Name: Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Leer een in vitro kinase-assay om Cdk1-specifieke fosforyleringsplaatsen in eiwitten te identificeren. Deze methode biedt inzicht in celcyclusregulatie en kan worden toegepast op diverse modelorganismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California in Berkeley voor spectrometrische analyse en nuttige opmerkingen. Wij danken Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, instituten voor biologische wetenschappen, Chinese Academie van Wetenschappen, Shanghai, China voor het verstrekken van een full-length RETOREN-F-constructie. Tot slot bedanken wij Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan en Dr. Christof Grewer aan de Binghamton University voor toegang tot apparatuur. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Research Foundation voor de State University of New York en het departement chemie, State University of New York at Binghamton.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onze kinase in vitro assay is een zeer krachtige methode om het identificeren van moleculaire targets voor de kinase Cdk1, die een hoofdbesturing van de celcyclus en regelt veel belangrijke cellulaire processen. De methode wordt bepaald of een gezuiverde proteïne een substraat voor Cdk1 is en identificatie van specifieke fosforylatie sites kunt. Dit vergemakkelijkt het mechanistische studies voor de regulatie van cellulaire processen door fosforylering via Cdk1.
De meest kritische fac...

Kinases zijn enzymen die overdracht van fosfaat groepen van ATP op substraten en veel cellulaire processen regelen. Deze fosforylatie is omkeerbaar, snel, voegt twee negatieve ladingen, vrije energie worden opgeslagen en is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties gebruikt door cellen. Cdk1, die ook bekend staat als celdeling cyclus eiwit 2 homolog (cdc2) is een meester-controller voor de celcyclus in alle eukaryoten1,2,3,4,5, en kinaseenzym een naar schatting 8-13% van de Proteoom6,7.
Terwijl recente proteomic studies dat veel fosforylatie plaatsen in eiwitten, in de meeste gevallen gebleken is de kinase verantwoordelijk voor deze wijzigingen onbekend. Het aantal bekende Cdk1 doelen, met name in menselijke cellen is laag7. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites is belangrijk, omdat hierdoor mechanistische studies die stellen hoe Cdk1 controleert de celcyclus. Celcyclus-verordening is belangrijk voor trouwe chromosoom segregatie en celdeling, en een groot aantal cellulaire processen moeten optreden ter ondersteuning van deze belangrijke fysiologische functie. Dit omvat stoppen transcriptie en vertaling vóór het begin van de mitose, evenals een dramatische reorganisatie in cellulaire structuur en organisatie, zoals de demontage van de nucleaire envelop chromosoom condensatie en de mitotische spindel vergadering. Deregulering en fouten in deze processen veroorzaken kanker, aangeboren afwijkingen of mitotische celdood. Specifieke remmers van Cdk1 zoals RO-3306 waren ontwikkelde8, die bieden krachtige hulpprogramma's voor functionele studies, en sommige van deze remmers zijn momenteel in klinische proeven voor de behandeling van kanker (Zie9 voor beoordeling).
Hier beschrijven we een in vitro kinase bepaling die het mogelijk de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites maakt. In deze test, wordt commercieel beschikbare menselijke Cdk1/cycline B gebruikt om een gezuiverde doel eiwit in vitrophosphorylate. Fosforylering van een substraat verhoogt zijn massa en voegt twee negatieve ladingen; Dus, succesvol fosforylatie wordt bevestigd door een opwaartse verschuiving van de band van de gel eiwit op SDS-pagina. Cdk1-specifieke fosforylatie sites worden vervolgens geïdentificeerd door analyse van de Spectrometrie van de massa van het eiwit in vitro phosphorylated. Steun met experimenteel design, bekijken we ook computerhulpmiddelen en referenties voor de voorspelling van Cdk1-specifieke fosforylatie sites van de eiwit-reeks. Daarnaast beschrijven we ook zuivering protocollen die zeer zuiver en homogene eiwit preparaten geschikt voor de kinase assay opleveren. Tot slot, de geïdentificeerde fosforylatie sites moeten worden gecontroleerd door functionele studies, en een eenvoudige bindende test wordt hier beschreven voor dat doel. Gecombineerd, is dit een zeer krachtige aanpak waarmee de opbrengsten Cdk1-specifieke fosforylatie sites en kunnen mechanistisch onderzoek naar hoe Cdk1 de celcyclus7,10,11 controleert. Aangezien deze methode is gebaseerd op zuivere eiwitten, kan het worden toegepast op elk model organisme en opbrengsten betrouwbare resultaten. Functionele controle van de verkregen fosforylatie sites in vitro wordt echter aanbevolen, zoals cellen extra regulerende mechanismen, zoals posttranslationele modificaties, interactie partners of cellulaire lokalisatie op plek hebben die fosforylering sites kan toegankelijk of ontoegankelijk voor erkenning door Cdk1 maken.
