Name: Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer de gedrukte glycaan-array-techniek voor gevoelige analyse van circulerende anti-koolhydraat-antilichamen in kleine dieren. Deze methode meet honderden glycaandoelen tegelijk met minimale samplevolume.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) verlenen PI13/01098 van Carlos III Health Institute, Spaanse ministerie van volksgezondheid. DB-G werd geprofiteerd van een positie van de post-doctoraal onderzoek gefinancierd door de Europese Unie zevende kaderprogramma (KP7/2007-2013) onder de Grant overeenkomst 603049 (TRANSLINK). Werk van NK, NS, en NB werd gesteund door toekenning #14-50-00131 van Russische Science Foundation. DB-G wil zijn dank betuigen aan Marta Broto, J. Pablo Salvador en Ana Sanchis voor uitstekende technische bijstand en Alexander Rakitko voor hulp bij de statistische analyse. Met de steun van de "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats ik Recerca del Departament d'Empresa ik Coneixement de la Generalitat de Catalunya (verlenen van nummer 2018 DI 021). Wij danken CERCA programma / Generalitat de Catalunya voor institutionele ondersteuning.

1. Glycochips productie
<ol><li>
Microarray voorbereiding
	<ol>
<li>Print de glycanen (50 mM) en polysacchariden (10 µg/mL) in 300 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 8,5) op 6 op glas N-hydroxysuccinimide-derivatized-dia's repliceert, gebruik van contactloze robotachtige arrayer (drop volume ~ 900 pL). Elke dia bevat 4 verschillende blokken van sub arrays (figuur 1A, in kleuren) 6 keer herhaald. Elke één sub array wordt gevormd door 112 verschillende glycan vlekken, met inbegrip van controles (8 rijen × 14 kolommen breed) (figuur 1B). Opmerking: Glycan-gerelateerde informatie wordt verstrekt in de aanvullende tabel 1. De bibliotheek van de glycan die wordt gebruikt voor afdrukken microchips is het resultaat van een lange termijn synthetische inspanning van het team van IBCh; voorbeelden van synthese worden beschreven in Verwante publicaties29,30,31,32,33,34,35,36 3837, ,. De glycan bibliotheek opgenomen bloedgroep-antigenen en enkele van de meest vaak voorkomende terminal oligosacchariden, evenals kern motieven van zoogdieren N en O-alternerende glycoproteïnen en glycolipiden, koolhydraten tumor-geassocieerde antigenen, en polysacchariden van pathogene bacteriën.</li>
		<li>Incubeer de dia's in vocht vak (relatieve vochtigheid ~ 70%) bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 1 uur.</li>
		<li>Blokkeren van microarrays: Incubeer de dia's gedurende 1,5 uur met een blokkeerbuffer bij kamertemperatuur (boorzuur van 100 mM, 25 mM ethanolamine, 0,2% (v/v) Tween-20 in ultrazuiver water).</li>
		<li>De glycochip met ultrazuiver water wassen en droog het door de lucht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De controle van de kwaliteit van de Glycochip
	<ol>
<li>Analyseren van twee microarrays van elke partij met 1mg/mL oplossing van complexe immunoglobulin voorbereiding (CIP, met IgA, IgG en IgM), 10 µg/mL oplossing van biotinyleerd geit anti-menselijke immunoglobulinen als een secundair antilichaam (IgM IgG + IgA), gevolgd door 1 µg/mL oplossing van de overeenkomstige fluorescerende streptavidine geconjugeerde (via het protocol die hieronder worden beschreven, zie stap 2).</li>
		<li>Scannen en analyseren van de glycochips (zie stap 3, analyse van glycan matrix).</li>
		<li>Gebruiken microarray batches met intra - en intersite - chip correlatie hoger dan 0.9.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Glycan Array techniek
<ol><li>
Voorbereiding van de volgende waterige oplossingen (in ultrazuiver water) en bewaar ze bij kamertemperatuur (25 ° C):
	<ul>
<li>Buffer-1: 1% (m/v) bovien serumalbumine (BSA) in PBS, 1% (v/v) Tween-20 en 0,01% (g/v) NaN3
</li>
		<li>Buffer-2: 1% (m/v) BSA in PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 en 0,01% (g/v) NaN3.</li>
		<li>Buffer-3: 0,1% (v/v) Tween-20 in PBS.</li>
		<li>Buffer-4: 0,001% (v/v) Tween-20 in PBS.</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Glycochip en sample voorbereiding
	<ol>
<li>De opbergdoos met de dia's op tafel gelegd, totdat ze bij kamertemperatuur (25 ° C). Opmerking: Gebruik poedervrije latex handschoenen. De glycochip moet worden gemanipuleerd door het onderste gedeelte van het glasplaatje, waar de streepjescode zich bevindt. De barcode zal u helpen te bepalen de rechterkant, het vermijden van het contact met het oppervlak waar de glycanen worden afgedrukt.</li>
		<li>Open het, neem de glycochip en plaats het in het incubatie-zaal (25 ° C), al geconditioneerd met natte filtreerpapier constant te houden vochtigheid in de kamer.</li>
		<li>Ondertussen, Verdun het serum van de muizen met Buffer-1 (1:20) in 1,5 mL tubes. Meng de serum-oplossing (5 s) met een vortex-mixer. Opmerking: Het volume moest volledig betrekking hebben op een enkele glycochip oppervlak is ongeveer 1 mL.</li>
		<li>Na de homogenisering, Incubeer het verdund serum bij 37 ° C gedurende 10 minuten in een waterbad te vermijden immunoglobulin aggregatie. Centrifugeer de buizen voor 3 min op 10.000 x g en 25 ° C, verzamelen het supernatant en gooi geprecipiteerde materiaal.</li>
