Name: Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer lichtveldmicroscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke immuuncellen in collageenmatrices. Deze methode minimaliseert fotobleking en cytotoxiciteit bij het volgen van celmigratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken het Instituut voor klinische Hemostaseology en transfusiegeneeskunde voor het verstrekken van bloed van de donor; Carmen Hässig en Cora Hoxha voor uitstekende technische hulp. Wij danken Jens Rettig (Universiteit van Saarland) voor de gewijzigde pMAX vector, Roland Wedlich-Söldner (Universiteit van Münster) voor de originele constructie van de LifeAct-Ruby en Christian Junker (Universiteit van Saarland) voor het genereren van de LifeAct-mEGFP-constructie. Dit project werd gefinancierd door Sonderforschungsbereich 1027 (project A2 BQ) en 894 (project A1 M.H.). De licht-blad Microscoop werd gefinancierd door DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Onderzoek uitgevoerd voor deze studie met de menselijk materiaal (leukocyte reductie systeem chambers van menselijk bloeddonoren) is geautoriseerd door de lokale ethische Commissie (verklaring van 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) en de desbetreffende richtsnoeren volgt.
1. bereiding van geneutraliseerde collageen-oplossing (500 µL)
<ol><li>Breng 400 µL van gekoeld collageen stockoplossing (10.4 mg/mL) tot een steriele 1,5 mL koker onder de motorkap van cel cultuur. Voeg langzaam 50 µL van 10 x PBS (pH 7.0-7.3) tot 400 µL van gekoeld collageen stockoplossing gekoeld. Meng de oplossing door zachtjes het betegelen van de buis. Opmerking: Alle stappen in deel 1 moeten gebeuren onder de motorkap van een cel cultuur.</li>
	<li>Toevoegen 8 µL van 0,1 M NaOH aan 500 µL van de collageen-oplossing van 1.1. om de pH op 7,2-7,6. Gebruik van pH test strips (pH bereik: 6-10) om te bepalen van de pH-waarde van het mengsel. Opmerking: Volumes kunnen variëren voor verschillende batches instellen van collageen. NaOH oplossing moet langzaam worden gemengd om luchtbellen te voorkomen. Het mengsel moet worden bewaard op het ijs om collageen gelering.</li>
	<li>Voeg 2 µL van steriele ddH2O aan te brengen in het eindvolume 500 µL. goed mengen en bewaren deze collageen oplossing (8.32 mg/mL) op ijs of bij 4 ° C tot verder gebruik. Opmerking: Onder deze voorwaarde, geneutraliseerde collageen kan worden gebruikt voor 24 h. Aliquots worden niet aanbevolen om te voorkomen dat luchtbellen.</li>
</ol>2. monstervoorbereiding voor licht vel fluorescentie microscopie met behulp van haarvaten
<ol><li>Fluorescently label de levende cellen van belang met de gewenste primaire fluorescente kleurstoffen15 of fluorescerende eiwitten11 zoals eerder is beschreven.</li>
	<li>Pipetteer 1 × 10-6 van cellen in een steriele 1,5 mL-buis onder de motorkap van een cel cultuur. Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 8 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL cultuurmedium. Opmerking: De celdichtheid van 5 × 106 cellen/mL wordt aanbevolen voor visualisatie van menselijk immuun cel migratie, met name voor de cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en natural killer (NK) cellen.</li>
	<li>Voeg 85,9 µL van geneutraliseerde collageen oplossing van 1.3. in de celsuspensie van 2.2. en meng goed tot een concentratie van collageen van 2,5 mg/mL. Laat de cel/collageen mix op ijs in de kap. Opmerking: Stel de gewenste concentratie van collageen is N mg/mL, de hoeveelheid geneutraliseerd collageen oplossing (voor 200 µL celsuspensie) = 200 × N /(8.32-N)</li>
	<li>Vervolgens zet de bijpassende zuiger in het capillair (binnendiameter ~ 1 mm) totdat de plunjer 1 mm uit het capillair is. Natte de plunjer door dompelen in kweekmedium (figuur 1A). Opmerking: Deze stap kan helpen om luchtbellen te voorkomen dat wanneer het capillair wordt ondergedompeld in de cel/collageen mix. Het capillair en de plunjer hoeft niet te worden steriel.</li>
	<li>Dompel het capillair in de cel/collageen mix van 2.3. Langzaam Trek de zuiger terug voor 10-20 mm (figuur 1B). Veeg de buitenmuur van het capillair met een papieren handdoek bevochtigd met 70% ethanol spray te verwijderen van de resterende collageen-oplossing.</li>
	<li>Monteren van het capillair met modelleren van klei op de binnenwand van een tube van 5 mL en duwen de cel/collageen mix aan de rand van het capillair (Figuur 1 c).</li>
	<li>Houd het capillair bij 37 ° C met 5% CO2 voor 1 h voor collageen polymerisatie.</li>
	<li>Het kweekmedium (ongeveer 1-2 mL) toevoegen aan een tube van 5 mL. Zorgvuldig de gepolymeriseerde collageen staaf uit in het medium voor ongeveer 3/4 van de collageen opknoping in het medium (Figuur 1 d) drukken.</li>
	<li>Houd het capillair, als dit, bij 37 ° C met 5% CO2 voor een andere 30 min aan de staaf van de collageen met het medium equilibreer. Opmerking: Nadien de collageen staaf kan worden trok zich terug in de capillaire en gekweekte verdere voor verder gebruik.</li>
</ol>3. image Acquisition met behulp van licht vel microscopie
<ol><li>Vergadering de monsterkamer volgens de instructie van de fabrikant.</li>
	<li>Zet de incubatie en de Microscoop om te Verwarm de monsterkamer tot 37 ° C (voor levende cellen beeldvormende alleen).</li>
	<li>Plaats het capillair in de monsterkamer en zoek het monster om te zoeken naar het terrein van belang voor Beeldacquisitie.</li>
	<li>Activeer de overeenkomstige laser. De volgende instellingen: laser macht, belichtingstijd, stap-grootte van z-stack, begin- en positie van de z-stack, en het tijdsinterval voor de levende cel imaging. Opmerking: bijvoorbeeld, was het monster in Figuur 2 beeld elke 40 s voor 6 uur bij 37 ° C met een stap grootte van 1 µm (total dikte: 538 µm). De laser-macht was 1% met een belichtingstijd van 30 ms. de pixelgrootte op x-y-richting is 0,23 µm.</li>
