De Plant infectie Test: Spray en wond-gemedieerde inoculatie met de Plant Pathogen Magnaporthe Grisea
4 augustus 2018
Hier presenteren we een protocol om te testen van de virulentie van de plant met de plant pathogen Magnaporthe grisea. Dit verslag zal bijdragen tot de grootschalige screening van de biotypen van schimmels isolaten en dienen als een uitstekend uitgangspunt voor het begrijpen van de resistente mechanismen van planten tijdens de moleculaire veredeling.
Deze video kan helpen bij het uitleggen van belangrijke methoden op het gebied van planteninfectie, zoals vrije en gewenste gemedieerde inoculatie met de plantenpathogeen Magnaporthe grisea. Het grote voordeel van deze techniek is dat het sproeien en verwonden protocol bijdraagt aan het snel, nauwkeurig en grootschalig screenen van de pathotypes van schimmelisolaten. De implicaties van deze techniek hebben betrekking op de studie van fysiologie om plantenpathogenen te bestrijden, omdat het erg belangrijk is voor de preventie en bestrijding van grootschalige plantenziekten.
Deze methode kan inzicht geven in het conserveringsmechanisme van pathogenen bij schimmels. Het kan ook worden toegepast op de belangrijkste variëteiten van landbouwplanten zoals rijst of gerst. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen, omdat het moeilijk is om conidia voorzichtig te schrabben met de steriele katoenen wattenstaafjes.
De demonstratie van deze methode is cruciaal als een verzameling schraapse wonden zonder de bladeren te doorboren, omdat de belangrijkste manier van afgenomen rijst- of gerstbladeren moeilijk is. Om te beginnen weeg 30 tot 50 gram havermout af. Voeg de havermout toe aan 800 milliliter gedistilleerd gedeïoniseerd water en kook het mengsel 30 minuten in een elektrische pan.
Filter vervolgens de gekookte havermoutmix door een stuk gaas in een beker. Voeg vervolgens 150 milliliter tomatensaus en 20 gram agar toe aan de beker. Voeg gedistilleerd gedeïoniseerd water toe aan de beker tot 1000 milliliter.
Laat ongeveer 50 rijstzaden 3 dagen weken in gedistilleerd gedeïoniseerd water, wikkel de zaden in bevochtigd gaas en laat ze ontkiemen op vochtige filterpapier in Petri-schijven. Plant vervolgens de zaailingen in potten met gesteriliseerde potgrond. Na het water geven bedekt u ze met een laag vermiculiet.
Plaats de zaailingen in een kas die op 25 graden Celsius wordt gehouden gedurende een tot twee weken. Gebruik vervolgens steriele chirurgische scharen om drie lagen filterpapier in cirkels van acht centimeter te snijden. Plaats de filterpapiercirkels op 100 millimeter steriele plastic platen.
Voeg net genoeg gedistilleerd gedeïoniseerd water toe aan elke schaal om het filterpapier te weken. Plaats vervolgens twee steriele tandenstokers twee tot drie centimeter uit elkaar in elk kweekschaaltje. Twee weken na het zaaien verzamelt u de bladeren van de rijstplanten door het onderste deel van de stengel af te snijden.
Kweek de M.grisea-stammen op OTA-platen bij 25 graden Celsius gedurende vier dagen met behulp van een thermostaatincubator. Gebruik vervolgens een pipet om twee milliliter gedistilleerd gedeïoniseerd water aan elke plaat toe te voegen. Gebruik een inoculatielus om de mycelia van de wilde type- en mutante stammen in het myceliumdebris te schrabben.
Verzamel het myceliumdebris en breng het over naar een nieuwe OTA-plaat. Droog vervolgens het myceliumdebris op een schone bank. Voeg twee milliliter gedistilleerd gedeïoniseerd water toe aan de gekweekte myceliumschaal en gebruik een steriele katoenen wattenstaafje om voorzichtig de conidia te schrabben.
Filter de conidia-suspensie door twee lagen lenspapier en breng de suspensie over naar een nieuwe 50 millimeter buis. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende vijf minuten bij 5000 keer g. Verwijder na centrifugatie het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw met Tween-20-oplossing, wat resulteert in een concentratie van 20.000 conidia per milliliter.
Plaats de suspensie in een handbediende sproeier en spuit ongeveer 10 milliliter van de conidia-suspensie op de bladeren van de twee weken oude rijstplanten. Spuit de bladeren van de controleplanten met de Tween-20-oplossing. Incubeer de bladeren vervolgens 24 uur in een donkere, vochtige doos.
Breng de bladeren vervolgens over naar een vochtige kamer met fluorescentielicht gedurende 12 uur. Gebruik een anatomische naald om drie wonden van twee tot drie centimeter lang in de hoofdnerven van afgenomen rijstbladeren te schrabben. Plaats de geschraapte bladeren op tandenstokers en spuit ze met Tween-20-oplossing.
Snij vervolgens een halve bij halve centimeter myceliale plug uit de OTA-platen die elk M.grisea-stam bevatten. Plaats de pluggen op de gewonde bladeren en incubeer ze gedurende drie tot acht dagen in een vochtige kamer bij 25 graden Celsius. Na de incubatieperiode onderzoek en evalueer de laesies volgens het scoresysteem dat wordt verstrekt door het International Rice Research Institute.
Fotografieer tenslotte de aangetaste bladeren om de besmettelijkheid van de geteste stammen te evalueren. In dit protocol werden planteninfectietests met M.grisea-stammen P131 en Com1 uitgevoerd op vatbare rijstzaailing. De geïnoculeerde wilde type bladeren van P131 vertoonden de typische robuuste laesies van rijstblast.