		<li>Plaats de glycochip zorgvuldig in de zaal van de incubatie. Incubeer het 15 min bij 25 ° C met 1 mL van de Buffer-3 te heffen resterende materiaal op het oppervlak van de glycochip.</li>
		<li>Houd de glycochip in een verticale positie en het rewash met enkele druppels Buffer-3 met behulp van een plastic pipet van Pasteur. Verwijder voorzichtig de buffer van het oppervlak van de glycochip met filtreerpapier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reactie: antilichamen bindende
	<ol>
<li>Plaats de glycochip in het incubatie-zaal. De verdunde serummonster verspreid over de oppervlakte van de glycochip met behulp van een micropipet. Incubeer met orbitale agitatie (30 rpm) bij 37 ° C voor 1,5 h. Zorg ervoor dat alle droge gebied van het glycochip oppervlak wordt bestreken door het serummonster van de verdunde met behulp van het uiteinde van de pipet.</li>
		<li>Verwijder alle overtollige monster en dompel de glycochip gedurende 5 min. in Buffer-3 bij 25 ° C. Vervolgens plaatst u de glycochip naar een container met Buffer-4 (5 min) en tot slot wassen (5 min) de glycochip met ultrazuiver water. Centrifugeer het glycochip voor 1 min op 175 x g en 25 ° C tot de vloeistof afzuigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detectie: secundair antilichaam
	<ol>
<li>Plaats de glycochip in het incubatie-zaal. Verspreid over het oppervlak van de glycochip een oplossing (5 µg/mL) van geit-antimuis (IgG + IgM) geconjugeerd met biotine in Buffer-2. Incubeer met orbitale agitatie (30 rpm) bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Verwijder de niet-afhankelijke breuk en herhaal de stappen wassen.</li>
		<li>Na het centrifugeren, Incubeer de glycochip in het donker bij 25 ° C gedurende 45 minuten (30 rpm) met 2 µg/mL van de overeenkomstige daar fluorescerende-label oplossing (in Buffer-2).</li>
		<li>In duisternis, verwijdert u de ongebonden Fractie en herhaal de stappen wassen.</li>
		<li>Droog de glycochip door de lucht. Opmerking: Glycochip moet zo spoedig mogelijk worden gescand. Maar als het onmogelijk is om onmiddellijk na kleuring kan scannen, glycochips kunnen worden opgeslagen in een koele en droge plaats in duisternis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analyse van de Glycan matrix
<ol><li>
Scannen van de array
	<ol>
<li>Laat de glycochip op de tabel totdat het kamertemperatuur in donker bereikt. Op hetzelfde moment, zet de dia scanner en de laser (excitatie golflengte van 633 nm).</li>
		<li>Houd de microarray en schuif de glycochip in de sleuf tot het raakt de achterkant.</li>
		<li>Scannen van de glycochip ("uitvoeren gemakkelijk scan"), en sla de scan als een ". TIFF"bestand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificering van de matrix
	<ol>
<li>Kwantificeren van de array gebruikmakend van een systeem voor de analyse van ScanArray. Open eerder gescande afbeeldingen, door te klikken op "Bestand" in het "Configure & bestand groep" op het hoofdscherm (figuur 1B-D)</li>
		<li>Laden van de bijbehorende matrix bestand sjabloon in GAL formaat (vervreemding van gedrukte glycanen op het glasplaatje) (Figuur 1 c).</li>
		<li>GAL sjabloon aanpassen door het zorgvuldig het uitlijnen van de matrix (grids) met de plekken in de afbeelding en starten van kwantificering (Figuur 1 d).</li>
		<li>Selecteer de kwantificering parameters:<ul>
<li>Kwantificering type: Run gemakkelijk Quant.</li>
			<li>Kwantificering methode: vaste cirkel</li>
			<li>Auto vinden plekken: klik alle opties</li>
			<li>Normalisatie methode: LOWESS (lokaal gewogen Scatter Plot vloeiend maken).</li>
		</ul>
</li>
		<li>Sla de gekwantificeerde gegevens als ". CSV-"bestand (Figuur 1 d). Overdracht van deze gegevens in een gemeenschappelijke spreadsheet-bestand met behulp van Microsoft Excel of een andere geschikte toepassing.</li>
		<li>De interkwartielafstand (IQR) gebruiken als de belangrijkste statistische methode: berekening van de mediaan (kwartiel 2) van alle signalen voor elke ligand en de interquartile afwijking (75ste en 25e percentiel, of de bovenste en onderste kwartielen Q3 en Q1, respectievelijk).</li>
		<li>Interactieve verkenning van gegevens met behulp van een hiërarchische Clustering Explorer toepassing uitvoeren.</li>
		<li>Gebruik clustering parameters: gemiddelde koppeling (UPGMA) en Euclidische afstand als gelijkenis afstand maatregel. Hiërarchische clustering door rijen zonder normalisatie uitvoeren</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+eliciting+neutralizing+antibodies+to+HIV-1+and+to+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).</li>
<li>Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+binding%3A+antibody+effector+functions+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases.</a> Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).</li>
<li>Bebbington, C., Yarranton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+for+the+treatment+of+bacterial+infections%3A+current+experience+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects.</a> Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).</li>
