Name: Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Ontdek een schaalbare methode voor het genereren van cardiale progenitorcellen en ventriculaire cardiomyocyten uit menselijke pluripotente stamcellen met Activin A en Id1-overexpressie. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar hartontwikkeling en ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de lab Colas voor nuttige discussies en kritieken van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de NIH/NIEHS R44ES023521-02 en CIRM DISC2-10110 verleent aan Dr. Colas.

1. Id1 Virus voorbereiding en infectie
<ol><li>De overexpressing lentivirus Id1 door co transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G en pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR genereren (Addgene: plasmide #107735) in HEK293T cellen. Virale deeltjes verzamelen, filtraat zuiveren van het supernatant en opslaan bij-80 ° C zoals Kitamura et al. (2003) 19. als alternatief, produceren Id1 lentivirus commercieel door pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR te sturen naar een lentivirus-producerende leverancier. Let op: Volg lentivirale veiligheidsvoorschriften en standaardwerking protocollen. Opmerking: Belangrijk: optimale virus titer moet ten minste 108 tot 109 Transducing eenheden/mL (TU/mL).</li>
	<li>Jas voorafgaand aan infectie, één putje van een 96 goed plaat met 50 µl van coating reagens, meestal een gelatine-achtige eiwitten mengsel uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm muis Sarcoom cellen (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Een putje van pluripotente stamcellen gekweekt in een 6 goed plaat door toevoeging van 1 mL PBS zonder Ca2 + en Mg2 + en met 0,5 mM EDTA distantiëren. Opmerking: Dissociatie tijd varieert van 3 – 10 min. Wanneer meer dan 80% van de cellen zijn losgekoppeld van de onderkant van de plaat, verder voor volgende trede.</li>
	<li>Celsuspensie met steriele Pipetteer in 15 mL kunststof centrifugebuis verzamelen.</li>
	<li>Neutraliseer dissociatie reagens met 5 mL PBS-bevattende Ca2 + en Mg2 +.</li>
	<li>Pellet cellen door middel van centrifugeren (200 x g gedurende 3 minuten).</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en zachtjes flick de buis om te verjagen van de pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1 mL van de media van de cel van de stam.</li>
	<li>Cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller na instructies van de leverancier te tellen.</li>
	<li>Plaat 20.000 levensvatbare cellen per well (96-wells-plaat) gecoat in 50 µL van stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer (Zie tabellen 1 en 2).</li>
	<li>Na 24u, controleren voor bevestiging van de cel en media te vervangen door 100 µl stamcel media aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer en 6 ng/mL hexadimethrine bromide (Zie tabellen 1 en 2), één h vóór lentivirale infectie. Opmerking: Cellen moeten stevig worden gekoppeld aan de onderkant van de plaat.</li>
	<li>Ontdooi Id1-lentivirus op ijs.</li>
	<li>Voeg 3 µL van gezuiverde lentivirus per putje (virus titer moet tussen 108 tot 109 TU/mL), en breng de plaat terug naar cel cultuur incubator (5% CO2, 37 ° C, 20% O2).</li>
	<li>24u na virale infectie, voeg 100 µL van de cel van de stam van de nieuwe media aan de geïnfecteerde cellen.</li>
	<li>48 h na lentivirale infectie, vervangen virus met media met 200 µL van de cel van de stam van de verse media aangevuld met 1 µg/mL puromycin.</li>
	<li>Refresh media dagelijks met 200 µL van stamcel media aangevuld met 1 µg/mL puromycin.</li>
	<li>Wanneer culturen 80% confluentie bereikt, distantiëren cellen met behulp van 200 µL van PBS zonder Ca2 + en Mg2 + + 0.5 mM EDTA (voor een put van een 96-wells-plaat).</li>
	<li>Celsuspensie in een centrifugebuis verzamelen.</li>
	<li>Neutraliseer dissociatie reagens met 5 mL PBS-bevattende Ca2 + en Mg2 +.</li>
	<li>Pellet cellen door middel van centrifugeren (200 x g gedurende 3 minuten).</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en zachtjes flick de buis om te verjagen van de pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1 mL van de stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.</li>
	<li>Alle cellen (1 mL) overbrengen in een gecoate goed van een 12-well-plaat.</li>
	<li>Na 24u, monitor voor cel gehechtheid aan de media van het goed en vervangen met 1 mL van stamcel media aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer en 6 ng/mL hexadimethrine bromide, één h vóór transductie.</li>
	<li>Ontdooi Id1-lentivirus op ijs.</li>
	<li>Voeg 5 µL van gezuiverde virus per putje (12-well plaat).</li>
	<li>24u na lentivirale infectie, vervangen virus met media met 1 mL van de cel van de stam van de nieuwe media, aangevuld met 3 µg/mL puromycin.</li>
	<li>48 h post lentivirale infectie, virus met media met 1 mL van de cel van de stam van de verse media aangevuld met 6 µg/mL puromycin vervangen.</li>
	<li>Wanneer culturen 80% confluentie bereikt, distantiëren cellen met behulp van 500 µL van PBS zonder Ca2 + en Mg2 + en met 0,5 mM EDTA (voor één putje van de plaat van een 12-well).</li>
	<li>Overdracht van de helft (250 µL) van de celsuspensie aan één putje van een coating reagens gecoat 6-well plaat met 2 mL stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.</li>
