Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie
8 juni 2018
Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het DNA-reparatiegebied, zoals hoe de vorming, lokalisatie en oplossing van DNA-reparatiecomplexen worden gereguleerd. Het grote voordeel van deze techniek is dat het ondubbelzinnig veranderingen kan detecteren en de lokalisatie en kinetiek van het reparatiecomplex. Naast deze onderzoekers op bachelorniveau in mijn lab, zullen drie afgestudeerde studenten de experimenten uitvoeren.
Dat zullen Changkun Hu, Dalton Dacus en Stephen Walterhouse zijn. Om te beginnen, kweek U2OS/DR-GFP-cellen op een 10 centimeter weefselkweekplaat tot ze 85 tot 90%confluent zijn. Verwijder vervolgens het medium, voeg drie milliliter EDTA toe en incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende drie minuten.
Vervang de EDTA door een milliliter trypsine en incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens vijf milliliter DMEM toe om de trypsine te neutraliseren. Na het tellen van de cellen, zaai zes maal 10 tot de derde cellen per put in 200 microliter medium in een 96-well plaat met glazen bodem.
Alternatief, zaai vier maal 10 tot de zes putten in acht milliliter medium op 12 millimeter dekglasjes geplaatst in een 10 centimeter plaat, vervolgens de cellen over nacht kweken bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Om dubbele strengbreuken, of DSB's, te induceren, vervang het medium door waterstofperoxide verdund tot een concentratie van 25 micromolair met DMEM plus 10%FBS en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Was de cellen drie keer met 1x PBS, voeg vervolgens vers DMEM toe.
Om de cellen na incubatie te fixeren, gebruik PBS om de plaat drie keer te wassen. Gebruik vervolgens een naald en pincetten om voorzichtig een dekglas te verwijderen uit de 10 centimeter plaat voor elk tijdstip en plaats het in een enkele put van een 24-well plaat. Voeg 4%PFA toe en incubeer de cellen gedurende 15 minuten.
Gebruik vervolgens PBS om de dekglasjes drie keer te wassen. Om de cellen te permeabiliseren, voeg 0,5%niet-ionische detergent en PBS toe. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
Was vervolgens de cellen opnieuw drie keer met PBS. Voeg vervolgens 3%BSA en 0,1%niet-ionische detergent verdund in PBS toe aan de dekglasjes in een 24-well plaat en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende een uur. Voeg vervolgens primaire antilichamen toe die het reparatie-eiwit van belang targeten en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende een uur.
Na het wassen van de cellen met PBS drie keer, voeg DAPI toe en incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Incubeer vervolgens de monsters met secundaire antilichamen. Na het wassen van de cellen zoals eerder, gebruik montagereagens om de dekglasjes cellaas omlaag op dia's te monteren.
Druk voorzichtig op de dekglasjes en gebruik een doek om eventueel overtollig montagereagens op te nemen. Verzegel de dekglasjes met sneldrogende transparante nagellak en zorg voor een volledige verzegeling van het dekglas met de dia. Neem confocale microscoopbeelden door te focussen op het DAPI-kanaal.
Om de kernen in immunofluorescentiebeelden te definiëren, open de confocale beelden door het beeldbestand te slepen naar het ImageJ-venster of door bio-formats importer te selecteren uit de plugin-werkbalk in ImageJ. Selecteer vervolgens split channels. Selecteer onder kleuropties colorized uit het vervolgkeuzemenu.
Selecteer OK om de DAPI- en histon H2AX-afbeeldingen als afzonderlijke vensters te openen en kies de DAPI-afbeelding. Selecteer vervolgens de afbeeldingswerkbalk in de optie drempelwaarde aanpassen om de kernen te selecteren. Pas vervolgens de beelddrempelwaarde aan door de onderste balk van het drempelvenster volledig naar rechts te schuiven.
Pas de bovenste balk aan totdat de kernen volledig rood verschijnen met duidelijke contouren en de achtergrond zwart is. Selecteer vervolgens de analysewerkbalk en de optie analyse deeltjes. Voer de minimale grootte van de kern in.
