehele dataset moeten worden voltooid.
Extra wijzigingen kunnen gemakkelijk worden gedaan om dit protocol en beeldkwaliteit, en alles in het werk verminderen lawaai en ervoor zorgen dat proces connectiviteit zal afhangen. Bijvoorbeeld, als contrast voldoende is, dan onscherp masker is niet nodig en kan worden weggelaten. Het is verstandig om te optimaliseren en het protocol voor een specifieke set van beelden, zowel experimentele gevallen en controles, vóór het verzamelen van gegevens uit een hele reeks af te ronden. Tot slot, extra plugins kan worden gebruikt in plaats van anderen te verduidelijken of verscherpen van afbeeldingen die niet werden beschreven in dit protocol zoals verwijden of verscherpen.
Voordelen van dit protocol zijn de universele beschikbaarheid en aanpassingsvermogen. Daarnaast, is beoordeling van de restanten van de cel met behulp van AnalyzeSkeleton snel en van toepassing op een gehele gekleurd. Een voordeel van meerdere cellen analyse aanpak is de focus op een hele regio in plaats van afzonderlijke cellen. Men kan dus snel beoordelen de gemiddelde restanten (in termen van eindpunten en proces lengte) van alle microglia binnen het besturingselement image. Skelet analyse geeft een analyse van meerdere cellen: een steekproef van de gegevens in cel aantallen die niet kunnen worden afgestemd door fractal analyse als gevolg van de investering van de vereiste tijd te isoleren van de afzonderlijke cellen van photomicrographs. Een exemplaar waar dit misschien wel geschikt zou zijn bij bevolkingsonderzoek microglia morphologies in proximities aan een focal verwonding. Een beperking is het hele veld beeldweergave om skelet modellen van IHC photomicrographs is onvolmaakt in vergelijking met de meer tijdrovend eencellige aanpak. Bovendien, is een regio-analyse niet overeenkomen met de omstandigheden waar microglia morphologies zijn drastisch anders binnen hetzelfde veld. Tot slot, deze analysemethode is afhankelijk van aantal cellen, een parameter die tussen experimentele omstandigheden verschillen kan.
Fractal analyse wordt uitgevoerd op een enkele cel en daarom is een aanvulling op de gemiddelde cel restanten gegevens output die voortvloeien uit de skeleton analyse. Hoewel veel meer tijd consumeren, deze investering een breed scala van Morfometrische gegevens levert. Bijvoorbeeld celdichtheid, span-verhouding, en cirkelvormigheid gegevens beschrijven de grootte, rek en vorm van de omtrek van de cel, respectievelijk. Fractale dimensie en lacunarity samen te vatten de cel Complexiteit en heterogeniteit van de vorm, respectievelijk. Een meer diepgaande samenvatting van hoe elke parameter wordt berekend en hoe gegevens kunnen worden geïnterpreteerd wordt verstrekt in de interactieve handleiding16 en zo gedetailleerd moet worden beschouwd met betrekking tot de specifieke onderzoeksvraag. Het beschreven protocol resulteert in gevoelige hulpmiddelen te kwantificeren pasmunten in 2D microglia morphologies die zich in fysiologische en pathologische omstandigheden voordoen kunnen. Extra Morfometrische analyse zoals degelijkheid en convexiteit16,20 van de factor van de vorm wellicht mogelijk als het genereren van 3D-vormen.
Protocol ontwikkeling en aanpassing is continu en gebruikersgerichte. Het is uitgebreid van fluorescentie8 DAB/helder-veld beelden7 , maar nog niet ingesloten weefsel paraffine. Het toevoeging, het kan worden gebruikt in combinatie met propriëtaire software zoals Imaris voor aanvullende analyse. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van fysiologie en is niet beperkt tot microglia maar naar een cel of een weefsel met bijzondere patronen of vormen die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van IHC methoden kan worden toegepast. Tot slot, met voldoende grootte van de steekproef, een experiment met meerdere varianten of cluster analyse kan worden toegepast om te stratificeren microglia volgens morfologie12,21; Dit is nuttige informatie zoals microglia morfologie een belangrijke indicator van microglia functies en reacties op hun omgeving is. De waardering voor microglial morfologische diversiteit is groeiende en het belangrijk dat u volledig begrijpt neuron-glia-vasculaire interacties tijdens gezondheid en ziekte. Groei in dit veld wordt versterkt door goed ontwikkelde, makkelijk te gebruiken en reproduceerbare protocollen te kwantificeren en microglia morfologie met behulp van meerdere continue variabelen samen te vatten.