Cdk1 herkent een consensus fosforylatie site die uit (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), bestaat waarbij X een residu en een serine of threonine de site van fosforylering is. Vooral belangrijk voor erkenning is de aanwezigheid van de proline in de + 1 positie. Bovendien, fundamentele residuen in de + 2 of + 3 posities zijn voorkeur, met de meeste Cdk1-specifieke fosforylatie sites met een Lys of Arg op de + 3 positie6,12.
Activering van Cdk1 strak geregeld is en leidt tot het begin van de mitose1,2,3,4,5. De activiteit van cycline-afhankelijk kinases is in het algemeen afhankelijk van hun associatie met verschillende cyclinen (cycline A, B, C, D en E bij de mens), die op het niveau van de celcyclus13oscillerende zijn uitgedrukt. Cdk1 expressie is constant over de celcyclus en de regulering van de activiteit is afhankelijk van zijn associatie met de regelgevende subeenheden A cycline en cycline B5,13,14,15, als goed als posttranslationele modificaties. Vorming van het B-complex met Cdk1/cycline is vereist voor de kinase activation5,14,15,16,17,18. In de G2-fase, is cycline B vertaald in het cytosol en geïmporteerd in de kern waar het bindt aan de Cdk15,14,15,16,17,18; echter de Cdk1/cycline B geïnactiveerd door fosforylering op residuen van Thr14 en Tyr15 door de menselijke Cdk1-remmende kinases Myt1 (membraan-geassocieerde tyrosine - en threonine-specifieke cdc2-remmende kinase) en Wee1, respectievelijk19, wordt gehouden 20,21. In de late fase van de G2, defosforylerings van Thr14 en Tyr15 door celdeling cyclus 25 fosfatase (cdc25) het kinaseactiviteit van de Cdk1/cycline B complex activeert en triggers van de initiatie van mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. phosphorylation van Thr161 is ook vereist voor Cdk1/cycline B activering en wordt gemedieerd door Cdk7, de Cdk-activeren kinase (CAK)18. Afbraak van cycline B in anafase inactiveert Cdk1, zodat de uitgang van mitose24,25. Activering van Cdk1/cycline B is dus een ingewikkeld proces. Het protocol hier gepresenteerd wordt uitgevoerd met verkrijgbare Cdk1/cycline B. Tijdens de recombinante uitdrukking van dit complex in insect cellen, het is geactiveerd in vivo door endogene kinases14,20 en blijft actief in de gezuiverde staat. De resulterende actief, recombinante menselijke Cdk1/cycline B is geschikt voor in vitro kinase testen.
Hier beschrijven we een protocol voor de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites in de menselijke centromeer eiwit F (RETOREN-F)10. RETOREN-F is een kinetochoor eiwit dat zich bevindt in de kern gedurende het grootste deel van de interfase (G1 en S-fase) en wordt geëxporteerd naar het cytosol in de G2 fase26,27,28 in een Cdk1-afhankelijke wijze10, 11. nucleaire localisatie wordt verleend door een bipartiete cNLS26. cNLSs worden herkend door de nucleaire vervoer factor karyopherin α, dat, samen met karyopherin β en RanGDP, de invoer van cNLS-cargo in de nucleus29 vergemakkelijkt. Nucleaire export in de G2-fase wordt bevorderd via een onbekende export traject10. Zodra RETOREN-F in het cytosol woont, het wordt gerekruteerd om de nucleaire envelop en op zijn beurt werft de motor eiwit complex dynein30,31. Dit traject is belangrijk om de positie van de respectieve aan de centrosoom kern tijdens de eerste stadia van de mitotische spindel vergadering in een dynein-afhankelijke manier, dat belangrijk voor de juiste timing van de mitotische ingang en voor een fundamentele proces in de hersenen is ontwikkeling30,31,32. Beginnend in de G2-fase, is RETOREN-F ook samengevoegd tot de kinetochoor waar het heeft een belangrijke rol voor trouwe chromosoom segregatie27,28,33,34,35 . Een belangrijke regelgevende stap van deze trajecten is de nucleaire export van RETOREN-F in de G2-fase, die afhankelijk is van Cdk110,11. We beschrijven hier een protocol voor de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites in de cNLS van RETOREN-F. Phosphomimetic mutaties van deze sites is vertragen van nucleaire invoer van RETOREN-F, suggereren dat Cdk1/cycline B direct cellulaire lokalisatie van RETOREN-F door fosforylering van de cNLS10regelt.
Globaal, dit kinase in vitro assay maakt het mogelijk de identificatie van specifieke substraten voor de kinase Cdk1. Purified doel eiwitten gefosforyleerd in vitro door de verkrijgbare Cdk1/cycline B-complex en de fosforylatie sites zijn vervolgens worden geïdentificeerd door de Spectrometrie van de massa. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites ondersteunt mechanistische studies die onthullen hoe Cdk1 controleert de celcyclus.

