Kwantificeren van Microglia morfologie van Photomicrographs van Immunohistochemistry bereid van weefsel met behulp van ImageJ
5 juni 2018
Microglia zijn hersenen immune cellen die enquête en reageren op veranderde hersenen fysiologie via morfologische veranderingen die kwantitatief kan worden beoordeeld. Dit protocol schetst een ImageJ gebaseerd analyse protocol te vertegenwoordigen microglia morfologie als continu gegevens volgens de statistieken, zoals de restanten van de cel, complexiteit en vorm.
Het algemene doel van deze skelet- en fractalanalysemethoden is om microglia-morfologie vanuit IHC-voorbereide weefsel te meten, met behulp van kwantitatieve methoden die zowel high-throughput van aard zijn als gevoelig om kleine verschillen in celvormen te detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuro-inflammatie, door de nuances van microglia-vorm en functie tijdens gezondheid en ziekte te definiëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de microglia-morfologie kwantificeert met behulp van continue in plaats van categorische variabelen.
De hier beschreven methoden vereisen geen eigen software en kunnen worden gebruikt voor screening van hersengebieden of een cel-per-cel analyse. Het demonstreren van de procedure zal Kimberly Young zijn, een techneut uit mijn laboratorium. Zorg ervoor dat voordat u begint, de AnalayzeSkeleton plugin is gedownload naar ImageJ of Fiji.
Open vervolgens een 30 micron Z stack met Iba1 immunogeverfd hersenweefsel. Als u een fluorescentiefotomicrograaf gebruikt, zorg er dan voor dat het beeld 8-bits is en zet het om naar grijswaarden om alle positieve kleuring het beste te visualiseren. Gebruik de werkbalk en klik op Afbeelding, Lookup Tables, Grijstinten.
Als u een DAB lichtveldfoto gebruikt, gebruik dan eerst de FFT Bandpass filter plugin met de standaardinstellingen. Klik op Verwerking, FFT, Bandpass Filter en zet vervolgens om naar grijswaarden. Als het beeld te donker is om het proces van de microglia te visualiseren, gebruik de werkbalk en klik op Afbeelding, Aanpassen, Helderheid/Contrast.
Stel de minimale of maximale schuifregelaars in zoals nodig, tot aan de randen van de histogram maar niet verder. Het aanpassen van de helderheid produceert de meeste variatie in gegevensanalyse en is daarom de meest kritische stap. Voer vervolgens een Unsharp Mask filter uit om het contrast verder te verhogen door op Verwerking, Filters, Unsharp Mask te klikken.
Voer een ontspeckle stap uit om zout-en-peperruis te verwijderen die wordt gegenereerd door de Unsharp Mask. Gebruik de werkbalk en klik op Verwerking, Ruis, Ontspeckle. Zet het beeld om naar binair door Afbeelding, Aanpassen, Drempelwaarde te selecteren.
Pas vervolgens de Despeckle functie toe op het binaire beeld om eventuele resterende enkele pixel ruis te verwijderen. Pas vervolgens de Sluit functie toe door op Verwerking, Binair, Sluiten te klikken om donkere pixels te verbinden die gescheiden zijn door maximaal twee pixels. Verwijder vervolgens uitbrekers door op Verwerking, Ruis, Uitbrekers verwijderen te klikken.
Nadat u het beeld als apart bestand heeft opgeslagen voor toekomstig gebruik, skeletiseert u het beeld met behulp van de werkbalk door op Verwerking, Binair, Skeletiseren te klikken. Selecteer het skeletachtige beeld en voer de AnalyzeSkeleton plugin uit door op Plug-ins, Skelet, Skelet analyseren te klikken en het vakje takinformatie te vinken. Kopieer de gegevens uit de resultaten en takinformatie uitvoer en plak de gegevens in een Excel-spreadsheet.
