Name: Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer hoe je muis embryonale fibroblasten omzet in functionele cardiomyocyten via factor-gemedieerde herprogrammering met hoge efficiëntie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar hartregeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door fondsen uit van de Stichting van de Boettcher Webb-Waring biomedische Research Program, American Heart Association wetenschapper ontwikkeling Grant (13SDG17400031), Universiteit van Colorado Vakgroep Geneeskunde uitstaande vroege carrière Geleerde Program, Universiteit van Colorado divisie van cardiologie Barlow Nyle endowment en NIH R01HL133230 (naar KS). A.S.R werd gesteund door de NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 en een-gepromoveerde beurs van de Universiteit van Colorado-Consortium voor fibrose onderzoek & vertaling (CFReT). Dit onderzoek werd ook ondersteund door de kanker Center ondersteuning Grant (P30CA046934), de huid ziekten Cores onderzoeksbeurs (P30AR057212) en de Stroom Cytometry kern op de Universiteit van Colorado Anschutz medische Campus.

Alle experimenten waarbij dieren werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de UC Denver Anschutz medische Campus.
1. isolatie van MEFs
<ol><li>Koop C57BL/6 zwangere muizen op E13. Schip 's nachts.</li>
	<li>De moeder volgens goedgekeurde IACUC protocollen euthanaseren (ex: ~1.3 L/min CO2 totdat dier dood verschijnt gevolgd door cervicale dislocatie)</li>
	<li>Spray de moeder met 70% ethanol en openen van de buikholte. Verwijderen van de baarmoeder hoorn met embryo's en plaatsen in een 10 cm schotel met steriel PBS.</li>
	<li>Maak een incisie in de embryo sac vrijgeven embryo. Overdracht van embryo om 10 cm schotel met steriel PBS schoon te maken. Spoel grondig.</li>
	<li>Snijd het lichaam onder de lever en negeren het hoofd en het bovenlichaam. Verwijderen van de inwendige organen en gooi deze weg. Het resterende weefsel overbrengen in een schone 10 cm schotel met steriel PBS en breng de plaat naar een bioveiligheid niveau 1 of 2 kabinet. Combineren weefsels van alle embryo's in een schone, droge 10 cm schotel en gehakt in fijne stukjes.</li>
	<li>6 mL van 0,25% trypsine/1 mM EDTA aan gehakt embryo's toevoegen. Triturate meerdere malen Pipetteer te breken van weefsel. Incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ˚C met 5% CO2.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in groeimedium (tabel 1). Het volume van media is aangepast op basis van het aantal embryo's geoogst. In het algemeen, een verhouding van ongeveer 25 mL groei media per 1.2 embryo's gebruiken.</li>
	<li>Plaat 25 mL geresuspendeerde cellen in een 15 cm schotel. Na 24u, gecombineerd de media en voeg 25 mL vers groeimedium aan elke plaat.</li>
	<li>Na 72 uur, voeg toe 2 mL van 0,25% trypsine/1 mM EDTA aan elke 15 cm schotel. Wanneer cellen van de cultuur-schotel loskoppelen, trypsine met 15 mL groeimedium inactivering en verzamelen van cellen in 50 mL polystyreen conische buisjes. Centrifugeer cellen gedurende 3 minuten op 160 x g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet cel in groeimedium en filter door een 70 µm porie cel zeef.</li>
	<li>Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en bevriezen van MEFs in 2 miljoen cellen aliquots in bevriezen medium (10% DMSO, 25% FBS in Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) / hoge glucose) bij-80 ° C. Overbrengen in cellen vloeibare stikstof na 24 h en de winkel tot klaar voor gebruik. Opmerking: Global genexpressie in MEFs werd geprofileerd geïsoleerd met behulp van dit protocol door RNA-sequentiebepaling (RNA-seq) om verificatie van de cel. RNA-seq gegevens uit coderen MEF cellen werden gedownload van NIH gen expressie Omnibus (GEO) met toetreding nummer GSE93454. RNA-seq gen expressie gegevens voor de MEFs door ons gebruikt werden neergelegd in NIH GEO bij toetreding nummer GSE71405. Deze twee gegevensverzamelingen werden samengevoegd volgens gemeenschappelijke gene symbolen. De expressie gegevens werden vervolgens log-omgevormd en een scatterplot van de gegevens van de expressie voor onze MEFs en CODEER MEFs werden gegenereerd en passen met een lineaire regressielijn (figuur 1A). MEFs geïsoleerd met behulp van dit protocol zijn moleculair vergelijkbaar zijn met die geïsoleerd door andere laboratoria.</li>
</ol>2. productie van Retrovirus en transductie van MEFs
Opmerking: Alle stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een kast van bioveiligheid niveau 2. Aangezien dit protocol maakt gebruik van retrovirale signaaltransductie, zorgen dat de veiligheid voorzorgsmaatregelen worden getroffen, met inbegrip van behandeling die alle die virale media met 10% bleekwater voor ten minste 20 min. verwijs naar figuur 1B voor een tijdlijn afvalstoffen voor herprogrammering.
<ol><li>
Productie van Retrovirus met behulp van de cellijn Platinum E (PE)
	<ol>
<li>Handhaven van verkrijgbare PE cellen in PE medium (tabel 1) met blasticidin en puromycin selectie markers om expressie van gag-pol en env genen voor efficiënte retrovirale deeltje productie36 . De cellen van de passage op 1:4 of 1:5 om de twee dagen. Zorg om te voorkomen dat overbevolking van cellen zoals dit retrovirale productie rendementen kan verminderen.</li>
