Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren
February 14th, 2019
Dit werk toont het potentieel van gedrukte glycan matrix (PGA) technologie voor de analyse van de circulerende anti-koolhydraten antistoffen bij kleine dieren.
Het algemene doel van dit protocol is het bestuderen van het profiel van circulerende anti-glycan antilichamen in het serum van kleine dieren met behulp van een gedrukte glycan array gebaseerde technologie. Deze aanpak heeft een potentieel in de vroege diagnose en de juiste behandeling in sommige pathologische aandoeningen waar antilichamen tegen glycanstructuren een belangrijke rol spelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om in dezelfde experimentele setting honderden glycandoelen met een zeer hoge gevoeligheid te meten met behulp van een minimale hoeveelheid monster.
Gebruik een contactloze robotarray voor het voorbereiden van de microarray. Drukt zes replica's van 50 millimolar glycanen en 10 microgram per milliliter polysacchariden en 300 millimolar PBS, pH 8.5 op n-hydroxy 6 cinnamic afgeleide glasdia's. Elke dia bevat vier verschillende blokken subarrays die zes keer worden herhaald.
Elke subarray wordt gevormd door 112 verschillende glycans spots inclusief besturingselementen. Broed de glijbanen een uur lang in een vochtbox bij kamertemperatuur. Om de microarrays te blokkeren, 1 1/2 uur de dia's uitbroeden met een buffer bij kamertemperatuur.
Was vervolgens de glycolchip met ultra zuiver water en droog deze door de lucht. Buffer één voorbereiden via buffer vier zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de glycolchips en monsters voor te bereiden, leg je de opbergdoos met de dia's op tafel tot ze op kamertemperatuur zijn.
Open de doos en breng de glycolchip over in de incubatiekamer die al moet worden geconditioneerd met nat filterpapier om de luchtvochtigheid constant in de kamer te houden. Verdun ondertussen het muizenserum met buffer één op de 1,5 milliliter buizen. Homogeniseer de serumoplossing gedurende vijf seconden met een vortexmixer.
Na de homogenisatie, incubeer het verdunde serum bij 37 graden celsius gedurende 10 minuten in een waterbad om immunoglobuline aggregatie te voorkomen. Dan centrifugeren de buizen gedurende drie minuten op 10, 000 keer G en 25 graden Celsius. Verzamel het supernatant en gooi elk neergeslagen materiaal weg.
Plaats de glycolchip voorzichtig in de incubatiekamer. Incubeer het met één milliliter buffer drie om om het even welk restmateriaal op de oppervlakte van de glycolpap te elimineren. Gedurende 15 minuten, bij 25 graden Celsius.
Houd de glycolchip in een verticale positie en spoel deze opnieuw met enkele druppels buffer drie met behulp van een plastic pasteurpipet. Verwijder vervolgens voorzichtig de buffer van het oppervlak van de glycolchip met behulp van filterpapier. Plaats de glycolchip terug in de incubatiekamer.
Verdeel het verdunde serummonster over het oppervlak van de glycolchip met behulp van een micropipet. Zorg ervoor dat alle droge gebieden van het glycolchipoppervlak met behulp van de punt van de pipet door het verdunde serummonster worden afgedekt. Incubeer met orbitale agitatie bij 37 graden Celsius gedurende 1 1/2 uur.
Na incubatie, verwijder overtollig monster en dompel de glycol chip gedurende vijf minuten in buffer drie op 25 graden Celsius. Geef de glycolchip door aan een container met buffer vier en was ten slotte de glycolchip met ultra zuiver water. Centrifugeren de glycolchip gedurende een minuut bij 175 keer G en 25 graden Celsius om de vloeistof te verwijderen.
Na het plaatsen van de glycolchip terug in de incubatiekamer, verspreid een oplossing van geit anti-muis geconjugeerd aan biotine over de glycol chip oppervlak. Broeden met orbitale agitatie op 37 graden Celsius voor een uur. Verwijder de niet-gebonden fractie en herhaal de wasstappen.
Na centrifugatie, incubeer de glycol chip in het donker op 25 graden Celsius gedurende 45 minuten met twee microgram per milliliter van de overeenkomstige fluorchrome-gelabelde streptavidin oplossing in buffer twee. Na het werken in het donker om de niet-gebonden fractie te verwijderen en het herhalen van de wasstappen, droog de glycol chip door de lucht. Als u de array wilt scannen, laat u de glycolchip op de tafel staan totdat deze in het donker op kamertemperatuur komt.