<li>Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology%22">Janeway's Immunobiology</a>. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).</li>
<li>Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+in+human+diseases%3A+lessons+from+complement+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies.</a> Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).</li>
<li>Borrok, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+by+endowing+IgG+with+Fc%CE%B1RI+%28CD89%29+binding%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding.</a> MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).</li>
<li>Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22424219">Antibody-based immunotherapy of cancer.</a> Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Prechl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+quantitative+antibody+homeostasis+model%3A+antigen+saturation%2C+natural+antibodies+and+a+quantitative+antibody+network%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network.</a> Clin Transl Immunology. 6 (2), e131(2017).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+as+predictors+of+complex+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunopath+Ph%22%5BJournal%5D)">Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases.</a> Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).</li>
<li>Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+tumor-associated+antigens+as+biomarkers+in+cancer+immunodiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis.</a> Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).</li>
<li>Suurmond, J., Diamond, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+in+systemic+autoimmune+diseases%3A+specificity+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity.</a> J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).</li>
<li>Bovin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+human+natural+anti-glycan+immunoglobulins.+Do+we+have+auto-antibodies%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies?</a> Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).</li>
<li>de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+genetic+diversity+in+antibody+repertoires+from+diverse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species.</a> Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).</li>
<li>Pochechueva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+printed+glycan+array%2C+suspension+array+and+ELISA+in+the+detection+of+human+anti-glycan+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies.</a> Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).</li>
<li>Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+glycan+array%3A+antibodies+as+probed+in+undiluted+serum+and+effects+of+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution.</a> Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).</li>
<li>Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+carbohydrate+microarray+profiling+of+27+antibodies+demonstrates+widespread+specificity+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems.</a> Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21351089">Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array.</a> Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).</li>
<li>Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+protein-glycan+specificity%3A+effect+of+spacers+and+incubation+time%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time.</a> ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).</li>
<li>Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+with+varying+carbohydrate+density+reveal+distinct+subpopulations+of+serum+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies.</a> J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).</li>
<li>Pochechueva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+suspension+array+for+human+anti-carbohydrate+antibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling.</a> Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).</li>
<li>Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+multivalent+glycoconjugates+for+surface+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating.</a> Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).</li>
<li>Huflejt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-carbohydrate+antibodies+of+normal+sera%3A+findings%2C+surprises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges.</a> Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).</li>
<li>Buchs, J. P., Nydegger, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ABO-ELISA+for+the+quantitation+of+human+blood+group+anti-A+and+anti-B+IgM+and+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).</li>
<li>de Jager, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+and+bead-based+cytokine+immunoassay%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison.</a> Methods. 38 (4), 294-303 (2006).</li>