		<li>Op de dag -1, seed ongeveer 5 x 106 cellen per 10 cm schotel in het groeimedium (tabel 1) 16-20 h vóór transfectie (Zie tabel 2 voor de plating dichtheden voor andere standaard cel cultuur schotel maten). Zachtjes heen en weer meerdere malen rock gerechten en zorgvuldig plaats in een 37 ° C, 5% CO2 incubator zelfs plating verdeling (Zie Figuur 1 c voor optimale plating dichtheid vóór transfectie). Opmerking: zorg plaat PE cellen in het medium gratis selectie markeringen vóór transfectie om opslagmedium met gegenereerde retrovirale deeltjes doodt niet MEFs.</li>
		<li>Op de dag 0, voorbereiden op DNA transfectie. Voor 10 cm schotel transfectie, voeg 2 µg voor elke herprogrammering factor — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) — tot een 1,5 mL koker. Opmerking: Raadpleeg tabel 2 op de schaal van de hoeveelheid DNA die nodig zijn voor andere standaard cel cultuur schotel maten transfect.</li>
		<li>In een aparte 1,5 mL-buis, 360 µL verminderde serum media hebt toegevoegd. Voeg dan 36 µL transfectiereagens rechtstreeks aan verminderde serum media. Zachtjes flick van de buis en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Opmerking: Om te voorkomen dat de verminderde transfectie efficiëntie, zorgvuldig transfectiereagens rechtstreeks toevoegen aan de verminderde serum media.</li>
		<li>Verminderde serum media/transfectie reagens mengsel toevoegen aan GHMT2m DNA cocktail. Zachtjes flick van de buis en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Doen niet vortex.</li>
		<li>Het reactiemengsel ontkleuring aan PE cellen toevoegen, zachtjes swirl van media voor 10-15 s en plaatsen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Opmerking: Volgens de fabrikant, PE cellen genereren een gemiddelde titer van 106 tot 107 besmettelijke eenheden/mL. Dit protocol genereert ongeveer 2 x 106 infecties eenheden/mL door 24 h en 6 x 106 infecties eenheden/mL door 48 h gemiddeld MOI van 4. De transfectie van GFP/DsRed kan ook worden gebruikt als een surrogaat voor Transfectie/transductie efficiëntie indien gewenst; efficiëntie van de transfectie wordt verwacht dat hoger is dan 90% door 48 h (Figuur 1 c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transductie van MEFs
	<ol>
<li>Jas gerechten met collageen en breng dit in een 37 ° C, 5% CO2 incubator voor ten minste 2 uur op de dag 0.</li>
		<li>MEFs verwijderen van vloeibare stikstof en dooi. Plaat 0,2 x 106 cellen per 60 mm schotel in het groeimedium. Zachtjes rock platen om ervoor te zorgen zelfs plating distributie en plaats in de incubator (Zie Figuur 1 c voor optimale plating dichtheid en tabel 2 voor de plating dichtheden voor andere standaard cel cultuur schotel maten). Opmerking: Deze beplating dichtheden hebben getest over meervoudige batches van geïsoleerde MEFs; tenzij MEFs display gecompromitteerd aanzienlijk levensvatbaarheid, is cel zaaien dichtheden aanpassen niet nodig.</li>
		<li>Op de dag 1, 24 h na transfectie, kunt een 30 mL spuit retrovirale medium gegenereerd door PE cellen verzamelen. Het medium passeren door een 0,45 µm poriegrootte filter in een conische buis van 50 mL. Hexadimethrine bromide transfectiereagens toevoegen om een eindconcentratie van 6 µg/mL. Voeg 10 mL verse groeimedium aan PE cellen door pipetting media op de wand van de schotel cultuur om te voorkomen dat de verplaatsing van de cellen.</li>
		<li>Het medium van MEFs gecombineerd en 4 mL vers geoogste retrovirale voedingsbodem toevoegen aan elk gerecht. MEFs terugkomen in de incubator. 10% bleekwater toevoegen aan alle materialen in contact met het virale medium te neutraliseren retrovirale deeltjes.</li>
		<li>Op de dag 2, 48 h na transfectie, herhaal stap 2.2.2 en 2.2.3. PE cellen worden verwijderd na de 2nd -collectie van het retrovirale medium. Opmerking: Voeg 10% bleekwater toe aan afgedankte PE cellen voor ten minste 20 min. te neutraliseren van ongewenste retrovirus.</li>
		<li>Op dag 3 gecombineerd medium uit MEFs en vullen met 4 mL iCM medium (tabel 1) met de 0,5 µM A-83-01, een TGF-β controletype I receptor remmer. Aanvullen iCM opslagmedium met A-83-01 om de 2 dagen. Opmerking: Als GFP als een transductie-besturingselement gebruikt, de expressie naar verwachting meer dan 90% door dit punt van tijd (Figuur 1 c).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Stroom Cytometry voor cardiale Markers
<ol><li>Aspirate medium uit dag 9 geherprogrammeerd MEFs en wassen (1 x) met 1 x PBS om dode cellen en puin te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 1 mL 0,25% trypsine/EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ˚C. Controleer met behulp van een lichte Microscoop cellen staan en schud nu schotel; Als cellen aangesloten blijven, incubeer 5 meer min op 37 ˚C tot cellen los.</li>
	<li>Cellen in 1 x PBS met 5% FBS en filter door een 70 µm porie cel zeef wassen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 160 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en aspirate vloeistof uit de pellet. Opmerking: Het vergroten van de opbrengst van de cel, laat ongeveer 50 µL vloeistof boven de cel-pellet.</li>
	<li>Spoel de cellen met 500 µL 1 x PBS met 1% BSA.</li>
