Name: Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer een methode voor het verrijken en karakteriseren van tumor immuun- en niet-immuunmicro-omgevingen in subcutane tumoren. Deze techniek maakt gelijktijdige profilering van immuun- en kankercelfracties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMN erkent financiële steun van het National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) en het nationale Instituut van Dental & craniofaciale onderzoek (F31DE026682) die zowel van de National Institutes of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Dit project was het ook ondersteund door het Cytometry en de cel Sorteren kern aan Baylor College of Medicine met financiële steun van de NIH (P30 AI036211 P30 CA125123 en S10 RR024574) en de deskundige hulp van Joel M. Sederstrom.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Baylor College of Medicine.
1. tumor oogst en spijsvertering
Opmerking: De tijd die nodig is voor de oogst is ~ 3-5 min/tumor, en de tijd die nodig is voor de verwerking is ~ 1 h + 2-3 min/tumor.
<ol><li>Muizen euthanaseren kooldioxide na inademing en spray elke muis omlaag met 70% ethanol voordat de oogst om te voorkomen dat haar besmetting. Chirurgisch verwijderen van subcutane tumoren uit de muizen en ervoor zorgen dat de tumoren gratis van alle contaminerende weefsel (dat wil zeggen, haren, huid, buikvlies, enz.). Elke tumor in 1.8 mL basis RPMI-1640 media zonder foetale runderserum (FBS) in een 24-well plaat plaatsen. Voor grotere oogsten, houd platen koud op ijs te behouden van cellulaire levensvatbaarheid. Opmerking: Als steriliteit vereist is, alle tumor dissecties zal moeten worden uitgevoerd in een kabinet met steriele chirurgische instrumenten (dat wil zeggen, schaar, pincet, enz.), alsmede verdere stappen inzake bioveiligheid. Tumoren met de langste diameter tussen 0,5 - 1 cm zijn optimaal en groter of kleiner tumoren vergt schalen van reagentia.</li>
	<li>Gebruik schaar te snijden de tumoren in minder dan 1 mm3 stuks binnen elk putje.</li>
	<li>Een 10 x spijsvertering cocktail bereiden door ontbinding collagenase ik op 10 mg/mL, collagenase IV op 2.500 U/mL, en DNase ik bij 200 U/mL in basis RPMI-1640 media (zonder FBS). Opmerking: De spijsvertering cocktail kan worden een dag van tevoren bereid en opgeslagen bij-20 ° C; langdurige opslag wordt echter niet aanbevolen, omdat enzymen activiteit na verloop van tijd eens ontbonden verliest.</li>
	<li>Voeg 200 µL van 10 x dissociatie cocktail met collagenase I, collagenase IV en DNase ik aan elk putje met de 1 mm3 stuks.</li>
	<li>Toestaan dat de monsters te verteren gedurende 1 uur bij 37 ° C terwijl licht schudden bij 60-100 rpm met behulp van een shaker orbitale plaat. Opmerking: De hoogte van temperatuur tot 37 ° C gedurende de enzymatische spijsvertering kan veroorzaken immuun cel activatie.</li>
	<li>Na 1 uur, de reactie te neutraliseren door toevoeging van 1 mL van RPMI-1640 media aangevuld met 5% FBS en 2 mM EDTA aan elk putje.</li>
	<li>Pipetteer de spijsvertering van de tumor en de resterende tumor stukken in een 40 µm cel zeef zit op de top van een centrifuge-tube van 50 mL. Opmerking: Knippen de tip off van een 1 mL pipet tip voor gemakkelijker doorgifte van de tumor vertering naar de zeef.</li>
	<li>Gebruik een 10 mL spuit zuiger om mechanisch gedesag de tumor stukken door de zeef. Regelmatig spoelen de zeef met 2 mL aangevuld RPMI-1640 media (met 5% FBS) en herhaal tot de cel zeef duidelijk van tumor is. Opmerking: Ongeveer 4-10 mL totale media toereikend te zijn om voldoende spoel de zeef van tumor. Opmerking: Leg monsters op ijs totdat deze stap is voltooid voor alle monsters voor het behoud van cellulaire levensvatbaarheid.</li>
	<li>Elke 50 mL centrifugebuis aan de media RPMI-1640 aangevuld met hetzelfde volume aanpassen. Opmerking: De aanpassing van het volume is van cruciaal belang voor het balanceren van de centrifuge. Deze stap overslaan kan resulteren in centrifuge schade of lichamelijk letsel.</li>
	<li>Centrifugeer de schorsingen van de cel (805 x g, 5 min, 4 ° C), gooi het supernatant en resuspendeer in 2 mL zuiver aangevuld RPMI-1640 media. Opmerking: Een cel aggregaat kan vormen na het centrifugeren dat moeilijk te resuspendeer. Gebruik een serologische Pipetteer 5 mL en meng snel te breken voordat u verdergaat.</li>
</ol>2. scheiding van immuun- en Tumor cellulaire breuken
Opmerking: De tijd die nodig is voor deze stap is ongeveer 1 uur.
<ol><li>Voeg 3 mL van de kleurovergang medium dichtheid aan de onderkant van een centrifugebuis 15 mL. Bereiden en label genoeg buizen voor elke tumor.</li>
	<li>De 2 mL celsuspensie tumor op de top van het medium dichtheid kleurovergang door pipetteren langzaam langs de zijkant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de twee lagen laag.</li>