<li>Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoChip%3A+multiarray+for+the+study+of+carbohydrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins.</a> Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).</li>
<li>Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-coated+microarrays%3A+a+novel+slide+surface+for+the+high-throughput+analysis+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans.</a> Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).</li>
<li>Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+BALB%2Fc+mice+natural+anti-Carbohydrate+antibodies%3A+mice+vs.+humans+difference%2C+and+otherness+of+individual+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals.</a> Front Immunol. 8, 1449(2017).</li>
<li>Pazynina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glyco-O-sulfatome+for+profiling+of+human+natural+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies.</a> Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).</li>
<li>Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+synthesis+of+A+%28type+2%29+and+B+%28type+2%29+tetrasaccharides+related+to+the+human+ABO+blood+group+system%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system.</a> Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).</li>
<li>Ryzhov, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-spacer-lipid+constructs+of+Lewis+and+chimeric+Lewis%2FABH+glycans.+Synthesis+and+use+in+serological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd+Res%22%5BJournal%5D)">Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies.</a> Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616300992">Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides.</a> Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616000547">Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides.</a> Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).</li>
<li>Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1134/S1068162015020120">The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments.</a> Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943615001212">Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc.</a> Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).</li>
<li>Solís, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+into+glycosciences%3A+How+chemistry%2C+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li>
<li>Pazynina, G. V., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273432327_Divergent_Strategy_for_the_Synthesis_of_a2-3-Linked_Sialo-oligosaccharide_Libraries_Using_a_Neu5TFA-a2-3-Gal_Building_Block">Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block.</a> Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+natural+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemistry of natural glycan microarrays.</a> Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).</li>
<li>Hoy, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+taxonomic+composition+of+the+fecal+microbiota+in+an+inbred+mouse+strain+across+individuals+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time.</a> PLoS One. 10 (11), e0142825(2015).</li>
<li>D'Argenio, V., Salvatore, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+gut+microbiome+in+the+healthy+adult+status%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of the gut microbiome in the healthy adult status.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).</li>
<li>Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotheses+of+the+origin+of+natural+antibodies%3A+a+glycobiologist%27s+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion.</a> Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).</li>
<li>Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+repertoire+development+in+fetal+and+newborn+piglets%2C+III.+Colonization+of+the+gastrointestinal+tract+selectively+diversifies+the+preimmune+repertoire+in+mucosal+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues.</a> Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).</li>
<li>Bos, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+immunoglobulin+levels+and+naturally+occurring+antibodies+against+carbohydrate+antigens+in+germ-free+BALB%2Fc+mice+fed+chemically+defined+ultrafiltered+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet.</a> Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).</li>
<li>van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background+%28spontaneous%29+immunoglobulin+production+in+the+murine+small+intestine+before+and+after+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning.</a> J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).</li>
<li>Krasnova, L., Wong, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+chemistry+and+biology+of+glycosylation+with+glycan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis.</a> Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).</li>
<li>Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOverkleeft%2C+HS+%22Essentials+of+Glycobiology+%5BInternet%5D%22">Essentials of Glycobiology [Internet]</a>. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).</li>
</ol>