Microglia hebben een onmiddellijke en diverse morfologische reactie op veranderingen in de hersenen fysiologie1 langs een continuüm van mogelijkheden die variëren van hyper-restanten en zeer complexe morphologies-vertakte en Wortelpotigen morphologies2 . Microglia wellicht ook gepolariseerde en staafvormig3. Microglia cel restanten wordt meestal gedefinieerd als een complexe shape met meerdere processen en wordt vaak gemeld als het aantal eindpunten per cel en de lengte van de processen van de cel. Aangezien microglia zijn fijn afgestemd op neuronale en gliale functie t/m continu cel cross-talk en in vivo motiliteit4,5, kunnen microglia morphologies dienen als indicatoren van uiteenlopende cel functies en stoornissen in de hersenen. Een kwantitatieve benadering is nodig om voldoende beschrijven de diversiteit van deze morfologische veranderingen en het te onderscheiden van de verschillen tussen vertakte cellen die zich met subtiele fysiologische verstoringen (zoals epilepsie5,6 voordoen en hersenschudding7) naast bruto schade (zoals beroerte8). Een intensiever gebruik van morfologie kwantificering7,8,9,10,11,12,13,14 zal onthullen de volledige diversiteit van microglia morphologies tijdens gezondheid en ziekte. De huidige studie details de stapsgewijze gebruik voor ImageJ plugins nodig om samen te vatten microglia morfologie van TL of niet-belichting fluorescerende photomicrographs van microglia in vaste knaagdier weefsel na immunohistochemistry (IHC verworven).
Centraal aan de analysetechnieken die hier worden beschreven zijn de ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, ontwikkeld in 2010 tot grote borstklier structuren, kwantificeren en FracLac16, ontwikkeld in 2014 te integreren ImageJ en fractal analyse kwantificeren van individuele microglia vormen. Deze plugins bieden een snelle analyse van microglia restanten binnen de gehele photomicrographs of meerdere microglia van een gedefinieerde ROI binnen een gekleurd. Deze analyse kan alleen of in aanvulling met fractal analyse worden gebruikt. De eencellige fractal-analyse (FracLac) vereist een investering van tijd, maar biedt meerdere morfologie uitgangen met betrekking tot microglia complexiteit, vorm en grootte. Het gebruik van beide tools is niet overbodig, als cel restanten vormt een aanvulling op de complexiteit van de cel, en de combinatie van meerdere parameters kan worden gebruikt om te onderscheiden tussen uiteenlopende microglia morphologies binnen datasets12,17.

<table><tbody><tr><td>primary antibody anti-IBA1</td><td>Wako&nbsp;</td><td>019-19741</td><td>rabbit host</td></tr><tr><td>Vectashield soft mount</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>donkey host</td></tr><tr><td>4 mL glass vial</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificeren van microglia morfologie van photomicrographs van immunohistochemistry bereid van weefsel met behulp van imagej