	<li>Fix cellen met 0,2 mL/1 miljoen cellen fixatie oplossing voor 20 min op ijs.</li>
	<li>Voeg 1 mL 1 x ijskoude perm/afwas buffer. Opmerking: De fabrikant oplossing is 10 x.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en supernatant gecombineerd.</li>
	<li>Herhaal stap 3.7 en 3.8 een extra tijd. Na de 2nd wash, ga direct naar volgende stap of houden cellen bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>Blokkeren met 100 µL van de serum van 5% geit en ezel serum in 1 x perm/afwas buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 100 µL van verdunde primair antilichaam. Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met Muis Troponine T (1:200) en muis α-actinin (1:200) te kwantificeren van het percentage cellen positief voor belangrijke onderdelen van de cardiale Sarcomeer. Primair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 m bij 4 ° C, gecombineerd supernatant en 2 x met ijskoude perm/afwas buffer wassen.</li>
	<li>Voeg 100 µL van verdunde secundair antilichaam. Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met anti-muis 647 nm secundair antilichaam (1:200). Incubeer secundair antilichaam gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur op een eind over buis rotator. Beschermen cellen tegen licht door buizen in folie wikkelen.</li>
	<li>Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd supernatant en 2 x met ijskoude perm/afwas buffer wassen.</li>
	<li>Voeg 1 mL van de 1% BSA in PBS en FACS onmiddellijk uit te voeren. Opmerking: Genereer een voorwaartse vs kant scatter scatterplot naar gate levensvatbare cellen eerst bij het uitvoeren van FACS. Ook gebruiken een commercieel beschikbare live/dode cel vlek vóór de vaststelling van de cellen dood cel populaties te identificeren live.</li>
</ol>4. immunokleuring van geherprogrammeerde MEFs
<ol><li>Aspirate medium uit dag 14 geherprogrammeerd MEFs en wassen (1 x) met 1 mL 1 x ijskoude PBS. Opmerking: Voor immunokleuring, herprogrammering werd uitgevoerd in 12 goed platen om te minimaliseren van antilichaam oplossing volumes. 24 goed platen kunnen ook worden gebruikt; gewoon half alle volgende volumes.</li>
	<li>Gecombineerd en herstellen van cellen met 500 µL 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gecombineerd en wassen van cellen 3 keer met 1 mL 1 x PBS (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur).</li>
	<li>Permeabilize cellen met 500 µL 0,2% permeabilization-reagens in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gecombineerd en blokkeren in 500 µL 10% paard serum in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gecombineerd en incubeer met 500 µL van de verdunde primair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gemarkeerd met Muis Troponine T of α-actinin (elke 1:400) en mede gemarkeerd met Connexin 43 (1:400) of troponine I (1:400).</li>
	<li>Gecombineerd primair antilichaam en spoel driemaal met PBS van de 1 x 1 mL (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur).</li>
	<li>Gecombineerd en met 500 µL verdunde secundair antilichaam Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met anti-muis 555 nm secundair antilichaam (1:800) te herkennen troponine T of α-actinin en anti-konijn 488 nm secundair antilichaam (1:800) te herkennen Connexin 43 of troponine I. Bovendien, kernen werden gekleurd met Hoechst (1:10, 000). Beschermen cellen tegen licht door het broeden in het donker.</li>
	<li>Het secundaire antilichaam gecombineerd en spoel driemaal met PBS van de 1 x 1 mL (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur). Wikkel de plaat in folie cellen beschermen tegen licht te bewaren bij 4 ° C.</li>
	<li>Beeld met behulp van drie-kanaals epifluorescence microscopie.</li>
</ol>5. calcium Imaging
Opmerking: Als denkbaar ter 10 X vergroting, standaard cel cultuur gerechten en platen zijn geschikt voor calcium imaging. Beeldvorming bij hogere vergroting vereist dat cellen worden verguld op glas coverslips of glazen bodem gerechten.
<ol><li>Gecombineerd middellange en voeg toe 2 mL (voor een 6 goed plaat) bewerkt Tyrode de oplossing (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, glucose van 10 mM, 10 mM HEPES, 0,1% BSA en 1% pyruvaat, pH 7.4) met 5 µM Fura-2 ben en 0.1% Pluronic F-127 te verslaan (D14 t o D20) iCMs. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Opmerking: Beschermen cellen tegen licht om te voorkomen dat het blussen van fluorescerende indicator.</li>
	<li>Wassen van cellen in 2 mL Tyrode de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om ambtshalve verestering van Fura-2 AM.</li>
	<li>Afbeelding met draaiende schijf confocale microscopie bij 340 nm en 380 nm met behulp van Slidebook 5.5 Ca2 + beeldbewerkingssoftware. Het uitvoeren van de beeldvorming bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Calcium transiënten zijn berekend op basis van de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie bij 340 nm over de intensiteit van de fluorescentie op 380 nm.</li>
	<li>Desgewenst behandelen iCMs met 1 of 2 µM isoproterenol of 10 µM Nifedipine te manipuleren calcium behandeling na imaging basislijn calcium transiënten. Lokaal verbindingen aan cellen en afbeelding toevoegen.</li>
</ol>