	<li>Zorgvuldig plaats de gelaagde buizen in de centrifuge en spin voor 20 min op 805 x g, 20 ° C, met geen rem. Opmerking: Het is uitermate belangrijk om te controleren juiste balanceren en te waarborgen dat geen rem wordt gebruikt tijdens het centrifugeren. Verstoring van dit proces zal resulteren in het mengen van de laag en het herstel van de totale steekproef moeilijk zal zijn.</li>
	<li>Zorgvuldig overbrengen de tumor infiltreren leukocyten (TIL) laag en de media van de bovenste laag om een nieuwe tube van 15 mL met behulp van een precisiepipet overdracht. Verwijderen van alle resterende kleurovergang medium dichtheid en resuspendeer de pellet tumor aan de onderkant van de buis in 2 mL zuiver aangevuld RPMI-1640. Opmerking: Na het centrifugeren zal er vier zichtbare lagen van boven naar beneden die respectievelijk overeenkomen met: media, TILs, kleurovergang medium dichtheid en tumor cel pellet. Zie Figuur 2A voor een voorbeeld van de verschillende lagen.</li>
	<li>Centrifugeer beide de TIL en tumor monsters in aparte buizen (5 min, 805 x g, 4 ° C) en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de TIL monster in 200 µL en de tumor pellet in 2 mL zuiver aangevuld RPMI-1640 media. Houd op ijs te behouden van de levensvatbaarheid.</li>
</ol>3. plating en kleuring
Opmerking: De tijd die nodig is voor de plating is 30 s/tumor; de tijd die nodig is voor het oppervlak vlekken is 1 h; de tijd die nodig is voor de intracellulaire vlekken is 40 min; de tijd die nodig is voor stroom cytometry analyse 1 is - 4 min/tumor.
<ol><li>Bereiden en label een 96-Wells U-bodem plaat voor elke immuun kleuring paneel en een extra plaat voor cel telt. Opmerking: Normaal gesproken drie platen zijn bereid in totaal: een deelvenster lymfocyt gerichte plaat, een plaat myeloïde gerichte paneel en een cel tellen plaat.</li>
	<li>Aliquot de eencellige schorsingen in elk van de kleuring van het deelvenster platen en een ingestelde geluidsvolume in de graaf-plaat. Opmerking: De graaf plaat wordt gebruikt voor het berekenen van het totale aantal cellen toegevoegd aan elk kleuring paneel, waardoor nauwkeurige cel bevolking graven. Een cytometer van de stroom met 96-wells-plaat bemonsterings- en analysemethoden volumetric mogelijkheden bieden het aantal cellen per µL in elk monster, en daarom, bereken het aantal cellen toegevoegd aan elke kleuring deelvenster. Graaf platen kunnen worden verworven de volgende dag na fixatie 's nachts bij 4 ° C, spoelen met FACs buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% FBS), en resuspending in een vastgestelde hoeveelheid FACs buffer.</li>
	<li>Het wassen van de cellen tweemaal met 200 µL van Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) per monster door centrifugeren (5 min, 805 x g, 4 ° C) en het supernatant tussen elke spoelen om elke vrije FBS te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 50 µL van Fc blok, meng de monsters met behulp van een precisiepipet multi-kanaals en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Voeg 50 µL van 2 x geconcentreerd extracellulaire targeting antilichaam en corrigeerbare levensvatbaarheid vlek mengsel, mix met behulp van een precisiepipet multi-kanaals en incubeer gedurende 30 min. in het donker bij RT of 4 ° C. Opmerking: De exacte kleuring voorwaarden voor het antilichaam afhankelijk van de instructies van de fabrikant. Alle kleuring verdunningen moet in DPBS, met geen toegevoegde FBS ter voorkoming van de verzadiging van de kleurstof corrigeerbare levensvatbaarheid. Raadpleeg de Tabel van materialen/uitrusting voor de optimale verdunningen van hettoezichtpanel kleuring gebruikt in dit manuscript. Antilichaam en corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstofoplossing is bereid met een concentratie van 2 x te verstrekken een uiteindelijke 1 x kleuring concentratie in 100 µL van totale kleuring volume wanneer toegevoegd aan het Fc-blok.</li>
	<li>Het wassen van de monsters tweemaal met FACs buffer door centrifugeren (5 min, 805 x g, 4 ° C) en het supernatant tussen elke spoel te verwijderen.</li>
	<li>Resuspendeer in 200 µL 1 x fixatie/permeabilization oplossing en na een nacht bebroeden bij 4 ° C beschermd tegen licht. Opmerking: Het experiment kan worden onderbroken 's nachts op dit punt: monsters bij 4 ° C beschermd tegen het licht houden.</li>
	<li>De volgende dag, centrifugeren van de platen (805 x g, 5 min, 4 ° C) en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Spoel eenmaal met 200 µL van 1 x permeabilization buffer, centrifuge (5 min, 805 x g, 4 ° C), en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Voeg 100 µL van 1 x geconcentreerd intracellulaire antilichaam kleuring paneel bereid in 1 x permeabilization buffer en incubeer gedurende 30 min. in het donker bij RT of 4 ° C (dit hangt kleuring aanbevelingen van de fabrikant).</li>
	<li>Spoel na met 1 x permeabilization buffer (5 min, 805 x g, 4 ° C), verwijder het supernatant en spoelen een tweede keer met FACs buffer (PBS met 2% FBS).</li>
	<li>Resuspendeer de monsters in 300 µL van FACs buffer (PBS met 2% FBS), het overbrengen van de monsters naar stroom cytometry buizen, en stroom cytometry analyses uit te voeren.</li>
</ol>