Schakel tegelijkertijd de diascanner en de laser in. Houd de micro-array, schuif de glycol chip in de sleuf totdat het raakt de achterkant. Scan de glycolchip door EasyScan uit te voeren en sla de scan op als een tif-bestand.
Kwantificeer de array met behulp van een ScanArray-analysesysteem. Open de eerder gescande afbeeldingen door te klikken op bestand in de groep configureren en bestanden in het hoofdvenster. Laad de bijbehorende matrixbestandssjabloon in GAL-indeling die de dispositie van afgedrukte glycans op de glazen dia vertegenwoordigt.
Pas de GAL-sjabloon aan door de array zorgvuldig uit te lijnen op de vlekken in de afbeelding en kwantificering te initiëren. Selecteer de kwantificeringsperiden als kwantificeringstype run easy quantification en quantification method fixed circle. Schakel alle opties voor de automatisch vinden vlekken en selecteer lowess voor de normalisatie methode.
Sla de gekwantificeerde gegevens op als een csv-bestand. Breng deze gegevens over naar een gemeenschappelijk spreadsheetbestand met Microsoft Excel of een andere geschikte toepassing. Genetisch identieke muizen mogen niet worden beschouwd als immunologische equivalenten omdat ze verschillende patronen van natuurlijke anti-koolhydraatantilichamen hebben ontwikkeld.
Zoals hier getoond, werden slechts 12 glycan specificiteiten bewaard. Hier getoond, is een representatief voorbeeld van de beelden verkregen van micro-chips scannen met behulp van een florescent scanner. Het raster wordt vervolgens uitgelijnd op de vlekken in elke subarray.
De florescent's worden gedetecteerd voor elke plek en de resultaten worden overgebracht naar een gemeenschappelijk spreadsheetbestand. Na incubatie met muisserum werden de glycochips gescand met behulp van een scanarraylezer. Gegevens werden geanalyseerd met een micro-array analysesysteem en de resultaten werden uitgedrukt in RFU als mediaan plus van minus de mediane absolute afwijking.
Blauwe en witte kleuren vertegenwoordigen achtergrondbindingssignalen van minder dan 4000 RFU. Rode kleur staat voor positieve bindingssignalen groter dan of gelijk aan 4000 RFU. De meeste glycanstructuren die in de glycolchips werden blootgesteld, werden niet herkend door het repertoire van circulerende antiglycanantilichamen van balpen C-muizen.
Eenmaal onder de knie deze techniek kan worden gedaan in vijf uur en 45 minuten als het goed wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe printer glycon array technologie te gebruiken om het repertoire en de niveaus van circulerende anti koolhydraten antilichamen in serum monsters te onderzoeken. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de glyco chip moet worden gemanipuleerd door een onderste deel van de glazen licht.
Waar de barcode zich bevindt. Om contact met de glycans te vermijden. Zorg er ook voor dat alle droge ruimte van de glyco-chip wordt bedekt door het verdunde serummonster met behulp van de punt van de pipet.
Het volume dat nodig is om een enkel oppervlak van een glyco-chip volledig te bedekken, is ongeveer een milliliter. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals microsfeerbasisschorsiearray om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de flexibele multiplexdetectie van antiglycan-antilichamenprofiel. Na de introductie maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biomacrale moleculen en immunologie om een niet-eiwitglycolinteractie in de set van kleine dieren te verkennen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit werk toont het potentieel van gedrukte glycan-array (PGA) technologie voor de analyse van circulerende anti-koolhydraatantilichamen in kleine dieren. Deze aanpak maakt een hoog gevoelige meting van meerdere glycan-doelwitten mogelijk met een minimaal monstervolume.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Immunologie
- Biotechnologie
Achtergrond
- Circulerende anti-glycan antilichamen spelen een belangrijke rol bij verschillende pathologische aandoeningen.
- Vroege diagnose en geschikte behandeling kunnen worden vergemakkelijkt door deze antilichamen te begrijpen.
- Gedrukte glycan-array technologie maakt de gelijktijdige analyse van talrijke glycan-structuren mogelijk.