<ol><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 136 (20), (2017).</li>
<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16003373">Regenerating the heart.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).</li>
<li>Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+muscle+regeneration%3A+lessons+from+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cardiac muscle regeneration: lessons from development.</a> Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).</li>
<li>Nabel, E. G., Braunwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+coronary+artery+disease+and+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A tale of coronary artery disease and myocardial infarction.</a> N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).</li>
<li>Packer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+carvedilol+on+the+morbidity+of+patients+with+severe+chronic+heart+failure%3A+results+of+the+carvedilol+prospective+randomized+cumulative+survival+%28COPERNICUS%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study.</a> Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).</li>
<li>The CAPRICORN Investigators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+carvedilol+on+outcome+after+myocardial+infarction+in+patients+with+left-ventricular+dysfunction%3A+the+CAPRICORN+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial.</a> The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).</li>
<li>Marangou, J., Paul, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+attitudes+on+cardiac+devices+in+heart+failure%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Ther%22%5BJournal%5D)">Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review.</a> Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).</li>
<li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mending+broken+hearts%3A+cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).</li>
<li>Wollert, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15246726">Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial.</a> Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).</li>
<li>Schachinger, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16990384">Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction.</a> N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).</li>
<li>Huikuri, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracoronary+injection+of+mononuclear+bone+marrow+cells+on+left+ventricular+function%2C+arrhythmia+risk+profile%2C+and+restenosis+after+thrombolytic+therapy+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).</li>
<li>Janssens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+bone+marrow-derived+stem-cell+transfer+in+patients+with+ST-segment+elevation+myocardial+infarction%3A+double-blind%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial.</a> Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).</li>
<li>Lunde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+injection+of+mononuclear+bone+marrow+cells+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction.</a> N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+autologous+mononuclear+bone+marrow+cells+or+peripheral+mononuclear+blood+cells+after+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+rationale+and+design+of+the+HEBE+trial+-+a+prospective%2C+multicenter%2C+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial.</a> Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+mononuclear+cells+from+bone+marrow+or+peripheral+blood+compared+with+standard+therapy+in+patients+after+acute+myocardial+infarction+treated+by+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+results+of+the+randomized+controlled+HEBE+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial.</a> Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).</li>
<li>Karantalis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cells+produce+concordant+improvements+in+regional+function%2C+tissue+perfusion%2C+and+fibrotic+burden+when+administered+to+patients+undergoing+coronary+artery+bypass+grafting%3A+The+Prospective+Randomized+Study+of+Mesenchymal+Stem+Cell+Therapy+in+Patients+Undergoing+Cardiac+Surgery+%28PROMETHEUS%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial.</a> Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone%2C+Heart%2C+and+Other+Mesoderm+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. 166 (2), 451-467 (2016).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+A+source+of+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">iPS cells: A source of cardiac regeneration.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538, 388-391 (2016).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 357-386 (2010).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li>
<li>Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+with+the+MyoD+transactivation+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).</li>
<li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).</li>
<li>Addis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+direct+fibroblast+reprogramming+to+cardiomyocytes+using+calcium+activity+as+a+functional+measure+of+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).</li>
<li>Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+TGF%CE%B2+signaling+increases+direct+conversion+of+fibroblasts+to+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes.</a> PLoS One. 9 (2), e89678(2014).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+Is+a+Key+Epigenetic+Barrier+to+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+MYOCD%2C+SRF%2C+Mesp1+and+SMARCD3+enhance+the+cardio-inducing+effect+of+GATA4%2C+TBX5%2C+and+MEF2C+during+direct+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming.</a> PLoS One. 8 (5), e63577(2013).</li>
<li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+induced+cardiac+reprogramming+in+vivo%3A+evidence+for+mature+cardiac+myocytes+and+improved+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function.</a> Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).</li>
<li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+in+vitro+and+in+vivo+direct+reprogramming+of+cardiac+fibroblasts+to+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.</a> Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+requires+suppression+of+pro-fibrotic+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling.</a> Nature Communications. 6, 1-15 (2015).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2Fprotein+kinase+B+enhances+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN281+enhances+cardiac+reprogramming+by+modulating+cardiac+and+inflammatory+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression.</a> Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).</li>
<li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Enhancement+of+In+Vitro+and+In+Vivo+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming.</a> Circulation. 135, 978-995 (2017).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li>
<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+reprogramming+to+transdifferentiate+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+adenoviral+vectors%3A+Implications+for+clinical+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huidige studie schetst een hoogrenderende strategie om rechtstreeks het herprogrammeren van fibroblasten in functionele iCMs via de levering van GHMT2m factoren gecombineerd met onderdrukking van pro-fibrotische signaalroutes herprogrammering. Met behulp van stroom cytometry, immunefluorescentie beeldvorming, calcium imaging, en het verslaan van de graven van de cel, tonen we de meerderheid van de cellen in dit protocol ondergaan succesvolle herprogrammering en aannemen van CM lineage lot. Wij hebben eerder aangetoond...