	<li>Start de Beeldacquisitie.</li>
</ol>4. geautomatiseerde analyse bijhouden
<ol><li>Open de file converter, klikt u op Bestanden toevoegen om te kiezen van de grafische bestanden worden geconverteerd naar de bestandsindeling van de software (*.ims). Klik op Bladeren en selecteer een map waar de geconverteerde bestanden opgeslagen. Klik op Start alle.</li>
	<li>Open de analysesoftware. Klik op overtreffen. Ga naar bestand en klik op openen, kies dan het imaging bestand dat moet worden geanalyseerd. Opmerking: Als de bestandsgrootte groot is deze stap kan duren. Bestanden groter dan 1 Terabyte (TB) worden niet aanbevolen voor een enkele experiment als het proces dergelijke grote bestanden zijn zeer computationele capaciteit eisen.</li>
	<li>Klik op toevoegen nieuwe Spots. Vink het selectievakje Proces hele afbeelding ten slotte. Klik op volgende.</li>
	<li>Geef de coördinaten van x en y (in pixel) definiëren de regio van belang. Voer het aantal frames (tijd en z-positie) om te analyseren. Klik op volgende.</li>
	<li>Selecteer het doelkanaal, waarin de objecten worden bijgehouden, in de Dropdown lijst met Bronkanaal. Invullen geschat xy Diameter (µm). Klik op volgende. Opmerking: De diameter van de geschatte xy is de gemiddelde diameter in de x-en y-dimensie van objecten worden bijgehouden.</li>
	<li>Klik op de kwaliteit. Stel een drempel, waarin de meeste van de cellen (objecten) opgenomen worden moeten. Klik op volgende.</li>
	<li>Kies de gewenste algoritme (Autoregressieve beweging wordt aanbevolen). Voer de max afstand (20 µm wordt aanbevolen) en de max grootte (3 of 2 wordt aanbevolen). Klik op proces hele afbeelding ten slotte. Opmerking: Max afstand en Max grootte zijn twee drempels te breken tracks. Meer in het bijzonder, in twee continue frames wordt wanneer de afstand tussen hetzelfde object groter is dan de Max afstand, dit object in het latere frame beschouwd als een nieuw object. Soms tijdens overname, kan hetzelfde object verdwijnen voor een paar frames en tonen weer. In dit geval, alleen wanneer dit object verschijnt opnieuw binnen de grootte van de gap Max, zal het worden beschouwd als hetzelfde object.</li>
	<li>Klik op Filter Type en kies de optie om uit te sluiten van ongewenste sporen. Opmerking: Deze stap is optioneel.</li>
	<li>Klik op volgende en klik vervolgens op Voltooien. Opmerking: Deze stap kan duren uren tot dagen afhankelijk van computerprestaties.</li>
	<li>Klik op Nummers bewerken en kies Juiste Drift. Selecteer het juiste algoritme (Translationeel Drift wordt aanbevolen). Selecteer de gewenste Resultaat Dataset grootte (Nieuwe grootte gelijk aan huidige grootte wordt aanbevolen). Klik op OK. Opmerking: Deze stap is alleen nodig wanneer de collageen dreef tijdens Beeldacquisitie.</li>
	<li>Klik op Statistieken en kies Configureren van zichtbare statistieken lijstwaarden. Controleer de opties van belang om te worden uitgevoerd (bijvoorbeeld coördinaten, snelheid, enzovoort). Klik op OK.</li>
	<li>Klik op Alle statistieken exporteren naar bestand en geef de bestandsnaam.</li>
</ol>5. fixatie en immunofluorescentie kleuring van cellen in collageen Matrices
<ol><li>Pipetteer 1.000 µL van 4% paraformaldehyde (PFA, in PBS) in een tube van 5 mL onder een chemische motorkap. Opmerking: PFA moet worden afgewogen op kamertemperatuur.</li>
	<li>Dompel het capillair met gepolymeriseerde collageen van 2.9. in PFA oplossing (voor ~ 5 mm) en bevestig het capillair op de binnenwand van de tube van 5 mL met modelleren van klei (zoals weergegeven in Figuur 1 c).</li>
	<li>Druk zachtjes op de plunjer totdat de helft van de collageen-staaf is opknoping in de PFA-oplossing (Figuur 1 d). Houd de buis bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Het terugtrekken van de plunjer om de staaf van de collageen binnen het capillair. Neem het capillair en PFA negeren.</li>
	<li>Mount het capillair in een verse buis en voeg 1 mL PBS. Zorg ervoor dat het capillair is ondergedompeld in de PBS.</li>
	<li>Druk zachtjes op de plunjer totdat de helft van de collageen-staaf is opknoping in de oplossing. Monteer het capillair op de binnenmuur met modelleren van klei.</li>
	<li>Houd de buis bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Herhaal 5.4. -5.7 voor een ander 2 keer.</li>
	<li>Het terugtrekken van de plunjer om de staaf van de collageen binnen het capillair. Gooi PBS. Pipetteer blokkeren/permeabilization buffer (1-% BSA, PBS + 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) 1-2 mL in de tube en herhaal 5.6. Opmerking: De BSA (1%) kan worden vervangen door 5% serum van het dier dat de secundaire Ab groeide op in.</li>
	<li>Houd de buis bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten.</li>
	<li>Het terugtrekken van de plunjer om de staaf van de collageen binnen het capillair. Gooi de buffer permeabilization. Breng 200-500 µL van het primaire antilichaam in blokkeren/permeabilization buffer en verdrijft de staaf in de oplossing.</li>
	<li>Houd de buis bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
	<li>Wassen van de staaf van de collageen 3 keer met PBST (PBS + 0,1 - procent niet-ionogene oppervlakteactieve stof) zoals beschreven in 5.4. -5,8.</li>
	<li>Incubeer de staaf in secundair antilichaam in blokkeren/permeabilization buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Houden van licht.</li>
	<li>De staaf van de collageen 3 keer met PBS wassen zoals beschreven in 5.4. -5,8.</li>
	<li>Het terugtrekken van de plunjer om de staaf van de collageen binnen het capillair. Houd de monsters in PBS tot imaging.</li>
	<li>Scan de monsters zoals beschreven in 3.</li>
</ol>