Nailya Khasbiullinaen Alexey Nokel zijn onze medewerkers van Semiotik LLC, die de leverancier van de glycochips gebruikt in deze studie is.

Glycan microarrays zijn onmisbare tools voor de studie van eiwit-glycan interacties40geworden. Het huidige werk beschrijft een protocol op basis van PGA technologie te bestuderen van het repertoire van het circuleren van anti-koolhydraten antilichamen in BALB/c muizen. Aangezien PGA de mogelijkheid om de grote aantallen scherm van biologisch onbekende glycanen biedt, is een uitzonderlijk gunstige discovery tool13,15,<sup class="...

Antilichamen spelen een centrale rol in onze verdediging tegen invasie ziekteverwekkers door virussen1,2 en bacteriën2,3, rechtstreeks te neutraliseren door het activeren van de aanvulling systeem4,5 en de versterking van fagocytose6. Bovendien, zijn ze essentiële elementen in kanker targeting en eliminatie van kwaadaardige cellen7en homeostase onderhoud8,9.
Aandoeningen van het immuunsysteem kunnen leiden tot auto-immune en inflammatoire ziekten10 en kanker11. Al deze pathologische voorwaarden ideaal eisen een snelle diagnose voor een efficiënte behandeling. In het geval van auto-immune aandoeningen is de serologische aanwezigheid van autoantilichamen in de meeste gevallen een voorspeller voor diagnose van autoimmuniteit10,12. Deze antistoffen met het celoppervlak reageren en extracellulaire autoantigens en ze zijn vaak aanwezig voor vele jaren voorafgaand aan de indiening van auto-immune ziekte10,12. Immuun tekortkomingen en kanker zijn ook gediagnosticeerd met bloedonderzoek dat ofwel meten van het niveau van immuun elementen zoals antilichamen, of hun functionele activiteit11.
De identificatie van het repertoire van de circulerende antilichamen en serologische kwalificatieniveaus staan om een prognose en evalueren van de voortgang van alle genoemde pathologische voorwaarden. Wij hebben eerder aangetoond dat het potentieel van PGA techniek voor de analyse van de circulerende antilichamen in verschillende diersoorten13-16, minimaliseren van het gebruik van grote hoeveelheden van serologische monsters, het vermijden van het probleem in verband met antilichamen Kruisallergie17 en waardoor high-throughput profilering van een uitgebreid repertoire van antilichamen15.
Glycan gebaseerde immunoassay zijn voornamelijk geconditioneerd, onder andere door de oorsprong en productie van koolhydraten, die de affiniteit en de binding van liganden15,18,19,20 bepalen ,21. Glycan gebaseerde immunoassay kunnen worden ontwikkeld in suspensie (microbolletjes)15,21,22 of flat-geactiveerde oppervlakken15,21,22, 23,24. De laatste omvatten ELISA (de meeste conventionele methoden) en PGA. Er is niet veel gegevens vergelijken deze methodologieën in de dezelfde experimentele instelling15,25,26,27. Wij hebben eerder de werkzaamheid en de selectiviteit van deze immunoassay aan profiel anti-glycan antilichamen in individuele menselijk plasma monsters15vergeleken. Voor sommige antilichamen zoals die gericht op anti-A/B-bloedgroep, alle de immunoassay kon ze detecteren met statistische significantie en ze positief gecorreleerd met elkaar15,18,21. Ondertussen, anti-P1 antilichamen zijn voornamelijk aangetroffen door PGA met het hoogste discriminerende vermogen, en er was geen correlatie in de vaststellingen gedaan door de verschillende glycan gebaseerde immunoassay15,18, 21. deze verschillen tussen methoden werden voornamelijk verband houden met het antilichaam/antigeen verhouding en de glycan geaardheid15. ELISA en schorsing arrays zijn meer vatbaar voor aspecifieke bindende dan PGA, want er een overschrijding van het antigeen van antilichamen in deze methoden15 is. Daarnaast is de richting van glycanen in de PGA beperkter dan in ELISA en schorsing matrices15. ELISA is handig wanneer de studie een beperkte panel van glycanen omvat. Samen met schorsing arrays biedt ELISA bredere flexibiliteit met betrekking tot assay herconfiguratie. PGA is buitengewoon handig voor ontdekking benaderingen15,18,21,28. Ondanks deze duidelijke voor- en nadelen, kunnen de drie genoemde immunoassay worden gebruikt om verschillende aspecten van glycan-antilichaam interactie te bestuderen. Het uiteindelijke doel van de studie is dat de ene begeleidt de selectie van de meer geschikte methode.
Het huidige werk is gericht op het uitbreiden van het gebruik van PGA technologie voor de analyse van het repertoire van circulerende antilichamen van de anti-glycan in kleine dieren. Als een representatief resultaat presenteren we hier een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van het repertoire van natuurlijke anti-koolhydraten antilichamen in volwassen BALB/c muizen door PGA.