<table><tbody><tr><td>2800 mL baffled Fernbach flask</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>benzamidine hydrochloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>bottletop filter</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (residues 2987 &ndash; 3065) pGEX6P1 plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L methionine</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td>125650010</td><td></td></tr><tr><td>desalting pipet tips: Zip tips</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization Fourier transform ion</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>cyclotron resonance mass spectrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td><td>Bruker Amazon</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC system: Äkta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutathione, reduced</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>incubation shaker: multitron shaker</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin α pet-28a pres plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (0.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmid</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS protease: PreScission protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag acrylamide</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>reduced gluthathione</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>swing out rotor TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van cycline-afhankelijk kinase 1 specifieke fosforylatie sites door een kinase in vitro assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) is een meester-controller voor de celcyclus in alle eukaryoten en kinaseenzym van naar schatting 8-13% van de Proteoom; het aantal vastgestelde doelstellingen voor Cdk1, met name in menselijke cellen is echter nog steeds laag. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites is belangrijk, aangezien zij mechanistische inzicht verwerven in hoe Cdk1 de celcyclus controleert. Celcyclus verordening is essentieel voor trouwe chromosoom segregatie en gebreken in dit ingewikkelde proces leiden tot chromosoomafwijkingen en kanker.
Hier beschrijven we een in vitro kinase test die wordt gebruikt voor het identificeren van Cdk1-specifieke fosforylatie sites. In deze test, is een gezuiverde eiwit gefosforyleerd in vitro door commercieel beschikbare menselijke Cdk1/cycline B. Successful fosforylatie wordt bevestigd door SDS-PAGE en fosforylering sites worden vervolgens geïdentificeerd door massaspectrometrie. Ook beschrijven we zuivering protocollen die opbrengst zeer zuiver en homogene eiwit preparaten geschikt voor de kinase-bepaling en een bindende bepaling voor de functionele verificatie van de geïdentificeerde fosforylatie sites, die de interactie tussen probes een klassieke nucleaire localisatie signaal (cNLS) en haar nucleair vervoer receptor karyopherin α. Om te helpen met de proefopzet, bekijken we methoden voor de voorspelling van Cdk1-specifieke fosforylatie sites uit proteïne sequenties. Deze protocollen presenteren samen een zeer krachtige aanpak waarmee de opbrengsten Cdk1-specifieke fosforylatie sites en kunnen mechanistisch onderzoek naar hoe Cdk1 de celcyclus controleert. Aangezien deze methode is gebaseerd op zuivere eiwitten, kan het worden toegepast op elk organisme en opbrengsten betrouwbaar modelresultaten, vooral wanneer gecombineerd met functionele studies van de cel.

We hebben onlangs een in vitro kinase assay (Figuur 1) gebruikt ter identificatie van de Cdk1-specifieke fosforylatie sites in een fragment van de RETOREN-F die deel uitmaakt van een cNLS10. Dit signaal verleent nucleaire localisatie van RETOREN-F gedurende het grootste deel van de interfase. In de G2-fase, wordt RETOREN-F geëxporteerd van de kern naar het cytosol in een Cdk1-afhankelijke manier. Met het oog op een mechanistis...

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Het algemene doel van deze in vitro kinase-test is om fosforylatieplaatsen in een eiwit van belang te identificeren die specifiek zijn voor de kinase cycline-afhankelijke kinase 1. De identificatie van CDK1-specifieke fosforylatieplaatsen is belangrijk omdat ze mechanistische inzichten bieden in hoe CDK1 de celcyclus controleert. Regulatie van de celcyclus is cruciaal voor de volledige segregatie van chromosomen en defecten leiden tot chromosomale afwijkingen en kanker.Het grootste voordeel van deze techniek is dat deze werkt met gezuiverde eiwitten, daarom kan het worden toegepast op elk modelorganisme en levert het betrouwbare resultaten op, vooral in combinatie met functionele studies in cellen. Deze methode is belangrijk omdat het bekende aantal CDK1-doelen nog steeds laag is, ondanks het feit dat CDK1 naar schatting acht tot 13% van het proteum fosforyleert. Hoewel deze methode CDK1-specifieke fosforylatieplaatsen identificeert, kan het worden aangepast om fosforylatieplaatsen voor andere kinasen te identificeren, op voorwaarde dat de gezuiverde kinase beschikbaar is.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de voorwaarden voor de kina

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit...

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.

Studie van de functies en activiteiten van Neuronale K-Cl Co-Transporter KCC2 met behulp van Western Blotting

Leer een in vitro kinase-assay om Cdk1-specifieke fosforyleringsplaatsen in eiwitten te identificeren. Deze methode biedt inzicht in celcyclusregulatie en kan worden toegepast op diverse modelorganismen.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Meer video's verkennen