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia zijn hersenen fagocyten die deelnemen aan de hersenen homeostase en voortdurend onderzoek hun omgeving voor dysfunctie, verwonding en ziekte. Als de eerste responders, microglia hebben belangrijke functies te verzachten neuron en glia dysfunctie, en in dit proces, zij een breed scala van morfologische veranderingen ondergaan. Microglia morphologies Samaraculturen kunnen worden gecategoriseerd en anderzijds kunnen worden gekwantificeerd als een continu variabele voor parameters, zoals de restanten van de cel, complexiteit en vorm. Terwijl de methoden voor het kwantificeren van microglia worden toegepast op afzonderlijke cellen, toepassen paar technieken op meerdere microglia in een hele gekleurd. Het doel van deze methode is te kwantificeren van meervoudige en enkelvoudige cellen met behulp van gemakkelijk beschikbare ImageJ protocollen. Dit protocol is een samenvatting van de stappen en ImageJ plugins aanbevolen fluorescentie en helder-veld photomicrographs converteren naar representatieve binair en skeletonized beelden en te analyseren met behulp van software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) en FracLac voor de verzameling van de gegevens van de morfologie. De uitgangen van deze plugins samenvatten cel morfologie in termen van proces eindpunten, kruispunten, en lengte evenals complexiteit, cel vorm en grootte descriptoren. Het skelet analyse protocol hierin beschreven is geschikt voor een regionale analyse van meerdere microglia binnen een gehele gekleurd of de regio van belang (ROI) Overwegende dat de FracLac biedt een aanvullende individuele cel analyse. Gecombineerd, voorziet het protocol in een objectieve, gevoelige en uitgebreide beoordeling hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het stratificeren tussen uiteenlopende microglia morphologies aanwezig in de hersenen gezond en gewonden.

De microglia morfologie analyse protocollen hierin beschreven samenvatten stappen behulpzaam bij de verwerking van TL en DAB photomicrographs voor Morfometrische analyse. Deze stappen zijn visueel samengevat in Figuur 2 en Figuur 3. Het doel van deze stappen is een representatieve binair en skeletonized afbeelding die op de juiste wijze de oorspronkelijke gekleurd modellen zodanig zijn dat de verzamelde gegevens geldig zijn. Na de looptijd van het protocol, de plugin AnalyzeSkeleton resulteert in een gecodeerde skelet afbeelding waarvan het aantal eindpunten en tak (dwz., proces) lengthcan van de resulterende output bestanden worden samengevat. Eindpunten en proces lengtegegevens worden vervolgens gebruikt om te schatten van de omvang van microglia restanten in de gekleurd of ROI. Figuur 4 geeft een overzicht van de resulterende gegevens (eindpunten/cel- en proces lengte/cel) met en zonder de toepassing van het protocol. Hoewel vergelijkbare tendensen bestaan, zijn de gegevens samengevat in figuur 4F minder variabel dan die in figuur 4E. Bovendien deze gegevens illustreren verhoogde gevoeligheid voor het detecteren van de verschillen tussen groepen wanneer het protocol wordt toegepast. Tot slot moet worden gezorgd tussen gebruiker variabiliteit in de toepassing van het protocol betreffende. Dergelijke verschillen zijn samengevat in Figuur 5 waar de dezelfde gegevensset werd geanalyseerd door twee onafhankelijke gebruikers een identieke protocol toe te passen, zoals kort samengevat boven.
