Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Het algemene doel van deze in vitro kinase-test is om fosforylatieplaatsen in een eiwit van belang te identificeren die specifiek zijn voor de kinase cycline-afhankelijke kinase 1. De identificatie van CDK1-specifieke fosforylatieplaatsen is belangrijk omdat ze mechanistische inzichten bieden in hoe CDK1 de celcyclus controleert. Regulatie van de celcyclus is cruciaal voor de volledige segregatie van chromosomen en defecten leiden tot chromosomale afwijkingen en kanker.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat deze werkt met gezuiverde eiwitten, daarom kan het worden toegepast op elk modelorganisme en levert het betrouwbare resultaten op, vooral in combinatie met functionele studies in cellen. Deze methode is belangrijk omdat het bekende aantal CDK1-doelen nog steeds laag is, ondanks het feit dat CDK1 naar schatting acht tot 13% van het proteum fosforyleert. Hoewel deze methode CDK1-specifieke fosforylatieplaatsen identificeert, kan het worden aangepast om fosforylatieplaatsen voor andere kinasen te identificeren, op voorwaarde dat de gezuiverde kinase beschikbaar is.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de voorwaarden voor de kinase-test voor elk eiwitdoel moeten worden geoptimaliseerd om een hoge fosforylatie-efficiëntie te verkrijgen. Gebruik bij voorkeur 100% IGPS 3.0-software en bezoek de webserver om de CDK1-specifieke fosforylatieplaatsen in de CENP-F-doeleiwitsequentie te voorspellen. Controleer de fosforylatieplaatsen tegen de CDK1-consensussequentie.

Start de eiwitexpressie door een voorkweek te bereiden. Volg de instructies van de fabrikant en transformeer een microliter van het expressieplasmide in 50 microliters van E.coli competente cellen. Voeg na het toevoegen van het plasmide de cellen 30 minuten op ijs in.

Incubeer vervolgens de cellen gedurende 45 seconden bij 42 graden Celsius. Na de incubatie plaats de cellen één minuut op ijs en voeg vervolgens 400 microliter LB toe aan de cellen, en incubeer de cultuur gedurende één uur bij 37 graden Celsius met schudden. Beplaat vervolgens 200 microliter van de cultuur op LB-agarplaten, aangevuld met de antibiotica van belang, afhankelijk van de constructie.

Incubeer vervolgens de platen gedurende 12 tot 20 uur bij 37 graden Celsius zonder te schudden. Neem vervolgens een kolonie van de LB-agarplaat en inoculeer de kolonie in 50 milliliter LB-medium aangevuld met de gewenste antibioticacombinatie. Incubeer de cultuur gedurende 12 tot 20 uur bij 37 graden Celsius met schudden bij 160 tot 180 omwentelingen per minuut.

Voeg voor elke liter LB-medium de antibiotica en 10 milliliter van 40% gewicht per volume steriele gefilterde glucoseoplossing toe. Voeg vervolgens 20 milliliter van de dicht gegroeide voorkweek toe aan dit medium. Incubeer vervolgens de cultuur bij 37 graden Celsius met schudden bij 160 tot 180 omwentelingen per minuut.

Controleer de absorptie van de cultuur bij 600 nanometer in regelmatige intervallen. Zodra de absorptie 0,5 tot 0,6 bereikt, induceer eiwitexpressie door 0,2 millimolair IPTG toe te voegen. Incubeer vervolgens de cultuur gedurende drie uur bij 37 graden Celsius met schudden.

Na drie uur oogst de cellen door centrifugatie bij 4.100 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, met behulp van een swing-out rotor. Expel na de centrifugatie het supernatant. Resuspendeer het cellenpellet in 20 milliliter GST-bindingsbuffer voor CENP-F en his zes-bindingsbuffer voor karyoferine alfa voor elke liter cultuur.

Bewaar vervolgens de cellen bij minus 80 graden Celsius. Om CENP-F te zuiveren, ontdooi eerst de cellen met CENP-F-construct. Pas vervolgens het volume aan tot 20 milliliter met een GST-bindingsbuffer.

Voeg eenmaal het volume is aangepast alle reducerende middelen en de proteaseremmers achter elkaar toe om de celsuspensie voor te bereiden op lyse. Breng vervolgens de celsuspensie over in een glazen beker en dompel de beker in een ijswaterbad. Soniceer vervolgens de cultuur.

Na sonicatie voeg 250 micromolair PMSF toe aan het lysate, inspecteer vervolgens het lysate, dat in dit stadium transparant zou moeten zijn. Centrifugeer vervolgens het lysate bij 12.000 tot 40.000 keer G gedurende 25 minuten bij vier graden Celsius. Bereid vervolgens de kolom voor door twee milliliter glutathion-agarose één op één slurry toe te voegen aan een wegwerpchromatografiekolom.

Om de kolom te gelijken, was deze eerst met 25 milliliter ultrapuur water en vervolgens 25 milliliter GST-bindingsbuffer. Zodra de centrifugatie voorbij is, decanteer het supernatant en filter het supernatant vervolgens door een 0,2 micrometer-gietmaat. Giet vervolgens het lysate op de geblokkeerd kolom voor de bindingsstap.

Dompel de kolom af en incubeer deze gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met zachtjes nutatie en vermijd schuimvorming. Na 30 minuten brengt u de kolom op een rek en laat de hars sedimenteren. Verzamel vervolgens de doorstroming en was de kolom tweemaal met 25 milliliter GST-bindingsbuffer.

Zodra het wassen voltooid is, sluit u de kolom opnieuw. Voeg vervolgens 400 microliter GST-bindingsbuffer en 250 microliter PS-protease-voorraad toe aan de kolom met een activiteit van 1000 eenheden per milligram. Afdek de kolom opnieuw en swiep de kolom voorzichtig om de hars in de buffer te hersuspenderen, en incubeer de kolom vervolgens gedurende 16 tot 20 uur bij vier graden Celsius.

Na de incubatieperiode voegt u vier milliliter GST-bindingsbuffer toe om het CENP-F-fragment uit de kolom te elueren dat proteolytisch is gekliefd. Om het GST-label opnieuw te elueren, sluit u de kolom opnieuw. Voeg vervolgens vier milliliter GST-elutiebuffer met glutathion toe aan de kolom.

Incubeer vervolgens de kolom gedurende 10 minuten om het gebonden GST-label te elueren. Verzamel na 10 minuten het eluaat. Voer vervolgens SDS-poly