Selecteer uit het vervolgkeuzemenu tonen de contouren en selecteer vervolgens de optie toevoegen aan manager. Klik op OK om een ROI-managervenster te openen. Vanuit het ROI-managervenster wijs nummers toe aan de kernen door selectie.
Om ImageJ te gebruiken om H2AX-foci en immunofluorescentiemicroscoopbeelden te kwantificeren, selecteer het H2AX-foci-venster. Selecteer vervolgens de proceswerkbalk en kies maxima zoeken om foci binnen de kernen te vinden. Kies uit het vervolgkeuzemenu outputtype de optie enkele punten en selecteer het voorbeeldpuntselectie om de maxima-foci te visualiseren.
Voer vervolgens een ruistolerantiewaarde in afhankelijk van de fluorescentie-intensiteit van de afbeelding. Selecteer uit het ROI-managervenster de kernen waarvoor H2AX-foci moeten worden gekwantificeerd. Selecteer meten om het aantal maxima-foci binnen de geselecteerde kernen te meten.
Kopieer de ruwe intensiteitswaarden en plak ze in software voor gegevensanalyse. Nadat de cellen op 96-well platen met dekglasjes zijn gezet zoals eerder in deze video is gedemonstreerd, induceer dubbele strengbreuken door een op lipiden gebaseerd transfectiemiddel te gebruiken om cellen te transfecteren met de I-SceI-expressievector. Om beeld te verkrijgen na het wassen van vix gepermeabiliseerde en geblokkeerde cellen zoals eerder getoond, voeg antilichamen toe tegen gamma H2AX en het reparatie-eiwit van belang.
Was met 1x PBS de 96-well plaat dekglasjes drie keer. Incubeer vervolgens de 96-well plaat dekglasjes met secundaire antilichamen. Tel tenslotte, na het identificeren van de cellen die een grote nucleaire gamma H2AX-focus hebben, handmatig diegene die ook co-lokalisatie met het reparatie-eiwit van belang vertonen.
Deze figuur toont een ruisdiscriminatie van 90 en markeert het juiste aantal foci. Kernen aan de rand en foci buiten de kernen worden niet geteld tijdens de kwantificering. Het hier getoonde paneel toont een lage ruis
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt het dynamische proces van herstel van dubbelstrengs DNA-breuken, met een focus op de vorming en resolutie van herstelcomplexen. Met behulp van immunofluorescentiemicroscopie beoogt het onderzoek de mechanismen te verduidelijken die betrokken zijn bij het behoud van het genoom.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- DNA-reparatiemechanismen
- Genoomonderhoud
- Immunofluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Dubbelstrengs DNA-breuken zijn kritieke laesies die nauwkeurige herstelmechanismen vereisen.
- Inzicht in de dynamiek van de vorming van herstelcomplexen is essentieel voor kennis over genomische stabiliteit.
- Deze studie maakt gebruik van geavanceerde beeldvormingstechnieken om DNA-herstelprocessen te analyseren.
- Voorgaand onderzoek heeft het belang benadrukt van de lokalisatie en resolutie van complexen bij DNA-herstel.
Doel van de studie
- Om te onderzoeken hoe de vorming en lokalisatie van DNA-reparatiecomplexen worden gereguleerd.
- Om de kinetiek van de resolutie van reparatiecomplexen na DNA-schade te beoordelen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van DNA-reparatiedynamiek.
Gebruikte methoden
- Immunofluorescentiemicroscopie voor het visualiseren van DNA-breuken.
- Gebruik van U2OS/DR-GFP-cellen voor experimentele analyse.
- Celkweektechnieken om monsters voor beeldvorming voor te bereiden.
- Samenwerking met bachelor- en masterstudenten voor uitgebreide gegevensverzameling.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van sleutelfactoren die de dynamiek van reparatiecomplexen beïnvloeden.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het volgen van reparatieprocessen.
- Inzichten in de regulatiemechanismen van DNA-reparatie.
- Bewijs dat de rol van de lokalisatie van complexen bij het behoud van het genoom ondersteunt.
Conclusies
- De studie biedt waardevolle inzichten in de dynamiek van DNA-herstel.
- Immunofluorescentiemicroscopie is een krachtig instrument voor het bestuderen van DNA-schaderesponsen.
