Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals hoe immuuncellen zich precies gedragen in een fysiologisch relevante context, zoals hoe doelcellen efficiënt kunnen worden gezocht in een driedimensionale omgeving. Het grote voordeel van deze methode is om een zeer dunne lichtlaag te genereren om alleen het brandpuntvlak te verlichten zonder de cellen buiten het vlak te beïnvloeden. Dit maakt een zeer hoge verwervingssnelheid mogelijk met een duidelijke vermindering van verbleking en fotocytotoxiciteit.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Renping Zhao, een post-doc uit mijn lab. Om te beginnen, breng onder een celkweekkap 400 microliter gekoelde collageen stockoplossing over naar een steriele 1,5 milliliter buis. Voeg langzaam 50 microliter gekoelde 10X PBS toe.

Meng vervolgens de oplossing door de buis voorzichtig te kantelen. Voeg 48 microliter 0,1 molaire natriumhydroxide toe aan de collageenoplossing om de pH aan te passen tot 7,2 tot 7,6. Gebruik pH-teststrips om de pH-waarde van het mengsel te bepalen.

Voeg twee microliter steriele gedistilleerde gedeïoniseerde water toe om het eindvolume op 500 microliter te brengen. Meng goed en bewaar de collageenoplossing op ijs of bij vier graden Celsius tot verder gebruik. Nadat de levende cellen volgens het tekstprotocol fluorescerend zijn gelabeld, breng onder de celkweekkap eenmaal 10 tot de zesde cellen over in een steriele 1,5 milliliter buis.

Centrifugeer de buis gedurende acht minuten bij 200 maal g. Gooi vervolgens het supernatant weg en gebruik 200 microliter kweekmedium om de pellet op te schorsen. Voeg 85,9 microliter van de geneutraliseerde collageenoplossing toe aan de celsuspensie en meng goed om een collageenconcentratie van 2,5 milligram per milliliter te bereiken.

Laat de celcollageenmix op ijs in de kap staan. Steek vervolgens een zuiger in het bijbehorende capillair tot de zuiger een millimeter uit het capillair steekt. Bevochtig vervolgens de zuiger door deze in kweekmedium te dopen.

Het overslaan van deze stap kan ongewenste introductie van luchtbellen tussen de zuiger en de collageenmatrix veroorzaken. Dompel het capillair in het cellulageenmengsel en trek de zuiger langzaam 10 tot 20 millimeter terug. Bevochtig vervolgens met een spuitfles van 70% ethanol een papieren handdoek en gebruik deze om de buitenwand van het capillair af te vegen om de resterende collageenoplossing te verwijderen.

Gebruik nu modelklei om het capillair aan de binnenwand van een vijf milliliterbuis te bevestigen. Duw de cellulageenmix naar de rand van het capillair. Bewaar vervolgens de buis met het capillair bij 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende één uur om het collageen te laten polymeriseren.

Na de incubatie voegt u een tot twee milliliter kweekmedium toe aan de buis. Dwing vervolgens voorzichtig de gepolymeriseerde collageenstaaf uit in het medium tot ongeveer de helft van het collageen in het medium hangt. Bewaar de capillair gedurende nog eens 30 minuten.

Om lichtbladmicroscopie uit te voeren, bouwt u de monsterkamer samen volgens de instructies van de fabrikant. Zet na het inschakelen van de microscoop en de incubator, indien u live-beeldvorming uitvoert, het capillair in de monsterkamer, lokaliseer het monster en vind het gebied van belang voor beeldacquisitie. Activeer de bijbehorende lasers.

Stel vervolgens het laservermogen en de belichtingstijd in. Stel ook de stapgrootte van de Z-stack in, de begin- en eindposities van de Z-stack en het tijdsinterval voor live-celbeeldvorming. Start vervolgens de beeldacquisitie.

Breng een milliliter 4% paraformaldehyde in PBS onder een chemische kap over in een vijf milliliterbuis. Dompel vervolgens het capillair met de gepolymeriseerde collageen in de paraformaldehydeoplossing en gebruik modelklei om het capillair aan de binnenwand van de buis te bevestigen. Druk voorzichtig op de zuiger totdat de helft van de collageenstaaf in de paraformaldehydeoplossing hangt.

Trek vervolgens de zuiger terug om de collageenstaaf terug in het capillair te brengen. Verwijder het capillair uit de buis en gooi de paraformaldehyde weg. Plaats het capillair in een nieuwe buis en voeg een milliliter PBS toe.

Zorg ervoor dat het capillair in de PBS is ondergedompeld. Druk voorzichtig op de zuiger totdat de helft van de collageenstaaf in de oplossing hangt en incubeer gedurende vijf minuten. Trek de zuiger terug om de collageenstaaf in het capillair op te nemen.

Vervolgens vervangt u de PBS door verse PBS en dwingt u de collageenstaaf in de oplossing. Na de derde wassing voegt u een tot twee milliliter blokkerende permeabilisatiebuffer toe aan de buis. Dwing de collageenstaaf in de oplossing en bewaar de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 60 minuten.

Vervang de blokkerende permeabilisatiebuffer door 200 tot 500 microliter primaire antilichamen in blokkerende permeabilisatiebuffer en bewaar de ondergedompelde collageenstaaf in de oplossing gedurende één uur. Nadat u PBST heeft gebruikt om de collageenstaaf drie keer te wassen, bewaar de staaf in secundaire antilichamen in blokkerende permeabilisatiebuffer bij kamertemperatuur gedurende één uur. Na nog drie wasbeurten in PBS, trek de collageenstaaf terug in het capillair en bewaar het monster in PBS tot beeldvorming.

Zoals te zien is in deze film, vormden CTL-cellen die getransfecteerd waren met een EGFP-actine-fusie-eiwit tijdens migratie citroenvormige grote uitsteeksels, omzoomd door fijne spindelvormige structuren. De trajecten van CTL's worden hier geïllustreerd met snelheid en persistentie of de verplaatsing gedeeld door de totale spoorlengte als gemeten parameters. De snelheden variëren van 0,01 tot 0,19 micrometer per seconde met een bijna 20-voudige verschil en de persistentie varieert van nul tot 0,7.

Deze figuur toont vaste CTL-cellen in 3D collageengel gekleurd voor endogene perforine-1 en actin. Het monster werd van één kant of van beide kanten