<ol><li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446472/">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Chiou, V. L., Burotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudoprogression+and+Immune-Related+Response+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).</li>
<li>Menon, S., Shin, S., Dy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Cancer+Immunotherapy+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors.</a> Cancers. 8 (12), 106(2016).</li>
<li>Denkert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Lymphocytes+As+an+Independent+Predictor+of+Response+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+ablative+radiation+on+local+tumor+require+CD8%2B+T+cells%3A+changing+strategies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment.</a> Blood. 114 (3), 589-595 (2009).</li>
<li>Stakheyeva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+component+of+tumor+microenvironment+in+the+efficiency+of+cancer+treatment%3A+perspectives+for+the+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-Cytometry%3A+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Casadevall, A., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigorous+Science%3A+A+How-To+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rigorous Science: A How-To Guide.</a> mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li>
<li>Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Mass+Cytometry+%28CyTOF%29+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li>
<li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De tijd is samengesteld uit diverse en complexe cellulaire componenten en moleculen. Recent bewijs suggereert dat nauwkeurige karakterisering van deze omgeving kan zorgen voor een beter begrip van de behandeling succes of mislukking, en kan zelfs helpen bij het identificeren van de mechanismen van therapeutische resistentie. Bijvoorbeeld, kan toenemende intratumoral van verschillende immunosuppressieve cellen (dat wil zeggen, MDSCs, regulatoire T-cellen, enz.) verzachten effector immuunresponsen en trek...