<table><tbody><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotinyleren geiten anti-menselijke Ig's</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Ref. #: 31782</td><td></td></tr><tr><td>biotinyleren geiten anti-muis IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: 31807</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp;</td><td>Scienion AG, Berlijn, Duitsland</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr><tr><td>Kleurlade (schuif incubatiekamer)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Canada</td><td>Ref. #: M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland&nbsp;</td><td>Ref. #: 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr><tr><td>Glijscanner&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Schudende incubator</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, UK</td><td>Ref. #: SI50</td><td></td></tr><tr><td>Biologische monsters</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c muizen sera</td><td>Dit papier</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Complex Immunoglobulin Preparaat (CIP)</td><td>Immuno-Gem, Moskou, Rusland</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën, Reagentia en Glycanen&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycan bibliotheek</td><td>Instituut voor Bio-organische Chemie (IBCh), Moskou, Rusland</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp;</td><td>Ref. #: A9418</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Chemicals &amp; Life Science S.A., Madrid, Spanje</td><td>Ref. #: 655204</td><td></td></tr><tr><td>Phosphaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spanje</td><td>Ref. #: E404</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine Alexa Fluor 555-conjugaat&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine Cy5-conjugaat</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK</td><td>Ref. #: PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide-gederivatiseerde glazen slides H&nbsp;</td><td>Schott-Nexterion, Jena, Duitsland</td><td>Ref. #: 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filterpapier&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL buisjes</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Ref. #: 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Software en algoritmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express Microarray Analyse Systeem</td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per</td><td></td></tr><tr><td>kinelmer.com/microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hierarchical Clustering Explorer toepassing</td><td>University of Maryland, MD, USA</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

gedrukte glycan array: een gevoelige techniek voor de analyse van het repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Het repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen van een bepaalde persoon wordt vaak geassocieerd met de immunologische status. Niet alleen de individuele immuun aandoening bepaalt het succes in de strijd tegen interne en externe potentiële bedreiging signalen, maar ook het bestaan van een bepaald patroon van de circulerende antilichamen anti-glycan (en hun serologische niveau variatie) kan een belangrijke markering van het ontstaan en de progressie van bepaalde pathologische condities. Hier beschrijven we een afgedrukt Glycan Array PGA gebaseerde methodiek die de mogelijkheid biedt voor het meten van honderden glycan doelen met zeer hoge gevoeligheid; met behulp van een minimale hoeveelheid monster, dat een gemeenschappelijke beperking aanwezig wanneer kleine dieren is (ratten, muizen, hamster, enz.) worden gebruikt als modellen aanpak van aspecten van ziekten bij de mens. Als een representatief voorbeeld van deze aanpak tonen wij de resultaten van de analyse van het repertoire van natuurlijke anti-glycan antilichamen in BALB/c muizen. We laten zien dat elke BALB/c muis betrokken in de studie, ondanks het feit dat genetisch identiek en onderhouden onder dezelfde voorwaarden, een bepaald patroon van natuurlijke anti-koolhydraten antilichamen ontwikkelt. Dit werk beweert dat het gebruik van PGA technologie te onderzoeken repertoire (kenmerken) en de niveaus van circulerende antilichamen anti-koolhydraten, zowel in gezondheid en tijdens een pathologische aandoening uit te breiden.

Hier presenteren we een samenvatting van de vertegenwoordiger van de resultaten van de kwantificering van het repertoire van natuurlijke anti-glycan antilichamen in een populatie van 20 BALB/c muizen. De glycochips gebruikt in deze studie bevatte 419 verschillende glycan structuren. Meeste glycanen werden gesynthetiseerd als -CH2CH2CH2NH2 spacer-gewapend O-glycosiden, in een aantal gevallen als -CH2CH2NH2</sub...

Dit werk toont het potentieel van gedrukte glycan matrix (PGA) technologie voor de analyse van de circulerende anti-koolhydraten antistoffen bij kleine dieren.

Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Het algemene doel van dit protocol is het bestuderen van het profiel van circulerende anti-glycan antilichamen in het serum van kleine dieren met behulp van een gedrukte glycan array gebaseerde technologie. Deze aanpak heeft een potentieel in de vroege diagnose en de juiste behandeling in sommige pathologische aandoeningen waar antilichamen tegen glycanstructuren een belangrijke rol spelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om in dezelfde experimentele setting honderden glycandoelen met een zeer hoge gevoeligheid te meten met behulp van een minimale hoeveelheid monster.Gebruik een contactloze robotarray voor het voorbereiden van de microarray. Drukt zes replica's van 50 millimolar glycanen en 10 microgram per milliliter polysacchariden en 300 millimolar PBS, pH 8.5 op n-hydroxy 6 cinnamic afgeleide glasdia's. Elke dia bevat vier verschillende blokken subarrays die zes keer worden herhaald.Elke subarray wordt gevormd door 112 verschillende glycans spots inclusief besturingselementen. Broed de glijbanen een uur lang in een vochtbox bij kamertemperatuur. Om de microarrays te blokkeren, 1 1/2 uur de dia's uitbroeden met een buffer bij kamertemperatuur.Was vervolgens de glycolchip met ultra zuiver water en droog deze door de lucht. Buffer één voorbereiden via buffer vier zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de glycolchips en monsters voor te bereiden, leg je de opbergdoos met de dia's op tafel tot ze op kamertemperatuur zijn.Open de doos en breng de glycolchip over in de incubatiekamer die al moet worden geconditioneerd met nat filterpapier om de luchtvochtigheid constant in de kamer te houden. Verdun ondertussen het muizenserum met buffer één op de 1,5 milliliter buizen. Homogeniseer de serumoplossing gedurende vijf seconden met een vortexmixer.Na de homogenisatie, incubeer het verdunde serum bij 37 graden celsius gedurende 10 minuten in een waterbad om immunoglobuline aggregatie te voorkomen. Dan centrifugeren de buizen gedurende drie minuten op 10, 000 keer G en 25 graden Celsius. Verzamel het supernatant en gooi elk neergeslagen materiaal weg.Plaats de glycolchip voorzichtig in de incubatiekamer. Incubeer het met één milliliter buffer drie om om het even welk restmateriaal op de oppervlakte van de glycolpap te elimineren. Gedurende 15 minuten, bij 25 graden Celsius.Houd de glycolchip in een verticale positie en spoel deze opnieuw met enkele druppels buffer drie met behulp van een plastic pasteurpipet. Verwijder vervolgens voorzichtig de buffer van het oppervlak van de glycolchip met behulp van filterpapier. Plaats de glycolchip terug in de incubatiekamer.Verdeel het verdunde serummonster over het oppervlak van de glycolchip met behulp van een micropipet. Zorg ervoor dat alle droge gebieden van het glycolchipoppervlak met behulp van de punt van de pipet door het verdunde serummonster worden afgedekt. Incubeer met orbitale agitatie bij 37 graden Celsius gedurende 1 1/2 uur.Na incubatie, verwijder overtollig monster en dompel de glycol chip gedurende vijf minuten in buffer drie op 25 graden Celsius. Geef de glycolchip door aan een container met buffer vier en was ten slotte de glycolchip met ultra zuiver water. Centrifugeren de glycolchip gedurende een minuut bij 175 keer G en 25 graden Celsius om de vloeistof te verwijderen.Na het plaatsen van de glycolchip terug in de incubatiekamer, verspreid een oplossing van geit anti-muis geconjugeerd aan biotine over de glycol chip oppervlak. Broeden met orbitale agitatie op 37 graden Celsius voor een uur. Verwijder de niet-gebonden fractie en herhaal de wasstappen.Na centrifugatie, incubeer de glycol chip in het donker op 25 graden Celsius gedurende 45 minuten met twee microgram per milliliter van de overeenkomstige fluorchrome-gelabelde streptavidin oplossing in buffer twee. Na het werken in het donker om de niet-gebonden fractie te verwijderen en het herhalen van de wasstappen, droog de glycol chip door de lucht. Als u de array wilt scannen, laat u de glycolchip op de tafel staan totdat deze in het donker op kamertemperatuur komt.Schakel tegelijkertijd de diascanner en de laser in. Houd de micro-array, schuif de glycol chip in de sleuf totdat het raakt de achterkant. Scan de glycolchip door EasyScan uit te voeren en sla de scan op als een tif-bestand.Kwantificeer de array met behulp van een ScanArray-analysesysteem. Open de eerder gescande afbeeldingen door te klikken op bestand in de groep configureren en bestanden in het hoofdvenster. Laad de bijbehorende matrixbestandssjabloon in GAL-indeling die de dispositie van afgedrukte glycans op de glazen dia vertegenwoordigt.Pas de GAL-sjabloon aan door de array zorgvuldig uit te lijnen op de vlekken in de afbeelding en kwantificering te initiëren. Selecteer de kwantificeringsperiden als kwantificeringstype run easy quantification en quantification method fixed circle. Schakel alle opties voor de automatisch vinden vlekken en selecteer lowess voor de normalisatie methode.Sla de gekwantificeerde gegevens op als een csv-bestand. Breng deze gegevens over naar een gemeenschappelijk spreadsheetbestand met Microsoft Excel of een andere geschikte toepassing. Genetisch identieke muizen mogen niet worden beschouwd als immunologische equivalenten omdat ze verschillende patronen van natuurlijke anti-koolhydraatantilichamen hebben ontwikkeld.Zoals hier getoond, werden slechts 12 glycan specificiteiten bewaard. Hier getoond, is een representatief voorbeeld van de beelden verkregen van micro-chips scannen met behulp van een florescent scanner. Het raster wordt vervolgens uitgelijnd op de vlekken in elke subarray.De florescent's worden gedetecteerd voor elke plek en de resultaten worden overgebracht naar een gemeenschappelijk spreadsheetbestand. Na incubatie met muisserum werden de glycochips gescand met behulp van een scanarraylezer. Gegevens werden geanalyseerd met een micro-array analysesysteem en de resultaten werden uitgedrukt in RFU als mediaan plus van minus de mediane absolute afwijking.Blauwe en witte kleuren vertegenwoordigen achtergrondbindingssignalen van minder dan 4000 RFU. Rode kleur staat voor positieve bindingssignalen groter dan of gelijk aan 4000 RFU. De meeste glycanstructuren die in de glycolchips werden blootgesteld, werden niet herkend door het repertoire van circulerende antiglycanantilichamen van balpen C-muizen.Eenmaal onder de knie deze techniek kan worden gedaan in vijf uur en 45 minuten als het goed wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe printer glycon array technologie te gebruiken om het repertoire en de niveaus van circulerende anti koolhydraten antilichamen in serum monsters te onderzoeken. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de glyco chip moet worden gemanipuleerd door een onderste deel van de glazen licht.Waar de barcode zich bevindt. Om contact met de glycans te vermijden. Zorg er ook voor dat alle droge ruimte van de glyco-chip wordt bedekt door het verdunde serummonster met behulp van de punt van de pipet.Het volume dat nodig is om een enkel oppervlak van een glyco-chip volledig te bedekken, is ongeveer een milliliter. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals microsfeerbasisschorsiearray om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de flexibele multiplexdetectie van antiglycan-antilichamenprofiel. Na de introductie maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biomacrale moleculen en immunologie om een niet-eiwitglycolinteractie in de set van kleine dieren te verkennen.