Ischemische hartziekten is een belangrijke doodsoorzaak in de Verenigde Staten1. Ongeveer 800.000 Amerikanen ervaring een eerste of terugkerende myocardiaal infarct (MI) per jaar1. Na MI, de dood van cardiomyocytes (CMs) en cardiale fibrose, gestort door geactiveerde cardiale fibroblasten, afbreuk doen aan hart functie2,3. Progressie van hartfalen na MI is grotendeels onomkeerbaar te wijten aan de slechte regeneratief vermogen van volwassen CMs4,5. Terwijl de huidige klinische therapieën vertragen van de progressie van de ziekte en verminderen risico van toekomstige cardiale gebeurtenissen6,,7,,8,9, keren geen therapieën progressie van de ziekte als gevolg van het onvermogen om te regenereren CMs na infarct10. Nieuwe celtherapieën ontstaan voor de behandeling van patiënten na MI. teleurstellend, klinische proeven leveren van stamcellen naar het hart na MI tot nu toe hebben aangetoond onduidelijk regeneratief mogelijke11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
De generatie van mens-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) van fibroblasten door overexpressie van vier transcriptiefactoren, eerst gedemonstreerd door Takahashi & Yamanaka, opende de deur naar nieuwe doorbraken in cel therapie19. Deze cellen kunnen onderscheiden in alle drie kiem lagen19, en verscheidene zeer efficiënte methoden voor het opwekken van grote aantallen CMs is eerder gebleken dat20,21. HiPSC-afgeleide CMs (heupen-CMs) biedt een krachtig platform om te bestuderen van de cardiomyogenesis en kan belangrijke gevolgen hebben voor het hart na letsel herstellen. Echter, heupen-CMs momenteel hindernissen translationeel als gevolg van de bezorgdheid van Teratoom vorming22, en hun onvolwassen aard kan pro-arrhythmogenic23. Herprogrammering van de fibroblasten in hiPSCs leidde tot interesse in direct herprogrammering fibroblasten in andere celtypes. Ieda et al. aangetoond dat overexpressie van GATA4, Mef2c en Tbx5 (GMT) fibroblasten resulteert in directe herprogrammering aan cardiale afkomst, zij het op een lage efficiëntie24. Herprogrammering van efficiëntie is verbeterd met de toevoeging van Hand2 (GHMT)25. Sinds deze vroege studies, hebben veel publicaties aangetoond dat het veranderen van de herprogrammering factor cocktail met extra transcriptie26,27,28,29 factoren, chromatine modifiers30,31, microRNAs32,33, of kleine moleculen34 tot verbeterde leidt herprogrammering efficiëntie en/of rijping van geïnduceerde cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs ).
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het genereren van iCMs van muis embryonale fibroblasten (MEFs) met een hoog rendement. Wij eerder toonde aan dat de GHMT cocktail is aanzienlijk verbeterd met de toevoeging van miR-1 en miR-133 (GHMT2m) en is verder verbeterd wanneer pro-fibrotische signaling pathways inclusief transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) signaalroutes zijn geremde35. Met behulp van dit protocol, we laten zien dat ongeveer 60% van de cellen express cardiale troponine T (cTnT), ongeveer 50% express α-actinin en een groot aantal cellen van de afstraffing waarneembaar zo spoedig dag 11 na transductie van herprogrammering factoren en behandeling de TGF-β typ ik receptor remmer A-83-01. Bovendien, deze iCMs express gap junction eiwitten met inbegrip van connexin 43 en spontane contractie en calcium transiënten tentoon te stellen. Dit gemarkeerd verbetering in efficiëntie ten opzichte van eerdere studies herprogrammering toont het potentieel om te regenereren CMs van endogene cel populaties die in het na hartinfarct blijven.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Muizen</td><td>Charles River's Laboratory</td><td>027</td><td>Voor MEF isolatie</td></tr><tr><td>Platinum E (PE) Cellen</td><td>Cell Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>Voor retrovirus productie</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>SH30022.FS</td><td>Onderdeel van iCM, PE en Groei media</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Onderdeel van iCM media</td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td>Onderdeel van iCM, PE en Groei media</td></tr><tr><td>Donor Paardenserum</td><td>Gemini</td><td>100508 500</td><td>Onderdeel van iCM media</td></tr><tr><td>MEM Essentiële Aminozuren, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>11130051</td><td>Onderdeel van iCM media</td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat Oplossing, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>Onderdeel van iCM