Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren
7 juni 2018
Hier beschrijven we een methode om te scheiden en verrijken van de componenten van de tumor immuun en niet-immuun communicatie in gevestigde subcutane tumoren. Deze techniek maakt het mogelijk voor de afzonderlijke analyse van tumor immuun infiltreren en niet-immuun tumor breuken die uitgebreide karakterisering van de tumor immuun communicatie kunnen toestaan.
Het algemene doel van deze techniek is om een methode te bieden voor gelijktijdige profilering van zowel de immuun- als de kankercelfracties die bijdragen aan de immuunmicro-omgeving van solide tumoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de immuun-oncologie, zoals welke immuun- en niet-immuunveranderingen er optreden binnen de tumor na een bepaalde behandeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de effectieve verrijking van zowel immuun- als niet-immuuntumorcomponenten vergemakkelijkt, waardoor een grondige profilering van de immunologische toestand van de tumor mogelijk is.
Het algemene doel van deze methode is om het immuunmicro-omgeving van de tumor efficiënt te profileren en door behandeling geïnduceerde veranderingen te identificeren. Na het besproeien van de muis met 70%ethanol om besmetting door haar te voorkomen, verwijder je chirurgisch de subcutane tumoren, zorg ervoor dat de tumoren vrij zijn van enig besmettend weefsel. Plaats vervolgens elke tumor in 1,8 milliliter basis-RPMI 1640-medium zonder foetaal runderserum in individuele putjes van een 24-putsplaat op ijs.
Wanneer alle tumoren zijn verzameld, snij de monsters met schaar in stukken van minder dan één kubieke millimeter en voeg 200 microliter vers bereid 10X dissociatiecocktail toe met collagenase-1, collagenase-4 en DNase één aan elke put. Na één uur bij 37 graden Celsius, in een orbitale platenschudder bij 60 tot 100 RPM, neutraliseer je de reactie met één milliliter RPMI 1640-medium aangevuld met 5%FBS en twee millimolar EDTA, en gebruik je een aangepaste 1 milliliter pipettepunt om elk tumormengselmonster over te brengen naar individuele 50 milliliter kegelbuisjes met individuele 40 micrometer zeefjes. Gebruik een 10 milliliter spuitplunger om de tumorstukken mechanisch te desintegreren door de zeefjes, spoel elke zeef periodiek af met twee milliliter RPMI 1640-medium plus 5%FBS totdat de zeefjes vrij zijn van tumor.
Wanneer alle tumoren zijn gedissocieerd, voeg je medium toe aan elke buis zo nodig om alle monsters op hetzelfde volume te brengen en pellet de cellen door centrifugatie. Gebruik vervolgens een vijf milliliter serologische pipet om de pellets te resuspenderen in twee milliliter FBS-aangevuld medium per buis. Om de immuun- en tumorcelfracties te scheiden, voeg je drie milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan de bodem van één 15 milliliter kegelbuisje per monster en laat je langzaam twee milliliter tumorcelsuspensie langs de zijkant van elke buis op elke gradiënt druppelen.
Zorg ervoor dat de tumorcelsuspensies goed gemengd zijn voordat je ze lagen, dat de celsuspensies langzaam langs de zijkant van de buizen worden gepipetteerd en dat de buizen voorzichtig worden gehanteerd om vermenging van de lagen te voorkomen. Scheid de cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugering en verzamel voorzichtig de bovenste medium- en tumorinfiltrerende leukocytenlaag in één nieuw 15 milliliter buisje per monster. Gooi de resterende dichtheidsgradiëntmedium weg en resuspendeer de tumorpellets in twee milliliter medium plus FBS per buis.
Centrifugeer vervolgens alle monsters en resuspendeer de tumorinfiltrerende leukocyten in 200 microliter en de tumorcellen in twee milliliter medium plus FBS per buis op ijs. Om de cellen te plateren, label je één 96-wels U-bodemplaat voor elk immuunkleuringspaneel plus een extra plaat voor celtellingen en verdeel je de enkele celsuspensies in elk van de kleuringspaneelplaten en de calcplaat. Was de cellen twee keer met 200 microliter Dulbecco's PBS per monster en blokkeer de cellen met 50 microliter FC-blok per putje gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.