De onderdrukkende tijd is onlangs erkend als een stempel van kanker, en is bekend om te spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling, progressie en bescherming van de solide tumor kankers, evenals verzachten van hun gevoeligheid voor immunotherapie1. De tijd is samengesteld uit tal van cellulaire deelverzamelingen en fenotypen, die allemaal kritisch inzicht geven in de immunologische toestand van de tumor. Deze immunologische deelverzamelingen kunnen verder worden gelaagde in cellen van lymfocyt of myeloïde oorsprong, die tezamen het merendeel van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen2,3 vormen. Recente ontwikkelingen op het gebied van kanker immunotherapie is gebleken dat immunotherapeutische strategieën (dat wil zeggen, immuun checkpoint remmers, chimeer antigeen receptor T-cellen, enz.) het potentieel hebben voor het opwekken van duurzame kanker regressies; ze blijven echter relatief inefficiënt in4,5van de kankers van de stevige tumor. Talrijke groepen de kritische hindernis hebben aangetoond dat de tijd op de behandeling succes6,7 spelen kunt, en er dus een noodzaak om te nauwkeurig evalueren nieuwe immuuntherapie in de pre-klinische setting blijft, specifiek gericht op hun mogelijkheid om te moduleren of de tijd8overwinnen.
Huidige inspanningen te karakteriseren van de tijd meestal gebruiken beide microscopie of stroom cytometry samen met antilichaam labeling van strategieën om immuun cellulaire deelverzamelingen en hun functies9,10te identificeren. Deze twee strategieën informeren uniek verschillende, zoals microscopie ruimtelijke waardering van cellulaire deelverzamelingen kunt en stroom cytometry hoge doorvoer en bredere kwantificering van cellulaire veranderingen biedt. Ondanks de recente verbeteringen in fluorescerende multiplex immunohistochemistry optimaliseren van spectrale imaging systemen, die nu kunnen maximaal 7 parameters worden ondersteund, beperkte deelvenster grootte bemoeilijkt brede niveau immuun profilering en deze techniek is dus vaak gereserveerd voor meer gerichte analyses. Dientengevolge, blijft stroom cytometry een van de meest gebruikte immuun profilering technieken. Ondanks het wijdverbreide gebruik in tijd karakterisering zijn de methoden die worden gebruikt voor het verwerken en kleuring heel variabel. Vaakst protocollen gebruiken een tumor distantiëren van enzym (dat wil zeggen, collagenases, DNase, etc.) en handmatige dissociatie methoden om eencellige schorsingen, gevolgd door antilichaam kleuring en analyse7. Ondanks de voordelen van elke methode, hebben talrijke groepen aangetoond de uitgebreide variabiliteit die kan worden opgewekt door middel van deze technieken-11. Dit maakt vergelijkingen van de Kruis-studie van tumor communicatie profilering uiterst moeilijk, zelfs bij de beoordeling van de dezelfde lymfkliertest tumor-model. Bovendien, deze methoden bieden beperkte mogelijkheden te evalueren van de cellulaire tumor en tumor immuun infiltreren componenten onafhankelijk, aangezien beide componenten worden afgewisseld na vertering. Monster hoeveelheid beperkt dan multi panel kleuring en analyse, die een groot probleem wordt wanneer u probeert te karakteriseren van zeldzame immunologische deelverzamelingen (dat wil zeggen, tumor-specifieke T-cellen)12. Meer recente technieken zoals massa cytometry of cytometry van de tijd van de vlucht (CyTOF), voldoende hoge-dimensionale fenotypische analyse van cellulaire deelverzamelingen met sommige systemen ondersteunen panel ontwerpen van meer dan 42 onafhankelijke parameters13. Ondanks de enorme kracht van CyTOF technologie in immuun profilering, blijft het beperkt vanwege de kosten, de deskundigheid van de analyse en de toegang tot de apparatuur. Bovendien, vele CyTOF protocollen adviseren zuivering van immuun deelverzamelingen om signal-to-noise verhouding14, en dus we suggereren dat onze verrijking methode kan worden gebruikt voor CyTOF analyse ter verbetering van de kwaliteit van de gegevens.
Hierin beschrijven we een tumor communicatie spijsvertering en analyse methode waarin tumor immuun infiltreren scheiding. Het doel van deze methode is dat de onafhankelijke high-throughput profilering van de tumor immuun infiltreren en tumor cellulaire breuken voor bredere karakterisering van de communicatie van de tumor. Met behulp van deze methode, wij verder laten zien het belang van het uitvoeren van de analyse van de hele tumor, zoals een subcutane solide tumor model bleek te hebben belangrijke immunologische tot ruimtelijke heterogeniteit. Over het geheel genomen, deze methode kan nauwkeuriger en consequent vergelijken tussen monsters omdat het verrijkt voor immuun cellulaire subsets binnen de tumor en voorziet in onafhankelijke profilering van de cel van de tumor en immuun breuken van een tumor.