media en voor calcium beeldvorming</td></tr><tr><td>MEM Niet-Essentiële Aminozuren, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>Onderdeel van iCM media</td></tr><tr><td>MEM Vitamine Oplossing, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>Onderdeel van iCM media</td></tr><tr><td>Insuline-Transferrine-Selenium</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>Onderdeel van iCM media</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Onderdeel van iCM media</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Onderdeel van iCM, PE en Groei media</td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Onderdeel van iCM, PE en Groei media</td></tr><tr><td>Blasticidin-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>Onderdeel van PE media</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Onderdeel van PE media</td></tr><tr><td>0.25% Trypsine/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Voor het losmaken van cellen uit kweekschalen</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R&amp;D Systems - Tocris</td><td>2939/10</td><td>Behandel cellen om TGF-&beta; signalering te remmen - bevordert hoge efficiëntie herprogrammering. Gebruik op 0.5 &micro;M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>Voor het verdunnen en opslaan van A-83-01 en onderdeel van Freeze Medium</td></tr><tr><td>SureCoat</td><td>Cellutron</td><td>SC-9035</td><td>Voor het coaten van schalen om MEFs te plateren</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfectie Reagens</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfectie Reagens</td></tr><tr><td>Opti-MEM Verminderd Serum Media</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>Transfectie Reagens</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor</td></tr><tr><td>pBabe-X GFP</td><td></td><td></td><td>Plasmid bevattende herprogrammeringsfactor</td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td>Voor virale inductie. Gebruik op een concentratie van 6 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Vacuum Filter + flessen (0.22 &micro;m poriën)</td><td>Nalgene</td><td>&nbsp;569-0020&nbsp;</td><td>Voor het filteren van media</td></tr><tr><td>Spuiten</td><td>Bd Vacutainer Labware&nbsp;</td><td>309654</td><td>Voor virale filtratie</td></tr><tr><td>0.45 &micro;m Filters</td><td>Celltreat</td><td>229749</td><td>Voor virale filtratie</td></tr><tr><td>70 &micro;m cel zeevers</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>352350</td><td>Voor MEF isolatie en Flow Cytometrie</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Oplossing</td><td>BD</td><td>554722</td><td>Voor fixatie en permeabilisatie van cellen voor flow cytometry</td></tr><tr><td>perm/wash buffer&nbsp;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Voor het wassen van cellen voor flow cytometry</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>Voor het wassen van cellen</td></tr><tr><td>Rundserum Albumine</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>Voor flow cytometry en calcium beeldvorming</td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G9023</td><td>Voor het blokkeren van cellen voor Flow Cytometrie</td></tr><tr><td>Ezelsserum</td><td>Sigma</td><td>D9663-10mg</td><td>Voor het blokkeren van cellen voor Flow Cytometrie</td></tr><tr><td>Muis Troponin T</td><td>Thermo Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>1:400 IF, 1:200 Flow Cytometrie</td></tr><tr><td>Muis &alpha;-actinine</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>1:400 IF, 1:200 Flow Cytometrie</td></tr><tr><td>Konijn Connexin 43</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6219</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Konijn Troponin I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>1:10000 IF</td></tr><tr><td>Alexa 488, konijn</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 555, muis</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 647, muis</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>1:200 Flow Cytometrie</td></tr><tr><td>27-kleurig ZE5 Flow Cytometer&nbsp;</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>Voor FACS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>sigma</td><td>P6148-500mg</td><td>Voor het fixeren van cellen voor IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>Voor het permeabiliseren van cellen voor IF</td></tr><tr><td>EVOS&trade; FL Kleur Beeldvormingssysteem</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td>Voor IF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>Vo