Extra morfologie gegevens worden bijeengezocht uit afzonderlijke cellen geïsoleerd van de binaire installatiekopieën die zijn gemaakt tijdens de looptijd van het protocol. De stappen van het protocol om te analyseren microglia morfologie voorafgaand aan en het gebruik van de FracLac plugin worden samengevat in Figuur 6. We illustreren deze analyse in beide ongedeerd (figuur 6A) en gewond (figuur 6B) weefsel. Representatieve beelden van binary, overzicht, bolle romp/encapsulating cirkel en vak tellen voorbeelden voor elke cel geanalyseerd met en zonder het protocol toepassing worden weergegeven in Figuur 6 c--F. Deze beelden helpen illustreren de oorsprong van verschillen in morfologie-gegevens die zijn samengevat in figuur 6G.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Figuur 1. Illustraties van skeletonized microglia met een cirkelvormige soma (suboptimaal) versus een gemeenschappelijke oorsprong soma (optimaal) en de bijbehorende overlay tussen de skeletonized cel en de oorspronkelijke gekleurd. Schaal bar = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Figuur 2. Protocol van toepassing op fluorescerende photomicrographs. Illustraties van het protocol van de Skeleton analyse toegepast op een fluorescerende gekleurd met een eencellige bijgesneden om details te tonen. Schaal bar = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Figuur 3. De looptijd van het Protocol tot helder-veld DAB photomicrographs. Illustraties van het protocol van de Skeleton analyse toegepast op een heldere-veld DAB gekleurd met een eencellige bijgesneden om aan te tonen van details. Schaal bar = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Figuur 4. Data-analyse met en zonder de toepassing van het protocol. (A) een voorbeeld gekleurd van fluorescerende IHC en bijgesneden cel die overeenkomt met het gele vak in (B). Binaire en skeletonized voorbeeldafbeeldingen met (C) en zonder (D) het protocol toegepast zoals beschreven. Samenvattingsgegevens van microglia eindpunten/cel- en proces lengte/cel in ongedeerd (wit) en gewonden van de corticale weefsel (grijs) met (E) en zonder (F) het protocol toegepast. Statistische analyse met behulp van de student t-test en n = 3, ** p < 0.01 duidt. Schaal bar = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Figuur 5. Verschillen met toepassing van het protocol. Een voorbeeld van een originele afbeelding en protocol conversie naar binair en skelet beelden door gebruiker 1 en 2 van de gebruiker. Verschillen tussen de twee beelden zijn gemarkeerd met gekleurde cirkels bijpassende. Samenvatting grafieken van microglia eindpunten/cel- en proces lengte/celgegevens in ongedeerd en gewonden hersengebieden door gebruiker 1 en 2 van de gebruiker. Statistische analyse met ANOVA en monster grootte is n = 3; p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Schaal bar = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Figuur 6. Fractal analyse met en zonder de toepassing van het protocol. Voorbeeld van bijgesneden photomicrographs van microglia in de ongedeerd (A) en geblesseerde (B) cortex met bijbehorende binaire (C) en (D) overzicht afbeeldingen waardoor met en zonder het protocol toegepast. De bijbehorende convex omhulsel (blauw) en bijvoeging cirkel (roze) voor overeenkomende overzicht vormen (E) worden gebruikt voor het berekenen van de dichtheid van de vorm, verhouding en cirkelvormigheid (G) omspannen. Het vak tellen methode is geïllustreerd in (F), en gebruikt voor Fractale dimensie (DB) en lacunarity (λ) berekeningen (G). Schaal bar = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Microglia zijn hersenen immune cellen die enquête en reageren op veranderde hersenen fysiologie via morfologische veranderingen die kwantitatief kan worden beoordeeld. Dit protocol schetst een ImageJ gebaseerd analyse protocol te vertegenwoordigen microglia morfologie als continu gegevens volgens de statistieken, zoals de restanten van de cel, complexiteit en vorm.