<table><tbody><tr><td>6 tot 12 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Muizen gebruikt in onze tumorstudies</td></tr><tr><td>MEER Murine Syngeneic Kanker Cell line</td><td>Verkregen van medewerker&nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 HPV antigeen expresserende muis tonsillaire epitheelkanker cellijn&nbsp;</td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol&nbsp;</td><td>EMD Milipore&nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>Murine chirurgisch gereedschapskit</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>Primair alleen schaar, pincetten en een scalpel nodig.&nbsp;</td></tr><tr><td>24-well plate&nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>T1024</td><td>Of elke 24-well platte bodem plate.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Low Speed Orbital Shaker</td><td>BioExpress (leverancier: Genemate)&nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>Of elke orbitale shaker.&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermoregulerende incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>Of elke andere thermo-gereguleerde incubator</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipet en tips</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>Of elke andere pipet en tips</td></tr><tr><td>40 µm Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tubes</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Spuit zonder naalden</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep Dichtheidsgradiënt Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipetten</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom platen</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>FoxP3 Transcriptie Factor Kleuring Buffer Set&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td>Fix/Permeabilisatie Buffer en Permeabilisatie Buffer</td></tr><tr><td>Thermogereguleerde Centrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Flow Cytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Voor 96-well cellen volumetrisch tellen&nbsp;</td></tr><tr><td>Gezuiverde Rat Anti-Muis CD16/CD32 (Muis BD Fc Block)&nbsp;Clone 2.4G2&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, voor UV excitatie</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>Fixable levensvatbaarheidskleuring</td></tr><tr><td>CD45 Monoklonaal Antilichaam (30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Monoklonaal Antilichaam (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-α Antilichaam (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Monoklonaal Antilichaam (GK1.5), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC Klasse II (I-A/I-E) Monoklonaal Antilichaam (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoklonaal Antilichaam (N418), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Monoklonaal Antilichaam (BM8), eFluor 450</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Monoklonaal Antilichaam (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G (Gr-1) Monoklonaal Antilichaam (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoklonaal Antilichaam (MIH5), PE-Cyanine7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>CD273 (B7-DC) Monoklonaal Antilichaam (122), PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Monoklonaal Antilichaam (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