onderdrukking van pro-fibrotische signalering potentiates factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde cardiomyocytes

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Trans-differentiatie van een somatische in een ander celtype heeft een enorm potentieel aan model en behandelen van ziekten bij de mens. Eerdere studies hebben aangetoond dat muis embryonale, dermale en cardiale fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd in functionele geïnduceerde-cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs) via overexpressie van cardiogeen transcriptiefactoren, met inbegrip van GATA4, Hand2, Mef2c, en Tbx5 zowel in vitro als in vivo. Deze eerdere studies hebben echter aangetoond dat relatief lage efficiëntie. Om te herstellen na letsel hartfunctie, moeten mechanismen bestuur cardiale herprogrammering worden opgehelderd om efficiëntie en rijping van iCMs te verhogen.
Wij eerder aangetoond dat remming van pro-fibrotische signalering drastisch verhoogt de efficiëntie van de herprogrammering. Hier, detail we methoden een herprogrammering efficiëntie tot 60% te bereiken. Daarnaast beschrijven we verschillende methoden inclusief stroom cytometry, immunefluorescentie imaging en calcium imaging te kwantificeren herprogrammering efficiëntie en rijping van geherprogrammeerde fibroblasten. Met behulp van het protocol dat gedetailleerde hier, kunnen mechanistisch onderzoek plaatsvinden om te bepalen van de regelgevers van de positieve en negatieve cardiale te herprogrammeren. Deze studies kunnen identificeren signaalroutes die kunnen worden gericht om herprogrammering efficiëntie en rijping, die tot nieuwe celtherapieën leiden kan voor de behandeling van de ziekte van het hart van de mens te bevorderen.