In Excel, snijd de gegevens bij om skeletachtige fragmenten te verwijderen die het resultaat zijn van IHC en beeldacquisitie. Bepaal welke lengte van fragmenten uit de dataset zal worden bijgesneden door het skeletachtige beeld in ImageJ te openen en het Lijngereedschap te selecteren. Meet verschillende fragmenten, houd rekening met de gemiddelde lengte en bepaal een afsnijwaarde, die consistent moet zijn door de hele dataset.
Sorteer het Excel-spreadsheet aangepast door op Sorteren en Filteren, Aangepast sorteren te klikken. Sorteer op eindpunt voxels van groot naar klein, en op een nieuw niveau, op Mx tak PT van groot naar klein. Verwijder elke rij die twee eindpunten bevat met een maximale taklengte van minder dan de afsnijwaarde.
Tel de gegevens in de eindpuntkolom op om het totaal aantal eindpunten dat van het beeld is verzameld te berekenen. Herhaal voor takinformatiegegevens na sortering op taklengte. Nadat alle gegevens zijn bijgesneden en opgeteld, deel de gegevens van elk beeld door het aantal microglia soma's in het bijbehorende beeld.
Voer de uiteindelijke eindpunt- en celaantallen en taklengte per cel gegevens in in statistische software. Zorg ervoor dat de FracLac plugin is gedownload. Gebruik vervolgens het rechthoekgereedschap om de ROI te tekenen.
Zorg ervoor dat de doos groot genoeg is om de hele cel te vangen en consistent kan blijven door de hele dataset heen. Selecteer in het ROI Manager-venster Update om de ROI op een willekeurig geselecteerde cel in de fotomicrograaf te vergrendelen. Open het binaire beeld met de geselecteerde cel.
Dubbelklik op het Verfkwastgereedschap, stel de kleur op zwart en pas de penseelbreedte aan zoals nodig is. Gebruik de overeenkomende fotomicrograaf als referentie, gebruik de Verfkwast om aangrenzende celprocessen te verwijderen, gefragmenteerde processen te verbinden en de cel van belang te isoleren. Zodra de binaire cel is geïsoleerd, slaat u het binaire bestand op.
Zet de binaire cel om naar een omtrek met behulp van de werkbalk, via Verwerking, Binair, Omtrek. Open in de werkbalk FracLac met behulp van de werkbalk door op Plug-ins, Fractal Analyse, FracLac te klikken en BC voor box counting te selecteren. In Grid Design, stel Num G in op vier.
Onder Grafische opties vinkt u het metriekenvakje aan om de convexe omhulling en de begrenzingscirkel van de cel te analyseren. Wanneer u klaar bent, selecteert u Oké en selecteert u vervolgens de Scan-knop om een box counting scan uit te voeren op het geselecteerde beeld. Kopieer in het Hull en Circle Results venster alle gewenste gegevensresultaten.
Doe vervolgens hetzelfde in het Box Count Summary venster. Breng de gekopieerde gegevens over naar een Excel-bestand of statistische software. Deze grafiek toont samenvattende gegevens van microglia-eindpunten per cel en verwerkte lengte per cel in ongedeerd en gewond cortexweefsel.
Dit is het resultaat van de analyse met het toegepaste protocol. In beide gevallen werd statistische analyse uitgevoerd met behulp van de Students T Test en drie beelden werden geanalyseerd. Er moet voorzichtig worden omgegaan met inter-gebruikersvariabiliteit bij het toepassen van het protocol.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het kwantificeren van microglia-morfologie met behulp van ImageJ, met focus op de analyse van immunohistochemisch voorbereide hersenweefsels. De methode beoogt variaties in microgliale vorm te onderzoeken die verband houden met neuroinflammatoire aandoeningen, waarbij cruciale aspecten van microgliale functie in zowel gezondheid als ziekte worden aangepakt.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Microglia dienen als de primaire immuuncellen in de hersenen, reagerend op fysiologische veranderingen.
- Kwantitatieve analyse van microglia-morfologie kan inzicht geven in neuro-inflammatie.