<ol><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro%3F+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).</li>
<li>Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensions+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimensions in cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).</li>
<li>Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+migration%2C+search+strategies+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell migration, search strategies and mechanisms.</a> Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).</li>
<li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+methods+of+human+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis methods of human cell migration.</a> Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).</li>
<li>Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+cell+survival+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a cell survival factor.</a> Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Fang, Y., Eglen, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Cultures+in+Drug+Discovery+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development.</a> SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).</li>
<li>Schoppmeyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+profilin+1+is+a+negative+regulator+of+CTL+mediated+cell-killing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration.</a> Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).</li>
<li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+driven+by+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+cells+enhance+NK+cytotoxic+efficiency+by+reducing+search+time%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time.</a> Sci Rep. 7, 44357(2017).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+leading+edge+of+three-dimensional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">At the leading edge of three-dimensional cell migration.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer).</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).</li>
<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), e59689(2013).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).</li>
<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Verveer, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+large+specimens+with+light+sheet-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy.</a> Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen financiële of commerciële belangenconflict.

Meeste in vitro tests worden uitgevoerd op een 2D oppervlak, bijvoorbeeld in celkweek platen, petrischalen of op coverslips, terwijl in vivo cellen, met name de immuuncellen, meestal een 3D communicatie ervaren. Opkomende bewijs toont aan dat migratiepatronen van immune cellen tussen 2D en 3D scenario's17 verschillen. Bovendien zijn de expressieprofielen van tumorcellen ook verschillend in 2D - en 3D-gekweekte weefsels18,19</su...