verrijking en karakterisering van de tumor immuun en niet-immune microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

De tumor immuun communicatie (keer) heeft onlangs erkend als een kritische bemiddelaar van solide tumoren, met name voor immuuntherapie antistofrespons behandeling. Recente klinische vooruitgang in immunotherapie wijzen op de noodzaak voor reproduceerbare methoden om nauwkeurig en grondig karakteriseren de tumor en de bijbehorende immuun infiltreren. Tumor enzymatische spijsvertering en flow cytometrische analyse mogelijk globale karakterisering van talrijke immuun cel subsets en fenotypen; grondigheid van de analyse wordt echter vaak beperkt door fluorophore beperkingen op het deelvenster Ontwerp en de noodzaak om het verwerven van grote tumor monsters te observeren van zeldzame immuun populaties van belang. Zo hebben we een effectieve en hoge doorvoer-methode voor het scheiden en verrijken van de tumor immuun infiltreren van de niet-immuun tumor componenten ontwikkeld. De beschreven tumor spijsvertering en centrifugaal dichtheid gebaseerde scheiding techniek kunt afzonderlijke karakterisering van de tumor en tumor immuun infiltreren breuken behoudt cellulaire levensvatbaarheid en biedt dus een globale karakterisering van de tumor immunologische staat. Deze methode werd gebruikt voor het karakteriseren van de uitgebreide ruimtelijke immuun heterogeniteit in stevige tumors, die verder de noodzaak voor consistente hele tumor immunologische profiling technieken toont. Over het geheel genomen, deze methode biedt een effectieve en flexibele techniek voor de karakterisering van immunologische van subcutane solide lymfkliertest tumoren; als zodanig, deze tool kan worden gebruikt om beter karakteriseren de tumoraal immunologische functies en in de preklinische evaluatie van roman immunotherapeutische strategieën.

Onze resultaten tonen aan dat het aanzienlijke voordeel van TIL scheiding van niet-immune tumor componenten, zoals uiteengezet in het protocol. Bovendien, met behulp van de beschreven methode we de belangrijke immunologische heterogeniteit van gevestigde stevige tumors laten zien.
Een significant probleem met vele tumor dissociatie technieken is het verlies van levensvatbaarheid van de steekproef, meestal als gevolg van harde sp...

Hier beschrijven we een methode om te scheiden en verrijken van de componenten van de tumor immuun en niet-immuun communicatie in gevestigde subcutane tumoren. Deze techniek maakt het mogelijk voor de afzonderlijke analyse van tumor immuun infiltreren en niet-immuun tumor breuken die uitgebreide karakterisering van de tumor immuun communicatie kunnen toestaan.