Kwantificeren van Microglia morfologie van Photomicrographs van Immunohistochemistry bereid van weefsel met behulp van ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Het algemene doel van deze skelet- en fractalanalysemethoden is om microglia-morfologie vanuit IHC-voorbereide weefsel te meten, met behulp van kwantitatieve methoden die zowel high-throughput van aard zijn als gevoelig om kleine verschillen in celvormen te detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuro-inflammatie, door de nuances van microglia-vorm en functie tijdens gezondheid en ziekte te definiëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de microglia-morfologie kwantificeert met behulp van continue in plaats van categorische variabelen.De hier beschreven methoden vereisen geen eigen software en kunnen worden gebruikt voor screening van hersengebieden of een cel-per-cel analyse. Het demonstreren van de procedure zal Kimberly Young zijn, een techneut uit mijn laboratorium. Zorg ervoor dat voordat u begint, de AnalayzeSkeleton plugin is gedownload naar ImageJ of Fiji.Open vervolgens een 30 micron Z stack met Iba1 immunogeverfd hersenweefsel. Als u een fluorescentiefotomicrograaf gebruikt, zorg er dan voor dat het beeld 8-bits is en zet het om naar grijswaarden om alle positieve kleuring het beste te visualiseren. Gebruik de werkbalk en klik op Afbeelding, Lookup Tables, Grijstinten.Als u een DAB lichtveldfoto gebruikt, gebruik dan eerst de FFT Bandpass filter plugin met de standaardinstellingen. Klik op Verwerking, FFT, Bandpass Filter en zet vervolgens om naar grijswaarden. Als het beeld te donker is om het proces van de microglia te visualiseren, gebruik de werkbalk en klik op Afbeelding, Aanpassen, Helderheid/Contrast.Stel de minimale of maximale schuifregelaars in zoals nodig, tot aan de randen van de histogram maar niet verder. Het aanpassen van de helderheid produceert de meeste variatie in gegevensanalyse en is daarom de meest kritische stap. Voer vervolgens een Unsharp Mask filter uit om het contrast verder te verhogen door op Verwerking, Filters, Unsharp Mask te klikken.Voer een ontspeckle stap uit om zout-en-peperruis te verwijderen die wordt gegenereerd door de Unsharp Mask. Gebruik de werkbalk en klik op Verwerking, Ruis, Ontspeckle. Zet het beeld om naar binair door Afbeelding, Aanpassen, Drempelwaarde te selecteren.Pas vervolgens de Despeckle functie toe op het binaire beeld om eventuele resterende enkele pixel ruis te verwijderen. Pas vervolgens de Sluit functie toe door op Verwerking, Binair, Sluiten te klikken om donkere pixels te verbinden die gescheiden zijn door maximaal twee pixels. Verwijder vervolgens uitbrekers door op Verwerking, Ruis, Uitbrekers verwijderen te klikken.Nadat u het beeld als apart bestand heeft opgeslagen voor toekomstig gebruik, skeletiseert u het beeld met behulp van de werkbalk door op Verwerking, Binair, Skeletiseren te klikken. Selecteer het skeletachtige beeld en voer de AnalyzeSkeleton plugin uit door op Plug-ins, Skelet, Skelet analyseren te klikken en het vakje takinformatie te vinken. Kopieer de gegevens uit de resultaten en takinformatie uitvoer en plak de gegevens in een Excel-spreadsheet.In Excel, snijd de gegevens bij om skeletachtige fragmenten te verwijderen die het resultaat zijn van IHC en beeldacquisitie. Bepaal welke lengte van fragmenten uit de dataset zal worden bijgesneden door het skeletachtige beeld in ImageJ te openen en het Lijngereedschap te selecteren. Meet verschillende fragmenten, houd rekening met de gemiddelde lengte en bepaal een afsnijwaarde, die consistent moet zijn door de hele dataset.Sorteer het Excel-spreadsheet aangepast door op Sorteren en Filteren, Aangepast sorteren te klikken. Sorteer op eindpunt voxels van groot naar klein, en op een nieuw niveau, op Mx tak PT van groot naar klein. Verwijder elke rij die twee eindpunten bevat met een maximale taklengte van minder dan de afsnijwaarde.Tel de gegevens in de eindpuntkolom op om het totaal aantal eindpunten dat van het beeld is verzameld te berekenen. Herhaal voor takinformatiegegevens na sortering op taklengte. Nadat alle gegevens zijn bijgesneden en opgeteld, deel de gegevens van elk beeld door het aantal microglia soma's in het bijbehorende beeld.Voer de uiteindelijke eindpunt- en celaantallen en taklengte per cel gegevens in in statistische software. Zorg ervoor dat de FracLac plugin is gedownload. Gebruik vervolgens het rechthoekgereedschap om de ROI te tekenen.Zorg ervoor dat de doos groot genoeg is om de hele cel te vangen en consistent kan blijven door de hele dataset heen. Selecteer in het ROI Manager-venster Update om de ROI op een willekeurig geselecteerde cel in de fotomicrograaf te vergrendelen. Open het binaire beeld met de geselecteerde cel.Dubbelklik op het Verfkwastgereedschap, stel de kleur op zwart en pas de penseelbreedte aan zoals nodig is. Gebruik de overeenkomende fotomicrograaf als referentie, gebruik de Verfkwast om aangrenzende celprocessen te verwijderen, gefragmenteerde processen te verbinden en de cel van belang te isoleren. Zodra de binaire cel is geïsoleerd, slaat u het binaire bestand op.Zet de binaire cel om naar een omtrek met behulp van de werkbalk, via Verwerking, Binair, Omtrek. Open in de werkbalk FracLac met behulp van de werkbalk door op Plug-ins, Fractal Analyse, FracLac te klikken en BC voor box counting te selecteren. In Grid Design, stel Num G in op vier.Onder Grafische opties vinkt u het metriekenvakje aan om de convexe omhulling en de begrenzingscirkel van de cel te analyseren. Wanneer u klaar bent, selecteert u Oké en selecteert u vervolgens de Scan-knop om een box counting scan uit te voeren op het geselecteerde beeld. Kopieer in het Hull en Circle Results venster alle gewenste gegevensresultaten.Doe vervolgens hetzelfde in het Box Count Summary venster. Breng de gekopieerde gegevens over naar een Excel-bestand of statistische software. Deze grafiek toont samenvattende gegevens van microglia-eindpunten per cel en verwerkte lengte per cel in ongedeerd en gewond cortexweefsel.Dit is het resultaat van de analyse met het toegepaste protocol. In beide gevallen werd statistische analyse uitgevoerd met behulp van de Students T Test en drie beelden werden geanalyseerd. Er moet voorzichtig worden omgegaan met inter-gebruikersvariabiliteit bij het toepassen van het protocol.</p