Meeste kennis over het migreren van cellen afkomstig van 2D experimenten1,2,3, die normaal gesproken worden uitgevoerd in een glas of plastic oppervlak voor een cultuur/imaging schotel. Een fysiologische scenario vereist echter, in de meeste gevallen een 3D communicatie, die de extracellulaire matrix (ECM) een beslissende rol speelt. ECM biedt niet alleen de 3D structuur essentieel belang zijn voor het handhaven van de juiste cel morfologie maar biedt ook overleving signalen of directionele signalen voor een optimale werking van veel cellen4,5 . Daarom moet een 3D-omgeving beter identificeren cellulaire functies en het gedrag in een omgeving die beter als gevolg van de fysiologische context.
In het menselijk lichaam oefenen de meeste cellen vooral immune cellen, hun functies in een 3D-scenario. Bijvoorbeeld, geactiveerde T-cellen patrouille op zoek naar doelcellen weefsels, naïef T cellen migreren door lymfklieren in zoektocht naar hun cognaat antigeen-presenteren cellen waarin de migratiemodus en machines aangepast aan de overeenkomstige extracellulaire zijn milieu3,6,7. De 3D collageen gel is wijd verbeid gebruikt als een gevestigde en goed gekarakteriseerd 3D cel cultuur systeem8,9,10. Onze vorige werk blijkt dat primaire menselijke lymfocyten uiterst mobiel zijn en op een gemiddelde snelheid van ongeveer 4,8 µm/min bij een 0,25% collageen gebaseerde matrix11migreren. Omlegging van cytoskelet speelt een sleutelrol in de cel migratie12. Het vergaren van bewijsmateriaal blijkt dat lymfocyten geldt niet slechts een enkele soort migratie nog kunnen schakelen tussen bepaalde migratie gedrag afhankelijk van de locatie, de communicatie, de cytokines, de Chemotactische hellingen, en extracellulaire welke melodie signalen de trekgedrag in verschillende manieren 3.
Om betrouwbaar te analyseren immuun cel functies en gedrag, bijvoorbeeld migratie, uitsteeksel vorming of vesiculaire vervoer, is het van groot voordeel te kunnen verwerven in relatief grote volumes van de 3D beelden op een snelle en betrouwbare manier. Voor 3D-beeldbewerking biedt de technologie van de onlangs ontwikkelde licht vel microscopie (ook enkel vliegtuig verlichting microscopie genoemd) een bevredigende oplossing13,14. Tijdens het imaging overname, is een dunne statisch licht blad gegenereerd om te verlichten van het monster. Op deze manier, op het vlak van de focus, kan een groot gebied gelijktijdig zonder de cellen uit het vliegtuig worden verlicht. Deze eigenschap laat een hoge acquisitie snelheid met een drastisch verminderde bleken en fototoxiciteit. In dit artikel beschrijven we hoe te visualiseren van primaire menselijke immune cellen met behulp van licht vel microscopie en hoe te analyseren van de migratie in een 3D-scenario.