Met behulp van de herprogrammering strategie geschetst boven en in figuur 1B, we genereerden iCMs met ongeveer 70% van de cellen uiten van cardiale troponine T en ongeveer 55% van de cellen, uiting van cardiale α-actinin, gekwantificeerd door stroom cytometry op dag 9 volgende transductie van GHMT2m (figuur 2A en B). Bovendien, de meerderheid van de cellen express cardiale troponine T, troponine I, en cardiale α-...

Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van hart re-programmering, zoals het identificeren van welke paden cardio-myogenese bevorderen of repareren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we functionele geïnduceerde cardiomyocyten kunnen genereren, met een hogere efficiëntie dan eerder gepubliceerde methoden. Deze chemische hartziekte resulteert in verlies van cardiomyocyten en verminderde hartfunctie.Daarom kan deze techniek helpen bij hoge reparatie, door fibroblasten om te zetten in functionele geïnduceerde cardiomyocyten. Om met de productie van retrovirus te beginnen, kweek Platinum E, of PE cellen in PE medium. Vul het aan met selectiemarkers in een 10CM schaal, in een bioveiligheidsniveau twee kast.Elke twee dagen passen de cellen, bij een tot vier, of een tot vijfde diluvering. Een dag voor de geplande transfectie, zaai PE cellen in 10ML groeimedium, in een 10CM kweekschaal, en schud dan voorzichtig de schalen heen en weer. Plaats de schalen voorzichtig in een incubator, om een gelijkmatige verdeling van de cellen te laten plaatsvinden, en incubeer gedurende 24 uur.Op de dag van transfectie, voeg de GHMT2M cocktail toe aan een 1.5ML buisje. Voeg vervolgens 360 microliters verminderd serummedium toe aan een aparte 1.5ML buis. Vervolgens, voeg 36 microliters transfectiereagens toe aan het verminderde serummedium en schud voorzichtig de buis om te mengen.Incubeer op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Het transfectiereagens dat in deze stap wordt gebruikt, bindt aan plastic. Om transfectie-efficiëntie te voorkomen, zorg ervoor dat het transfectiereagens direct in het verminderde serummedium wordt gepipetteerd en vermijd dat de pipettip de buiswand raakt.Voeg vervolgens het verminderde serummedium transfectiereagensmengsel toe aan de buis, die het GHMT2M DNA-cocktail bevat. Schud voorzichtig de buis om te mengen, en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg tenslotte de transfectiereactiemixtuur druppelsgewijs toe aan de PE cellen.Swiep voorzichtig de schaal gedurende 10 tot 15 seconden. Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 16 tot 20 uur bij 37 graden Celsius. Bekleed vervolgens 60MM schalen met collageen en incubeer gedurende minimaal twee uur bij 37 graden Celsius.Breng vervolgens vers ontdooid muis embryonaal fibroblasten, of MEFs in de collageen beklede schalen. En voeg groeimedium toe tot een eindvolume van 4ML per 60MM schaal. Schud voorzichtig de schalen en plaats ze in de incubator.Bij het plateren van MEFs is het belangrijk dat de cellen gelijkmatig worden geplaatst. Vermijd het schudden van de schalen, dit kan ongelijke platering veroorzaken. In plaats daarvan, schud voorzichtig de schaal heen en weer, en plaats deze voorzichtig in de incubator.24 uur na PE-celtransfectie, gebruik een 30ML spuit om het retrovirale medium te verzamelen dat door de cellen is gegenereerd. Laat de eerste verzameling van retroviraal medium door een 45 micrometer poriegrootte filter lopen, in een 50ML conische buis. Voeg vervolgens 10ML vers groeimedium toe aan de wand van de schaal, zorg ervoor dat de PE cellen niet worden verplaatst.Incubeer de cellen gedurende nog eens 24 uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 7,2 microliters van 10MG per milliliter hexidine methrine bromide transductiereagens toe aan de 50ML conische buis die het virale supernatant bevat. Aspibeer nu het medium van de MEFs en voeg 4ML van het vers geoogste retrovirale medium toe aan de schaal.Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. 48 uur na transfectie van de PE cellen, verzamel het retrovirale medium en voer de transductie op exact dezelfde manier uit als voor de eerste verzameling. Gooi de PE cellen weg na de tweede verzameling van retroviraal medium en voeg 10%bleach toe aan alle materialen in contact met retroviraal medium.Na de incubatie aspibeer het retrovirale medium van de MEFs en voeg 4ML ICM medium toe, dat 05 micromolair TGF Beta Type 1 receptor remmer bevat. Ververs elke twee dagen het ICM medium tot verder gebruik. Om met de immunokleuring te beginnen, aspibeer het ICM medium van dag 14 herprogrammeerde MEFs.Was vervolgens de cellen eenmaal met 1ML van 1X ijskoud PBS, per putje van de 12-putjesplaat. Aspibeer vervolgens de PBS, voeg 500 microliters van 2% paraformaldehyde toe om de cellen te fixeren en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Na het aspiëren van de paraformaldehyde, was de cellen drie keer met 1ML PBS.Na het aspiëren van de PBS, voeg 500 microliters van. 02% Triton X 100 toe en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Na het aspiëren van Triton X 100, blokkeer de cellen met 500 microliters van 10% paardenserum, gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.Aspibeer vervolgens het paardenserum en voeg 500 microliters van verdunde primaire antilichaam toe. Incubeer gedurende een uur op kamertemperatuur. Na het aspiëren van het primaire antilichaam, was drie keer met 1ML PBS.Na de laatste wasbeurt met PBS, voeg 500 microliters van verdund secundair antilichaam toe. Wikkel de plaat in folie en incubeer in het donker, gedurende een uur op kamertemperatuur. Aspibeer tenslotte het secundaire antilichaam en was drie keer met 1ML PBS.Wikel de plaat in folie en bewaar bij vier graden Celsius tot de beeldvorming is voltooid. Deze methode toont een hoge efficiënte omzetting van MEFs in cardiomyocyten. Een representatieve flowcytometrieanalyse, genomen dag negen na transductie, toont geactiveerde expressie van cardiale Troponin T, in ongeveer 70% van de cellen.Gelijkerwijs wordt expressie van cardiale Alpha-actinine waargenomen in ongeveer 55% van de cellen, vergeleken met de GFP transductiecontrole. Bovendien toont immunokleuring voor cardiale markers, uit

suppression-pro-fibrotic-signaling-potentiates-factor-mediated

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.

Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

We beschrijven hier een protocol voor de generatie van iCM's met behulp van retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Tbx5 en Mef2c in een polycistronisch construct. Dit protocol levert een relatief homogene populatie van geherprogrammeerde cellen met verbeterde efficiëntie en kwaliteit en is waardevol voor toekomstige studies van iCM-reprogrammering.

Verbeterde Generatie van geïnduceerde Cardiomyocytes Met behulp van een polycistronisch Construct uitdrukken optimale verhouding van GATA4, MEF2C en Tbx5

Hier wordt een methode getoond voor het visualiseren van de ultrastructuur van de extracellulaire matrix in gedecellulariseerde hartweefsels.

Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

In dit protocol demonstreren en uitwerken we over het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen voor cardiomyocyt differentiatie en zuivering, en verder, over hoe de transplantatie-efficiëntie te verbeteren met de met Rho geassocieerde proteïnekinaseremmer voor behandeling in een muis myocardinfarct model.

Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

Dit protocol demonstreert de inductie van een hemogeen programma in menselijke dermale fibroblasten door afgedwongen expressie van de transcriptiefactoren GATA2, GFI1B en FOS om hematopoietische stam en voorlopercellen te genereren.

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux...

In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter

Leer hoe je muis embryonale fibroblasten omzet in functionele cardiomyocyten via factor-gemedieerde herprogrammering met hoge efficiëntie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar hartregeneratie.

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes (Video) | JoVE Journal

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Meer video's verkennen