Aan het einde van de blokkeerincubatie, voeg je 50 microliter 2X geconcentreerd extracellulair targetingantilichaam en fixeerbaar viabiliteitskleuringsmengsel toe aan elke put voor een 30 minuten durende incubatie in het donker. Aan het einde van de kleuringsincubatie, was je de monsters twee keer met FACS-buffer en resuspendeer de pellets in 200 microliter fixatie- en permeabiliseringsoplossing overnacht bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. De volgende dag, verzamel je de cellen door centrifugatie, gevolgd door een wassing met 200 microliter permeabiliseringsbuffer per putje.
Label de cellen met 100 microliter intracellulair antilichaamkleuringspaneel in permeabiliseringsbuffer voor een 30 minuten durende incubatie in het donker, gevolgd door nog een wassing met permeabiliseringsbuffer. Was vervolgens de cellen opnieuw met FACS-buffer en resuspendeer de monsters in 300 microliter verse FACS-buffer voor hun analyse door middel van flowcytometrie. Tumordigestie, zoals aangetoond, met of zonder verrijking met dichtheidsgradiëntmedium, resulteert in een ongeveer 70 tot 90%levende gehele tumorcelpopulatie zoals beoordeeld door flowcytometrie.
Verrijking met dichtheidsgradiëntmedium bevordert een meer dan tweevoudige toename in de CD45-positieve tumorinfiltrerende leukocytenfractie, vergeleken met niet-verrijkte tumordigesties, evenals talrijke immuuncelsubsets die vaak worden waargenomen in immuunmicro-omgevingsstudies. De CD45-negatieve tumorcelfractie kan ook worden geprofileerd voor talrijke tumorkenmerken, zoals algemene tumorviabiliteit of apoptose, proliferatievermogen en de expressie van verschillende immunosuppressieve markers. Om te bepalen hoe myeloide en lymfocytaire immunologische subsets variëren in een enkele solide tumor, kan de tumor in vier gelijke delen worden verdeeld op een zodanige manier dat elk deel ongeveer gelijke intratumorale regio's bevat, evenals gelijke dermale en peritoneaalgerichte delen.
Elk stuk kan vervolgens afzonderlijk worden gedigesteerd en geanalyseerd, zoals aangetoond, op de aanwezigheid van verschillende immuuncelpopulaties. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier tot 8 uur worden voltooid, afhankelijk van hoeveel monsters je hebt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel maar efficiënt te werken om de celviabiliteit te behouden.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de dissociatie- en scheidingsstappen technieken om
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het scheiden en verrijken van componenten van de immuun- en niet-immuun tumoromgeving in gevestigde subcutane tumoren. De techniek maakt de analyse van het tumorimmuuninfiltraat en niet-immuun tumorfracties mogelijk, wat een uitgebreide karakterisering van de tumorimmuunomgeving faciliteert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Oncologie
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de immuunmicro-omgeving van de tumor is cruciaal voor de behandeling van kanker.
- Het profileren van immuun- en niet-immuuncomponenten kan onthullen welke veranderingen door de behandeling zijn geïnduceerd.
- Huidige methoden scheiden deze componenten mogelijk niet effectief.
- Deze studie introduceert een nieuwe techniek voor een betere analyse.
Doel van de studie
- Om een methode te bieden voor gelijktijdige profilering van immuun- en kankercelfracties.
- Om veranderingen in de tumormicro-omgeving na behandeling te identificeren.
- Om het begrip van immunologische tumortoestanden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bespuiten van de muis met 70% ethanol om contaminatie te voorkomen.
- Chirurgisch verwijderen van subcutane tumoren, waarbij contaminatie van het weefsel wordt vermeden.
- Plaatsen van tumoren in RPMI 1640-medium op ijs voor analyse.
- Gebruiken van een 24-well plaat voor de individuele verwerking van tumoren.
Belangrijkste resultaten
- De techniek verrijkt effectief immuun- en niet-immuuncomponenten van de tumor.
- Maakt een grondige profilering van de immunologische status van de tumor mogelijk.
- Faciliteert de identificatie van behandlings-geïnduceerde veranderingen.
- Biedt inzichten in de dynamiek van de tumoromgeving.
Conclusies
- Deze methode vormt een belangrijke vooruitgang in de analyse van de tumormicro-omgeving.