- Het begrijpen van deze mechanismen kan toekomstig onderzoek naar genoomstabiliteit informeren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het karakteriseren van de DNA-reparatiekinetiek en proteinlokalisatie bij transiënte en persistente dubbelstrengsbreuken maakt een mechanische risicobeoordeling van targets voor genoomstabiliteit mogelijk. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie door het onderscheid te maken tussen werkelijke rekrutering van reparatiefactoren en artefacten door mislokalisatie, waardoor het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase wordt verbeterd. Het informeert de portfoliotriage door te verduidelijken of een eiwit de vorming, stabilisatie of resolutie van complexen bij DNA-laesies bevordert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door vast te stellen of een eiwit van belang de lokalisatie, vorming of resolutie van herstelcomplexen bevordert.
- Operationele waarde: Maakt onderscheid mogelijk tussen vertraagde rekrutering en mislokalisatie van herstelfactoren met behulp van langdurige DSB-modellen.
- Predictieve waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door onthullen of een target de dynamiek van het herstelcomplex beïnvloedt in plaats van enkel te correleren met toxiciteit.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Levert kwantificeerbare resultaten van nucleaire foci via immunofluorescentiemicroscopie voor high-content screening van de dynamiek van reparatie-eiwitten.
- Reproduceerbaarheid: Standardiseert de inductie van DSB met behulp van I-SceI-expressie of behandeling met waterstofperoxide om consistente transiënte of persistente laesies te genereren.
- Schaalbaarheid: Aanpasbaar aan 96-wellplate-formaten met glazen dekglasbodems voor geautomatiseerde beeldvorming en foci-kwantificering op basis van ROI.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Legt een verband met fenotypes van genoominstabiliteit die relevant zijn in de oncologie en bij modellen voor erfelijke ziekten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen targetvalidatie in de ontdekkingsfase en preklinische beoordeling van de herstelcapaciteit.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert de criteria voor verdere ontwikkeling door de herstelkinetiek en de colocalisatie van eiwitten met gamma H2AX-foci te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door functionele validatie van DNA-reparatiedoelen te bieden voorafgaand aan de optimalisatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Test hypothesen over de rollen van eiwitten bij de assemblage, assemblage-afbraak of kinetiek van DSB-reparatiecomplexen.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve foci-tellingen per kern om condities te vergelijken bij genetische of farmacologische perturbaties.
- Analytica: Levert meetbare parameters op, waaronder het aantal foci, de grootte, de intensiteit en de colocalisatiefrequentie voor statistische vergelijking.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door de dynamiek van reparatie-eiwitten te koppelen aan uitkomsten van genomische stabiliteit.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imageplatform voor iteratieve targetvalidatie over meerdere DNA-schaderesponspaden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door mechanistische ambiguïteit in de functie van herstelfactoren op te lossen.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-gegevens die aanpasbaar zijn aan multi-well formats en geautomatiseerde analyse.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen door functionele deelname aan herstel te onderscheiden van indirecte toxiciteitssignalen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van de directe invloed op de kinetiek en getrouwheid van het herstelcomplex.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentie-microscopie, beeldanalyse (bijv. ImageJ) en methoden voor DSB-inductie.
- Afhankelijk van confocale beeldvormingsinfrastructuur en reagentia voor fixatie, permeabilisatie, blokkering en antilichaamkleuring.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor consistente DSB-inductie, fixatietiming en parameters voor de kwantificering van foci.
- Moet rekening houden met cellijn-specifieke verschillen in reparatiecapaciteit en transfectie-efficiëntie bij het aanpassen van de assay.
- Beperkt door de noodzaak om antilichaamspecificiteit te valideren en instellingen voor ruistolerantie te optimaliseren voor accurate detectie van foci.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:40
Defining the Kinetics of DSB Repair Complex Formation
3:38
Defining Nuclei in Immunofluorescence Images
5:44
Analyzing Localization to a Long-lasting Double-strand DNA Break
6:40
Results: Co-localization of Double-strand DNA Breaks and Repair Proteins by Immunofluorescence Microscopy
7:46
Conclusion