- Dit protocol maakt gebruik van niet-eigendomssoftware, waardoor toegankelijkheid voor het screenen van verschillende hersengebieden wordt gegarandeerd.
- High-throughput methoden vergemakkelijken de detectie van subtiele morfologische verschillen.
Doel van het onderzoek
- Om gedetailleerde analyse van microglia-morfologie mogelijk te maken in gezonde versus zieke hersentoestanden.
- Om continue datametrieken (bijv. celaftakking) te gebruiken voor nauwkeurigere beoordelingen.
- Om belangrijke neuro-inflammatoire vragen over microgliale vorm en functie aan te pakken.
Gebruikte methoden
- De analyse wordt uitgevoerd op immunohistochemisch voorbereide hersenweefsels met behulp van ImageJ.
- Technieken zoals skeletisering en fractalanalyse worden gebruikt om microglia-morfologie te kwantificeren.
- Stappen omvatten het aanpassen van helderheid/contrast, binaire conversie en het toepassen van verschillende filters.
- Statistische analyse en data-trimming worden gedetailleerd beschreven om robuuste resultaten te garanderen.
- Aanbevelingen voor het isoleren van cellen en het analyseren van specifieke regio's van interesse (ROI's) zijn inbegrepen.
Belangrijkste resultaten
- Kwantitatieve uitkomsten omvatten eindpunten en taklengtematen per cel onder verschillende condities.
- Initiële bevindingen tonen trends in microglia-morfologie die kunnen variëren op basis van de staat van letsel.
- De analyse benadrukt de significantie van morfologische variabiliteit in microglia-functie tijdens ontsteking.
- Inter-gebruikersvarialiteit beïnvloedt de significantie van de gegevens, maar blijft consistent in trendrichting.
Conclusies
- Deze studie biedt een gedetailleerd, reproduceerbaar protocol voor het kwantitatief beoordelen van microglia-morfologie.
- Het verbetert het begrip van microglia-dynamiek in gezondheid en ziekte, met implicaties voor neuro-inflammatoir onderzoek.
- De beschreven methoden bevorderen aanpasbaarheid in analyses die zijn afgestemd op specifieke onderzoeksbehoeften.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative microglia morphology analysis using ImageJ enables objective, high-throughput assessment of neuroinflammatory states in preclinical models. This approach supports early discovery teams by providing sensitive, reproducible metrics for cellular phenotyping and mechanistic de-risking. The protocol's accessibility and scalability facilitate portfolio-wide evaluation of neuroimmune targets and disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of microglial activation and morphological phenotypes in brain tissue.
- Supports functional target validation by linking cell shape metrics to neuroinflammatory status.
- Facilitates mechanistic de-risking through objective, continuous variable outputs.
- Improves predictive confidence for neuroimmune target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated image analysis workflows for downstream compound screening.
- Standardizes morphological quantification across multiple brain regions and conditions.
- Generates reproducible, quantitative outputs for assay benchmarking and optimization.
- Enables scalable, high-throughput screening of microglial responses to perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological endpoints with disease-relevant neuroinflammatory biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative cellular readouts.
- Enhances translational confidence by enabling cross-study comparability of microglial phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized, quantitative analysis of microglia in immunohistochemistry-prepared tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in neuroinflammation research.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible image analysis for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as endpoints, branch lengths, and complexity metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects morphological data to disease-relevant biomarkers and preclinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a non-proprietary, adaptable workflow for broad application across neuroimmune research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in image-based phenotyping.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuroinflammatory programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and neuroanatomy for accurate ROI selection and data interpretation.
- Needs access to immunohistochemistry-prepared tissue and open-source ImageJ plugins (AnalyzeSkeleton, FracLac).
- Demands cross-user standardization to minimize inter-operator variability in data outputs.
- Adaptable to various brain regions and experimental models with protocol modifications as needed.
- Careful thresholding and image preprocessing are critical to ensure data quality and comparability.