printed-glycan-array-sensitive-technique-for-analysis-repertoire

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

This video demonstrates printed glycan array technology for analyzing circulating anti-glycan antibodies in mouse serum. The antibodies in the serum interact with specific glycans on the chip, which is confirmed by immunostaining followed by fluorescence scanning.

Detecting Circulating Anti-Glycan Antibodies with a Printed Glycan Array

Met behulp van een gedrukte glycaan-microarray-strategie werd een conventionele 96-wells plaat assay geminiaturiseerd voor analyse van hemagglutinine aviditeit en specificiteit voor sialic acid bevattende receptoren van het influenza A-virus.

Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

We beschrijven hier een methode om aanpasbare antigeen-microarrays te genereren die kunnen worden gebruikt voor de gelijktijdige detectie van serum IgG en IgM auto-antilichamen van mensen en muizen. Deze arrays maken een doorvoer en kwantitatieve detectie mogelijk van antilichamen tegen willekeurige antigenen of epitopen van belang.

Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.

Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering

Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Het glycosyleringspatroon van een antilichaam bepaalt de klinische prestaties, dus industriële en academische inspanningen om glycosylatie te beheersen blijven bestaan. Omdat typische glyco-engineeringcampagnes tijd- en arbeidsintensief zijn, zou het genereren van een snel protocol om de impact van glycosyleringsgenen te karakteriseren met behulp van transiënte uitschakeling nuttig zijn.

Snelle antilichaamglycosengineering in ovariumcellen van Chinese hamsters

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Een eenvoudige slot blot methode werd ontwikkeld voor de kwantificering van influenza virale hemagglutinine en neuraminidase met behulp van universele antilichamen gericht hun meest geconserveerde sequenties geïdentificeerd door middel van bioinformatica analyses. Deze innovatieve aanpak kan een nuttig alternatief voor de kwantitatieve bepaling van alle virale hemagglutinine en neuraminidase.

Kwantitatieve analyses van alle Influenza A Virale Hemagglutinins en neuraminidases gebruik van Universal Antistoffen Type in de eenvoudige Slot Blot Assays

Leer de gedrukte glycaan-array-techniek voor gevoelige analyse van circulerende anti-koolhydraat-antilichamen in kleine dieren. Deze methode meet honderden glycaandoelen tegelijk met minimale samplevolume.

Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren (Video) | JoVE Journal

Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren

Meer video's verkennen