- Deze methode is bijzonder nuttig in kleine diermodellen.
Doel van de studie
- Om het profiel van circulerende anti-glycan antilichamen in kleine dieren te analyseren.
- Om het potentieel van PGA technologie te onderzoeken bij het diagnosticeren van aandoeningen gerelateerd aan glycan-antilichamen.
- Om de gevoeligheid en efficiëntie van deze methode in een onderzoeksomgeving te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een non-contact robotische arrayer voor microarray-voorbereiding.
- Afdrukken van zes replica's van glycanen en polysacchariden op glasplaten.
- Gebruik van PBS-buffer voor optimale omstandigheden tijdens de test.
- Analyse van antilichaamreacties met behulp van de gedrukte glycan-array.
Belangrijkste resultaten
- Hoge gevoeligheid aangetoond bij het meten van glycan-gerichte antilichamen.
- Toonde de mogelijkheid om honderden glycandoelwitten gelijktijdig te analyseren.
- Gaf inzicht in de antilichaamprofielen in het serum van kleine dieren.
- Benadrukte de voordelen van PGA-technologie in immunologische studies.
Conclusies
- PGA-technologie is een veelbelovend hulpmiddel voor het bestuderen van anti-glycan antilichamen.
- Deze methode kan helpen bij de vroege diagnose van ziekten geassocieerd met glycan-structuren.
- Verder onderzoek kan de toepassingen in verschillende biomedische velden uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Printed glycan array (PGA) technology enables high-sensitivity profiling of circulating anti-carbohydrate antibodies from minimal serum volumes, addressing a critical constraint in small animal model studies. This capability supports early biomarker discovery and mechanistic de-risking in immunology and infectious disease research by linking glycan-specific antibody repertoires to pathological conditions. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible readouts of humoral immune responses against diverse glycan structures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping natural anti-glycan antibody repertoires in genetically identical models, revealing individual immunological variation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-sensitivity detection of hundreds of glycan targets using minimal sample input, conserving precious preclinical specimens.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying conserved and variable glycan specificities that may correlate with disease susceptibility or resistance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible fluorescent signals (RFU) normalized via Lowess method, enabling reliable comparison across samples and experimental conditions.
- Scalability: Each slide contains four blocks of subarrays with six replicates, allowing high-throughput screening of glycan-specific antibody binding patterns.
- Workflow Integration: Outputs quantified data in CSV format compatible with spreadsheet analysis, streamlining downstream data handling in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links circulating anti-glycan antibody profiles to immunological status, offering a potential biomarker pathway for early detection of pathological conditions in small animal models.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating glycan antibody repertoires with disease onset and progression, as noted in the study’s implications for human disease modeling.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in immune mechanism studies by providing direct, glycan-specific antibody binding data rather than inferring function from protein-centric assays.
Pipeline & Workflow Integration
PGA technology fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis generation in immunology before lead identification, with outputs informing preclinical validation through biomarker-aligned immune profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing individual-specific anti-glycan antibody patterns in isogenic models, highlighting limitations of assuming immunological equivalence.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, blocking, and incubation steps that ensure consistent glycan presentation and antibody detection.
- Analytics: Generates quantitative RFU measurements with median absolute deviation, enabling statistical comparison of antibody binding across glycan targets and samples.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying glycan biomarkers that may reflect disease state, supporting extrapolation to human immunology studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immunoprofiling, where validated glycan panels can be applied across multiple disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in humoral immune responses to carbohydrates.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through replicate printing, normalized quantification, and defined signal thresholds (e.g., 4000 RFU for positive binding).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of immunological biomarkers, reducing late-stage failure risk due to unanticipated immune mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-specific antibody signatures that may indicate differential disease progression or treatment response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray handling, fluorescence detection, and data normalization using tools like ScanArray and EasyQuant.
- Depends on non-contact robotic arrayers, fluorescence scanners, and buffer preparation infrastructure for glycan printing and assay execution.
- Necessitates cross-team standardization of sample dilution, incubation conditions, and washing protocols to minimize variability in antibody binding readings.
- Involves adaptation considerations when extending to different species or sample types, particularly regarding serum dilution factors and blocking efficiency.
- Includes practical limitations such as the need to avoid contact with printed glycan spots during handling and ensuring complete surface coverage of samples during incubation.