- Het kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de immuunoncologie.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek voor diepere inzichten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Een nauwkeurige karakterisering van de immuunmicro-omgeving van de tumor is essentieel voor het evalueren van de immunotherapeutische effectiviteit in preklinische modellen. Deze methode maakt de scheiding en verrijking van immuun- en niet-immuun tumorfracties mogelijk, wat bijdraagt aan een reproduceerbare profilering van behandelingsgeïnduceerde veranderingen. Het pakt een cruciale uitdaging in de ontdekkingsfase aan door de opbrengst en levensvatbaarheid van immuuncellen voor downstream flowcytometrie-analyse te verbeteren.
Strategische toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door tumor-infiltrerende leukocyten te isoleren voor fenotypische en functionele analyse.
- Operationele waarde: Verhoogt de opbrengst van CD45+ immuuncellen met meer dan tweemaal in vergelijking met standaard digestie, wat de detectie van zeldzame subsets verbetert.
- Voorspellend vertrouwen: Ondersteunt targetvalidatie door de cellulaire levensvatbaarheid te behouden en de beoordeling van immunosuppressieve markers in de tumorfractie mogelijk te maken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert levensvatbare enkelcel-suspensies die geschikt zijn voor multiplex antilichaamkleuring en flowcytometrische kwantificering van immuunsubsets.
- Operationele waarde: Standaardiseert tumordissociatie en densiteitsgebaseerde scheiding, waardoor variabiliteit tussen monsters en operators wordt verminderd.
- Klaarheid voor assay: Bereidt verrijkte immuun- en tumorfracties voor consistente immunofenotypering en functionele assays in drug-screening workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Maakt ruimtelijke profilering van immuunheterogeniteit mogelijk door afzonderlijke digestie van tumorkwadranten toe te staan, wat ondersteunend is voor biomarkercorrelatiestudies.
- Relevantie van Preklinische Modellen: Faciliteert de evaluatie van nieuwe immunotherapieën door het kwantificeren van door behandeling geïnduceerde verschuivingen in myeloïde en lymfocytenpopulaties.
- Mechanische Risicoreductie: Maakt parallelle analyse van tumorcelviabiliteit, apoptose, proliferatie en expressie van immunosuppressieve markers mogelijk, naast immuunprofilering.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de workflow voor discovery biology en maakt immuunprofilering mogelijk voorafgaand aan de fasen van lead-identificatie en preklinische validatie door gestandaardiseerde, levensvatbare tumorafgeleide celfracties te leveren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door immuun- en tumorcompartimenten te isoleren voor onafhankelijke analyse.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van immuuncellen die vergelijkingen tussen verschillende behandelcondities in immuno-oncologie-screens mogelijk maken.
- Analytics: Genereert flowcytometrie-compatibele single-cell suspensies met een hoge levensvatbaarheid (70–90%) en een verbeterde verrijking van immuuncellen voor gedetailleerde fenotypische analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische continuïteit door longitudinale immuunmonitoring binnen individuele tumoren mogelijk te maken.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een gestandaardiseerd dissociatie- en separatieprotocol dat toepasbaar is op meerdere subcutane tumormodellen en therapeutische interventies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in immuun-tumorinteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van tumorverwerking via gedefinieerde stappen voor enzymatische dissociatie en densiteitsgradiëntscheiding.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door kwantificeerbare immuun- en tumorcelresponsen op experimentele therapieën te verschaft.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunotherapeutische kandidaten mogelijk op basis van uitgebreide profilering van de immuunmicro-omgeving.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in aseptische tumorwinning, enzymatische digestie en technieken voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
- Afhankelijk van toegang tot orbitale schudmers, centrifuges, strainers en flowcytometrie-instrumentatie voor downstream-analyse.
- Vereist standaardisatie tussen teams om consistente timing van tumordissociatie, het legen van strainers en het aanbrengen van gradiëntlagen te garanderen om monstervermenging te voorkomen.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten het optimaliseren van de enzymconcentratie en incubatietijd voor verschillende tumortypen, terwijl de celviabiliteit behouden blijft.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van zorgvuldige mechanische disaggregatie om verstopping van strainers te voorkomen en het belang van het prompt verwerken van monsters om de viabiliteit te behouden.