<table><tbody><tr><td>Fibricol, bovine collagen solution</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>&nbsp;#5133-20ML</td><td>Collageen matrix</td></tr><tr><td>0.5 M NaOH Solution</td><td>Merck</td><td>1091381000</td><td>voor het neutraliseren van Fibricol-oplossing</td></tr><tr><td>Ultra-Low melting agarose</td><td>Affymetrix</td><td>32821-10GM</td><td>Sample bereiding in low c[Col]</td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>11348D</td><td>Isolatie van primaire humane CD8+ T-cellen uit PBMC</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 voor T-cel expansie en activering</td><td>Thermo Fisher</td><td>11132D</td><td>Activering van CTL-populaties</td></tr><tr><td>Human recombinant interleukin-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC0023</td><td>Stimulatie van gekweekte CTL</td></tr><tr><td>P3 Primary solution kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-30XX</td><td>Transfectie</td></tr><tr><td>&alpha;-PFN1 antilichaam, konijn, IgG</td><td>Abcam</td><td>ab124904</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22284</td><td>IF</td></tr><tr><td>CellMask Orange Plasma membraan Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10045</td><td>Fluorescente cellabel</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-250mL</td><td>IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Eurobio</td><td>018774</td><td>IF</td></tr><tr><td>DPBS Dulbecco's phosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td>IF</td></tr><tr><td>Rund serum albumine</td><td>Sigma</td><td>A9418-100G</td><td>IF</td></tr><tr><td>Geit &alpha; Konijn 568, IgG, konijn</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11011</td><td>IF</td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 (Lichtblad microscopie)</td><td>Zeiss</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur kap</td><td>Thermo Fisher</td><td>HeraSafe KS</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur incubator HERACell 150i&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5418 en 5452</td><td>Eppendorf</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpunten</td><td>VWR</td><td>89079-444, 89079-436, 89079-452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>15 mL buisjes</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp;62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Kapillairen 50 &micro;L</td><td>VWR (Merk)</td><td>613-3373</td><td>Zeiss LSFM monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Zuiger voor capillairen</td><td>VWR (Merk)</td><td>BRND701934</td><td>"Stempels met teflon tip" LSFM monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>MColorPhast pH stips</td><td>Merck</td><td>1095430001</td><td>om de pH van geneutraliseerd Fibricol te testen</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1mL spuiten</td><td>BD</td><td>Z230723&nbsp;ALDRICH</td><td>Alternatieve monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Modelklei (Hasbro Play-Doh A5417EU7)</td><td>Play-Doh</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Imaris bestands converter</td><td>Bitplane</td><td>beschikbaar op http://www.bitplane.com&nbsp;</td><td>Beeldbestanden omzetten naar Imaris bestandsformaat</td></tr><tr><td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td><td>Bitplane</td><td>beschikbaar op http://www.bitplane.com&nbsp;</td><td>Analyse van 3D en 4D beeldgegevens</td></tr></tbody></table>

licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke immune cellen

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activering, proliferatie en functie van alle immuuncellen optreden in een driedimensionale (3D) omgeving, bijvoorbeeld in de lymfeklieren of weefsels. Up to date afhankelijk meeste in vitro systemen van tweedimensionale (2D) oppervlakken, bijvoorbeeld cel-cultuur platen of coverslips. Optimaal mimic fysiologische omstandigheden in vitrogebruiken we een eenvoudige 3D collageen-matrix. Collageen is een van de belangrijkste componenten van de extracellulaire matrix (ECM) en is wijd verbeid gebruikt voor het vormen van 3D-matrices. Voor 3D-beeldbewerking, wordt de technologie van de onlangs ontwikkelde licht vel microscopie (ook enkel vliegtuig verlichting microscopie genoemd) gekenmerkt met de overname van de hoge snelheid, grote indringingsdiepte, lage bleken en fototoxiciteit. Licht vel microscopie is bovendien bijzonder voordelige voor lange termijn meting. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol hoe te zetten en behandelen van menselijke immune cellen, bijvoorbeeld primaire menselijke cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en natural killer (NK) cellen in de matrix van de 3D collageen voor gebruik met de licht-blad microscopie voor levende cellen beeldvorming en vaste monsters. De procedure voor Beeldacquisitie en analyse van cel migratie worden gepresenteerd. Een bijzondere aandacht is besteed aan het wijzen op kritische stappen en factoren voor de bereiding van de monsters en data-analyse. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in een matrix van 3D collageen en is niet beperkt tot immune cellen.