Echter, de Com1 geïnoculeerde bladeren vertoonden duidelijke infectiedefecten en veroorzaakten geen volledige infectie. Om te bepalen of M.grisea gastheercellen kon infecteren via wonden, werden afgeschraapte bladeren van wilde type planten geïnoculeerd met myceliumpluggen of conidia-druppeltjes. De met spuit geïnoculeerde bladeren vertoonden geen infectiedefecten.
In tegenstelling tot de bladeren die via myceliale pluggen werden geïnoculeerd, vertoonden deze duidelijke defecten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om drie wonden van twee tot drie centimeter lang in de hoofdnerven van de afgenomen rijstbladeren te schrabben. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals ziekteverwekker inoculatie, worden uitgevoerd om gewasziekteresistentie te identificeren en te analyseren.
Na de ontwikkeling van deze techniek ligt de weg open voor onderzoekers op het gebied van plantenpathogenen om de rijstblastziekte in moderne organismen te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met Magnaporthe grisea gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het testen van plantvirulentie met behulp van de plantpathogeen Magnaporthe grisea. De methode faciliteert snelle en grootschalige screening van schimmelpathotypes, wat bijdraagt aan ons begrip van plantresistentiemechanismen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantpathologie
- Interacties tussen plant en micro-organisme
- Schimmelpathogenese
Achtergrond
- Magnaporthe grisea is een belangrijk plantpathogeen.
- Inzicht in plantresistentie is cruciaal voor gewasbescherming.
- De studie naar schimmelpathotypes helpt bij de ontwikkeling van resistente plantvariëteiten.
- Grootschalige screeningtechnieken zijn essentieel voor effectief onderzoek.
Doel van de studie
- Om een protocol vast te stellen voor het testen van plantvirulentie tegen Magnaporthe grisea.
- Om het begrip van plantresistentiemechanismen te vergroten.
- Om grootschalige screening van schimmelisolaten te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Vrije en wondgebaseerde inoculatietechnieken.
- Sproei- en wondprotocollen voor snelle screening.
- Gebruik van steriele wattenstaafjes voor het afschrapen van conidia.
- Toepassing op diverse landbouwgewassen zoals rijst en gerst.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt nauwkeurige screening van schimmelpathotypes mogelijk.
- Er wordt inzicht geboden in de conservatiemechanismen van pathogenen.
- De methode is toepasbaar op meerdere gewasvariëteiten.
- Uitdagingen voor beginners omvatten de techniek van het afschrapen van conidiën.
Conclusies
- Dit protocol is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers in de plantpathologie.
- Het draagt bij aan het begrip van plantresistentie tegen pathogenen.
- Toekomstige toepassingen kunnen strategieën voor de preventie van gewasziekten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Dit protocol maakt een snelle, nauwkeurige en grootschalige screening van schimmelpathotypes mogelijk ter ondersteuning van targetvalidatie bij plantresistente veredeling. Door variabelen van wond-gemedieerde infectie te isoleren, vermindert het storende effecten van penetratieresistentie van de gastheer, waardoor het voorspellend vertrouwen in virulentie-assays wordt verbeterd. De methode faciliteert mechanische risicoreductie van pathogeen-gastheerinteracties voor translationeel onderzoek naar gewasbescherming.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door wond-gemedieerde infectie te isoleren om pathogeniteitsmechanismen van virulentie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door gestandaardiseerde inoculatie, waardoor interferentie door penetratieresistentie van de gastheer wordt vermeden.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door kwantitatieve laesiescoring te bieden voor functionele validatie van resistentiefactoren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows via snelle, grootschalige pathotype-screening van Magnaporthe grisea-isolaten.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via gecontroleerde wondings- en spray-inoculatieprotocollen.
- Schaalbaarheidswaarde: Benadrukt de screeningreadiness en het hergebruik van het platform voor het evalueren van diverse schimmelstammen over verschillende gewasvariëteiten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers via scoresystemen voor laesies die gekoppeld zijn aan virulentiefenotypes.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door een consistente beoordeling van de pathogeniciteit mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt beslissingen over de isolatie van resistentiegenen en moleculaire veredeling op basis van de kwantificering van infectiedefecten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode bevindt zich in de fase tussen vroege ontdekking en de identificatie van leads door hypothesetests van virulentiefactoren en pathway-verduidelijking in plant-schimmelinteracties mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetesten, pathway-verduidelijking of biologisch risicobeheer ondersteunt via wond-gemedieerde isolatie van infectievariabelen.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid of kwantitatieve outputs via gestandaardiseerde bereiding van conidiale suspensies en laesie-evaluatie.
- Analytics: Benadrukt metingen, readouts of statistische outputs die teams helpen om condities te vergelijken met behulp van de scoringssystemen van het International Rice Research Institute.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming door laesie-fenotypes te koppelen aan de karakterisering van resistentiegenen.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek voor brede toepassingen in pathogenicity-screening.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, validatie van targets en vermindering van mechanistische ambiguïteit bij de beoordeling van virulentie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de screening van schimmelpathotypes tussen verschillende laboratoria.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium in programma's voor de kweek van gewasresistentie.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve virulentieprofilering.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in fytopathologie, microbiologie en aseptische technieken voor het hanteren van conidia.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten thermostatische incubatoren, centrifuges, vochtkamers en systemen voor het imagen van laesies.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams met betrekking tot consistentie van het beschadigen, de bereiding van het inoculum en de naleving van het scoringsprotocol.
- Overwegingen voor adaptatie in verschillende modelsystemen, zoals rijst, gerst en andere landbouwkundig relevante planten.
- Praktische beperkingen op basis van het bronmateriaal omvatten de moeilijkheid voor beginners om conidia voorzichtig af te krabben met steriele wattenstaafjes.
