Isolatie van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen voor In Vitro Decidualization

Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in de reproductieve geneeskunde te beantwoorden over de onderliggende moleculaire mechanismen van decidualisatie, en het begrijpen van de rollen van specifieke genen in endometriale stromale celdecidualisatie. Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor de isolatie van humane endometriale stromale cellen en daaropvolgende kunstmatige decidualisatie door de aanvulling van hormonen op het kweekmedium. De expressie van hormonale verandering, zoals prolactine en insulin-achtige groeifactor-bindend eiwit één, kan worden gebruikt om de mate van decidualisatie te bevestigen en te kwantificeren.

Belangrijk is dat de levensvatbaarheid van dit protocol om genspecifiek knockdown uit te voeren ook wordt aangetoond. Breng de biopsie met gesteriliseerde forceps over in een 50 milliliter buis met tien milliliter vers HBSF, gevolgd door centrifugatie bij 500x G gedurende 90 seconden. Gebruik een 1 mL pipet om het medium te verwijderen en voeg drie mL voorverwarmd hES isolatiemedium toe.

Decanteer de biopsie in een 10 centimeter schaal met vijf mL hES isolatiemedium en begin met het snijden met behulp van Dumont 5 forceps en fijne rechte naainaalden gedurende ongeveer 20 minuten. Gebruik een 1 mL pipet om de gesneden biopsie over te brengen in een nieuwe 50 mL buis en voeg een extra zeven mL hES isolatiemedium toe aan de schaal om de resterende stukken over te brengen naar de 50 mL buis. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende twee minuten bij 800x G en verwijder het supernatant met behulp van een 1 mL pipet.

Filter vervolgens de DNase-1 en collageenase verteringsmix door een 0,2 micron filter dat is bevestigd aan een 10 milliliter spuit direct op de pellet. Vortex de buis vervolgens gedurende 10 seconden om de pellet te resuspenderen en incubeer gedurende 90 minuten in een waterbad. Na elke 10 minuten, vortex de buis gedurende 10 seconden om ervoor te zorgen dat het weefsel goed is verteerd.

Na incubatie, filter de suspensie door een 40 micron celzeef die is gestapeld over een nieuwe 50 milliliter buis om de stromale cellen te herstellen, en centrifugeer vervolgens de verzamelde cellen bij 800x G gedurende 2,5 minuten. Na centrifugatie, verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een 1 milliliter pipet, zorg ervoor dat het cellenpellet niet wordt verstoord. Resuspendeer vervolgens het cellenpellet in 10 milliliter vers hES isolatiemedium, gevolgd door centrifugatie bij 800x G gedurende 2,5 minuten.

Na centrifugatie, aspireer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in zes milliliter vers hES medium. Vervolgens, om bloedcellen te verwijderen, plaats de gesuspendeerde cellen langzaam in een laag op drie milliliter dichtheidsgradiënt medium en centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 400x G. Na centrifugatie, verzamel het supernatant zonder het dichtheidsgradiënt medium te verstoren.

Voeg vervolgens hES medium toe om het totale volume op tien milliliter te brengen en centrifugeer het monster opnieuw gedurende 2,5 minuten bij 800x G. Na centrifugatie, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in zes milliliter hES medium. Plateer vervolgens de cellen in een 75 centimeter fles door zes milliliter van de celresuspensie en tien milliliter hES medium aan de fles toe te voegen, gevolgd door zachtjes mengen door de fles te schudden.

Na het plateren, controleer de celdichtheid onder de microscoop en kweek vervolgens de cellen in een 5% koolstofdioxide incubator gedurende drie tot vijf dagen, zorg ervoor om het hES medium om de twee dagen te verversen. Na 48 uur zouden de cellen als een monolaag moeten groeien. Over het algemeen bereiken cellen na vijf dagen 80 tot 90% confluency in een 75 centimeter fles.

Voor siRNA-transfectie, begin met het plateren van 800.000 cellen per put in een zes-putten plaat in triplicates voor elke conditie, en incubeer de cellen in een 5% koolstofdioxide incubator gedurende twee dagen om voor te bereiden op transfectie. Na twee dagen, voeg 150 microliter Opti-MEM serumvrij medium toe in een vijf mL buis, gevolgd door de toevoeging van vijf microliter transfectie reagens. Meng goed door inversie en incubeer gedurende vijf minuten.

Voeg vervolgens 100 microliter Opti-MEM serumvrij medium toe in een nieuwe vijf mL buis, gevolgd door de toevoeging van 16 nanomolen SRC-2 siRNA. Voeg vervolgens 100 microliter Opti-MEM serumvrij medium toe in een vijf mL buis, gevolgd door de toevoeging van 16 nanomolen controle siRNA. Na incubatie, combineer het verdunde transfectie reagens met de SRC-2 siRNA en meng goed door voorwaarts en achterwaarts te pipetteren.

Combineer vervolgens het verdunde transfectie reagens met de controle siRNA en meng goed door voorwaarts en achterwaarts te pipetteren. Incubeer vervolgens de complexen gedurende vijf minuten. Tijdens deze incubatie, aspireer het hES medium en voeg een milliliter verversingsmedium toe aan elke put.

Na vijf minuten incubatie, centrifugeer de complexen gedurende twee minuten bij 500x G om de oplossing te verzamelen. Voeg vervolgens 250 microliter van de siRNA transfectie reagens complexen toe aan elke put met cellen en medium en meng door zachtjes te schudden, gevolgd door incubatie in een 5% koolstofdioxide incubator gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius. Na vijf uur, aspireer het medium en ververs naar hES medium en vervolg de incubatie gedurende twee dagen ter voorbereiding op een in-vitro decidualisatie assay.

Na 48 uur transfectie en voorafgaand aan het starten van de in vitro decidualisatie assay, verzamel de dag nul controle siRNA en SRC-2 siRNA getransfecteerde cellen. Aspireer eerst het medium en was met een mL PBS per put. Verwijder vervolgens het PBS en voeg 300 microliter RNA lyse buffer per put toe en incubeer gedurende drie minuten.

Na drie minuten incubatie, verzamel de cellen in RNA lyse buffer in een 1,5 ml buis voor latere downstream analyse. Bereid vervolgens het EPC medium voor door de geschikte hoeveelheid decidualisatie medium te verdelen en voeg 10 nanomolair estradiol, een micromolair medroxyprogesteronacetaat en 50 micromolair