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Etienne, F. et al. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward an injected compound in brain slices. It provides an overview of preparing mouse brain slices, injecting a chemoattractant test compound, and imaging fluorescently labeled microglia to visualize their responses.

Two-Photon Microscopy for Studying Microglial Process Attraction Toward a Compound in a Mouse Brain Slice

Een manier om nieuwe inzichten te verkrijgen in de complexiteit van de inflammatoire hersenreactie wordt gepresenteerd. We beschrijven immunofluorescence-gebaseerde protocollen gevolgd door driedimensionale confocale analyse om het patroon van co-expressie van microglia/macrofaagfenotypemarkers in een muismodel van focale ischemie te onderzoeken.

Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel

Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) met een hoge capaciteit te fagocyteren of overspoelen materiaal in hun extracellulaire omgeving. Hier wordt een breed toepasbare, betrouwbaar en zeer kwantitatieve assay voor het visualiseren en meten-gemedieerde microglia afblazen van synaptische componenten beschreven.

Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Twee beeldanalyse algoritmen, "Drosophila NMJ Morfologie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" zijn gemaakt, automatisch kwantificeren negen morfologische kenmerken van de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ).

Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromusculaire Junction morfologie

Dit protocol werd ontwikkeld om tumormicro-milieukomponenten kwantitatief te identificeren bij glioblastoom-patiëntresecties onder toepassing van chromogene immunohistochemie en ImageJ.

Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.

Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen

Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.

Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen

Vroeggeboorte (bevalling &lt; 37 weken) is een urgent wereldwijd gezondheidsprobleem met suboptimale preventie- en behandelingsopties. We presenteren een muismodel van oplopende vaginale bacteriële infectie-geïnduceerde vroeggeboorte en schetsen hoe de resulterende neonatale morbiditeit en mortaliteit kunnen worden geanalyseerd.

Modellering van oplopende vaginale infectie, vroeggeboorte en neonatale morbiditeit bij muizen

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) is een gebruiksvriendelijke analysepijplijn die geen codeerexpertise vereist en semi-automatiseert single-cel microgliale morfologieanalyse op basis van immunofluorescentiebeelden. Gevalideerd in een door knaagdieren geïnduceerd neuro-inflammatiemodel, detecteert MMPS reproductief activatie-geassocieerde morfologische veranderingen en maakt gestandaardiseerde, schaalbare microgliale fenotypering mogelijk.

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Een open-source, gebruiksvriendelijke tool voor kwantitatieve microglia-morfologieanalyse

Leer microglia-morfologie kwantificeren van immunohistochemie-weefsel met ImageJ. Deze methode gebruikt skelet- en fractalanalyse voor hoogdoorvoets onderzoek naar neuro-inflammatie en celvorm.

Kwantificeren van Microglia morfologie van Photomicrographs van Immunohistochemistry bereid van weefsel met behulp van ImageJ

Meer video's verkennen