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Het algemene doel van deze techniek is om een methode te bieden voor gelijktijdige profilering van zowel de immuun- als de kankercelfracties die bijdragen aan de immuunmicro-omgeving van solide tumoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de immuun-oncologie, zoals welke immuun- en niet-immuunveranderingen er optreden binnen de tumor na een bepaalde behandeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de effectieve verrijking van zowel immuun- als niet-immuuntumorcomponenten vergemakkelijkt, waardoor een grondige profilering van de immunologische toestand van de tumor mogelijk is.Het algemene doel van deze methode is om het immuunmicro-omgeving van de tumor efficiënt te profileren en door behandeling geïnduceerde veranderingen te identificeren. Na het besproeien van de muis met 70%ethanol om besmetting door haar te voorkomen, verwijder je chirurgisch de subcutane tumoren, zorg ervoor dat de tumoren vrij zijn van enig besmettend weefsel. Plaats vervolgens elke tumor in 1,8 milliliter basis-RPMI 1640-medium zonder foetaal runderserum in individuele putjes van een 24-putsplaat op ijs.Wanneer alle tumoren zijn verzameld, snij de monsters met schaar in stukken van minder dan één kubieke millimeter en voeg 200 microliter vers bereid 10X dissociatiecocktail toe met collagenase-1, collagenase-4 en DNase één aan elke put. Na één uur bij 37 graden Celsius, in een orbitale platenschudder bij 60 tot 100 RPM, neutraliseer je de reactie met één milliliter RPMI 1640-medium aangevuld met 5%FBS en twee millimolar EDTA, en gebruik je een aangepaste 1 milliliter pipettepunt om elk tumormengselmonster over te brengen naar individuele 50 milliliter kegelbuisjes met individuele 40 micrometer zeefjes. Gebruik een 10 milliliter spuitplunger om de tumorstukken mechanisch te desintegreren door de zeefjes, spoel elke zeef periodiek af met twee milliliter RPMI 1640-medium plus 5%FBS totdat de zeefjes vrij zijn van tumor.Wanneer alle tumoren zijn gedissocieerd, voeg je medium toe aan elke buis zo nodig om alle monsters op hetzelfde volume te brengen en pellet de cellen door centrifugatie. Gebruik vervolgens een vijf milliliter serologische pipet om de pellets te resuspenderen in twee milliliter FBS-aangevuld medium per buis. Om de immuun- en tumorcelfracties te scheiden, voeg je drie milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan de bodem van één 15 milliliter kegelbuisje per monster en laat je langzaam twee milliliter tumorcelsuspensie langs de zijkant van elke buis op elke gradiënt druppelen.Zorg ervoor dat de tumorcelsuspensies goed gemengd zijn voordat je ze lagen, dat de celsuspensies langzaam langs de zijkant van de buizen worden gepipetteerd en dat de buizen voorzichtig worden gehanteerd om vermenging van de lagen te voorkomen. Scheid de cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugering en verzamel voorzichtig de bovenste medium- en tumorinfiltrerende leukocytenlaag in één nieuw 15 milliliter buisje per monster. Gooi de resterende dichtheidsgradiëntmedium weg en resuspendeer de tumorpellets in twee milliliter medium plus FBS per buis.Centrifugeer vervolgens alle monsters en resuspendeer de tumorinfiltrerende leukocyten in 200 microliter en de tumorcellen in twee milliliter medium plus FBS per buis op ijs. Om de cellen te plateren, label je één 96-wels U-bodemplaat voor elk immuunkleuringspaneel plus een extra plaat voor celtellingen en verdeel je de enkele celsuspensies in elk van de kleuringspaneelplaten en de calcplaat. Was de cellen twee keer met 200 microliter Dulbecco's PBS per monster en blokkeer de cellen met 50 microliter FC-blok per putje gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Aan het einde van de blokkeerincubatie, voeg je 50 microliter 2X geconcentreerd extracellulair targetingantilichaam en fixeerbaar viabiliteitskleuringsmengsel toe aan elke put voor een 30 minuten durende incubatie in het donker. Aan het einde van de kleuringsincubatie, was je de monsters twee keer met FACS-buffer en resuspendeer de pellets in 200 microliter fixatie- en permeabiliseringsoplossing overnacht bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. De volgende dag, verzamel je de cellen door centrifugatie, gevolgd door een wassing met 200 microliter permeabiliseringsbuffer per putje.Label de cellen met 100 microliter intracellulair antilichaamkleuringspaneel in permeabiliseringsbuffer voor een 30 minuten durende incubatie in het donker, gevolgd door nog een wassing met permeabiliseringsbuffer. Was vervolgens de cellen opnieuw met FACS-buffer en resuspendeer de monsters in 300 microliter verse FACS-buffer voor hun analyse door middel van flowcytometrie. Tumordigestie, zoals aangetoond, met of zonder verrijking met dichtheidsgradiëntmedium, resulteert in een ongeveer 70 tot 90%levende gehele tumorcelpopulatie zoals beoordeeld door flowcytometrie.Verrijking met dichtheidsgradiëntmedium bevordert een meer dan tweevoudige toename in de CD45-positieve tumorinfiltrerende leukocytenfractie, vergeleken met niet-verrijkte tumordigesties, evenals talrijke immuuncelsubsets die vaak worden waargenomen in immuunmicro-omgevingsstudies. De CD45-negatieve tumorcelfractie kan ook worden geprofileerd voor talrijke tumorkenmerken, zoals algemene tumorviabiliteit of apoptose, proliferatievermogen en de expressie van verschillende immunosuppressieve markers. Om te bepalen hoe myeloide en lymfocytaire immunologische subsets variëren in een enkele solide tumor, kan de tumor in vier gelijke delen worden verdeeld op een zodanige manier dat elk deel ongeveer gelijke intratumorale regio's bevat, evenals gelijke dermale en peritoneaalgerichte delen.Elk stuk kan vervolgens afzonderlijk worden gedigesteerd en geanalyseerd, zoals aangetoond, op de aanwezigheid van verschillende immuuncelpopulaties. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier tot 8 uur worden voltooid, afhankelijk van hoeveel monsters je hebt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel maar efficiënt te werken om de celviabiliteit te behouden.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de dissociatie- en scheidingsstappen technieken om