Uitsteeksel formatie tijdens T-cel migratie is een uiterst dynamisch proces, dat actine afhankelijk is. Om te visualiseren uitsteeksel vorming van primaire menselijke CTL, transfected we Transient een mEGFP gesmolten eiwit om het cytoskelet actine in CTL zoals beschreven voor11van een label. Een dag na de transfectie, werden de cellen ingesloten in de collageen-matrix. Afbeeldingsstapels werden verworven elke 40 s met een stap grootte van 1 µm bij 37 ° C met behulp...

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van immune cellen die zijn ingesloten in een matrix van de driedimensionale (3D) collageen met behulp van licht vel microscopie. Dit protocol wordt ook ingegaan hoe bijhouden van cel migratie in 3D. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in de 3D-matrix.

Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals hoe immuuncellen zich precies gedragen in een fysiologisch relevante context, zoals hoe doelcellen efficiënt kunnen worden gezocht in een driedimensionale omgeving. Het grote voordeel van deze methode is om een zeer dunne lichtlaag te genereren om alleen het brandpuntvlak te verlichten zonder de cellen buiten het vlak te beïnvloeden. Dit maakt een zeer hoge verwervingssnelheid mogelijk met een duidelijke vermindering van verbleking en fotocytotoxiciteit.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Renping Zhao, een post-doc uit mijn lab. Om te beginnen, breng onder een celkweekkap 400 microliter gekoelde collageen stockoplossing over naar een steriele 1,5 milliliter buis. Voeg langzaam 50 microliter gekoelde 10X PBS toe.Meng vervolgens de oplossing door de buis voorzichtig te kantelen. Voeg 48 microliter 0,1 molaire natriumhydroxide toe aan de collageenoplossing om de pH aan te passen tot 7,2 tot 7,6. Gebruik pH-teststrips om de pH-waarde van het mengsel te bepalen.Voeg twee microliter steriele gedistilleerde gedeïoniseerde water toe om het eindvolume op 500 microliter te b

light-sheet-microscopy-for-three-dimensional-visualization-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we describe the lattice light-sheet microscopy technique to visualize interactions between live T-cells and antigen-presenting cells. The method involves focusing an ultrathin lattice light sheet on an interacting cell pair to obtain a series of two-dimensional images, which are combined to obtain high-resolution four-dimensional images that reveal the spatiotemporal dynamics of the cell-cell interaction.

Lattice Light Sheet Microscopy to Visualize Receptor-Ligand Interactions in Live Cells

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Dit protocol beschrijft de installatie van een lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's.

Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor<em&gt; In Toto</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt; Ontwikkeling

Een module voor enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) beschreven die gemakkelijk wordt aangepast om een ​​omgekeerde wide-field microscoop en geoptimaliseerd voor 3-dimensionale celculturen. Het monster is gelegen in een rechthoekige capillaire en via een microfluïdische systeem fluorescente kleurstoffen kunnen farmaceutische middelen of geneesmiddelen in kleine hoeveelheden worden toegepast.

Single Plane Verlichting Module en Micro-capillaire Aanpak voor een Wide-field microscoop

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.

Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Dit protocol beschrijft in detail hoe een fluorescentiemicroscoop met één objectief en lichtvel kan worden gebouwd en hoe deze kan worden gebruikt voor het visualiseren van cytoskeletnetwerken.

Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken

Leer lichtveldmicroscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke immuuncellen in collageenmatrices. Deze methode minimaliseert fotobleking en cytotoxiciteit bij het volgen van celmigratie.

Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

Meer video's verkennen