enrichment-characterization-tumor-immune-non-immune-microenvironments

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In dit rapport beschrijven we een protocol voor het isoleren van zeer zuivere populaties van leucocyten dat tumoren te infiltreren. Dit protocol is een bewerking van de Miltenyi Biotech-protocol om opbrengst en zuiverheid voor het isoleren van cellen van complexe tumorweefsel te verbeteren.

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

This video illustrates testing of adjuvant or additional therapy in a mouse model with incompletely resected subcutaneous tumors. The partially tumor-resected mouse is treated with an antibody targeting the anti-cytotoxic protein of T regulatory cells, potentially reducing tumor regrowth and suggesting effective adjuvant therapy.

An Adjuvant Therapy in a Mouse Model with an Incompletely Resected Subcutaneous Tumor

Dit protocol beschrijft een methode voor de gedetailleerde evaluatie van leukocytensubsets binnen de tumormicro-omgeving in een muistumormodel. Chemerin-uitdrukkende B16 melanoomcellen werden subcutaan geïmplanteerd in syngene muizen. Cellen uit de tumormicro-omgeving werden vervolgens gekleurd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie, wat gedetailleerde leukocytensubsetanalyses mogelijk maakt.

Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Hier presenteren we een reproduceerbare methode voor het ontwikkelen van een model orthotopic lymfkliertest van hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. Tumoren tonen klinisch relevante histopathologische kenmerken van de ziekte, met inbegrip van necrose, arme differentiatie, knooppunten metastasen en immuun infiltratie. Tumor-dragende muizen ontwikkelen klinisch relevante symptomen zoals dysfagie, verplaatsing van de kaak en gewichtsverlies.

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

Er wordt een standaardprotocol beschreven om de antitumoractiviteit en bijbehorende toxiciteit van IL-1α te bestuderen in een syngene muismodel van HNSCC.

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Dit protocol schetst de generatie van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS) voor immuno-oncologische studies. Instructies en overwegingen bij het gebruik van dit model voor het testen van menselijke immunotherapeutica op menselijke tumoren die in dit model zijn geïmplanteerd, worden gepresenteerd met de nadruk op het karakteriseren van de reactie van het menselijk immuunsysteem op de tumor.

Testen van kankerimmunotherapeutica in een gehumaniseerd muismodel met menselijke tumoren

Met de toenemende interesse in intratumorale immunotherapie is het kiezen van tumormodellen die toegankelijk en praktisch zijn, van essentieel belang. Subcutane tumoren zijn gemakkelijk vast te stellen, maar moeilijk te visualiseren en te manipuleren. In dit protocol beschrijven we methoden om intradermale tumoren te genereren die zorgen voor betere zichtbaarheid en toegankelijkheid.

Intradermale tumorimplantatie als robuust model voor intratumorale immunotherapiestudies bij muiskanker

Leer een methode voor het verrijken en karakteriseren van tumor immuun- en niet-immuunmicro-omgevingen in subcutane tumoren. Deze techniek maakt gelijktijdige profilering van immuun- en kankercelfracties mogelijk.

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren (Video) | JoVE Journal

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

Meer video's verkennen