	<li>Gebruik de andere helft (250 µL) van het monster voor RNA extractie en qRT-PCR om te bepalen lentivirale-gemedieerde Id1 expressie niveaus, zoals Colas et al. (2012) 4. Opmerking: Belangrijk: als Id1 mRNA uitdrukking niveaus lager zijn dan 0,005 vouw van GAPDH expressie niveau (Zie tabel 3 voor qRT-PCR inleidingen), herhaal infectie proces zoals hierboven beschreven totdat Id1 expressie niveaus hoger zijn dan de drempel.</li>
</ol>2. hPSCsId1 onderhoud
<ol><li>Cultuur hPSCsId1 in gecoate 6 goed-platen en groeien in 3 mL per putje van stamcel media aangevuld met 6 µg/mL puromycin.</li>
	<li>Wanneer hPSCsId1 80% confluentie bereikt, passage van de cellen als aggregaten (1:6 splitsingsverhouding) met behulp van enzym-vrije dissociatie reagens volgens richtlijnen van de leverancier en groeien in 3 mL per putje van stamcel media aangevuld met 6 µg/mL puromycin.</li>
</ol>3. bereiding van hPSCsId1 differentiatie
<ol><li>Jas van een 12-well plaat met 500 µL per putje coating reagens.</li>
	<li>Wanneer hPSCsId1 90% confluentie bereiken cellen distantiëren door toevoeging van 1 mL PBS zonder Ca2 + en Mg2 + en met 0,5 mM EDTA per putje voor 5-10 min. dissociatie proces elke minuut, en eens 80% van de cellen zijn losgekoppeld van de plaat , gaat u verder met de volgende stap.</li>
	<li>Celsuspensie in een centrifugebuis verzamelen.</li>
	<li>Neutraliseer dissociatie reagens met 5 mL PBS-bevattende Ca2 + en Mg2 +.</li>
	<li>Pellet cellen door middel van centrifugeren (200 x g gedurende 3 minuten).</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en zachtjes flick de buis om te verjagen van de pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter.</li>
	<li>De cellen van de plaat 300.000 per putje in 1 mL van de stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer en 6 µg/mL puromycin en overdracht plaat in weefselkweek incubator.</li>
	<li>Refresh media dagelijks met 2 mL stamcel media aangevuld met 6 µg/mL puromycin culturen tot 90% confluentie. Op dit punt, het initiëren van cardiale differentiatie (volgende stap).</li>
</ol>4. differentiatie van hPSCsId1 in eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren (FHF-L CPs)
<ol><li>Voor 12-well plaat formaat, starten differentiatie (dag 0) door vervanging van de stamcel media met 1,5 mL inductie media (tabel 1) aangevuld met Activin een (100 ng/mL) (Zie tabel 2 voor aanbevolen volumes en Activin A concentraties voor verschillende plaat formaten).</li>
	<li>Op dag 1 (24 h na differentiatie wordt gestart), door media te vervangen door 2 mL inductie media zonder Activin A (per putje van de plaat van een 12-well).</li>
	<li>Op dag 3, door media te vervangen door 2 mL inductie media zonder Activin A (per putje van de plaat van een 12-well).</li>
	<li>Op dag 5, verzamelen FHF-L CPs voor cryopreservatie (volgende stap). Opmerking: Belangrijk: Cryopreservatie heeft de voorkeur op dit punt, omdat het in staat stelt om het afkoppelen van de cardiale voorlopercellen generatie van latere cardiomyocyte productie en biobank grote batches van cellen. Opmerking dat ook dag 5 FHF-L CPs kan worden doorgegeven aan een vers beklede plaat voort te zetten van differentiatie, gelieve te verwijzen naar stap 5.1-5.5 naar passFHF-L CPs en gaat u verder met stap 6.5 voor differentiatie.</li>
</ol>5. cryopreservatie van FHF-L CPs
<ol><li>Alle media uit putten met dag 5 gecombineerd FHF-L CPs en snel Voeg 1 mL warm (37 ° C) 1 x enzym-bevattende dissociatie reagens (Zie Tabel van materialen). Plaats de plaat in de weefselkweek incubator.</li>
	<li>Na 1 minuut, schud het plaat van links naar rechts in de incubator.</li>
	<li>Na 2 min (totaal tijd), verwijder plaat uit de incubator en voeg 1 mL 10% FBS media.</li>
	<li>Zachtjes Pipetteer cellen op en neer met een 5 mL-pipet om mobiele-detachement van de plaat.</li>
	<li>Verzamelen van celsuspensie naar een centrifuge buis en pellet cellen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 3 min</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver cryopreservatie reagens.</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter.</li>
	<li>Cryopreservatie reagens toevoegen (Zie Tabel van materialen) op een voldoende volume aan het cryopreserve van de cellen op de gewenste concentratie (gewoonlijk 5-10 x 106 cellen/mL).</li>
	<li>Overbrengen van cellen naar cryopreservatie flesjes en plaats van flesjes in koeling apparaat (1 ° C/min) en plaats koeling apparaat in de vriezer-80 ° C's nachts.</li>
	<li>Na 24u, door bevroren flesjes te overbrengen in vloeibare stikstof voor lange termijn opslag. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
</ol>6. FHF-L CP differentiatie in ventriculaire-achtige Cardiomyocytes
<ol><li>Pipetteer dag 5 FHF-L CPs bevroren flesjes uit de opslag van vloeibare stikstof in droog ijs container.</li>
	<li>Plaats flesjes in het waterbad 37 ° C gedurende 2 à 3 minuten, tot celsuspensie is volledig ontdooid. Opmerking: Belangrijk: het ontdooien proces is tijdgevoelig. Cellen tot de cryopreservatie media bloot voor een buitensporige hoeveelheid tijd (dat wil zeggen, 10 min) levensvatbaarheid van de cellen zal afnemen.</li>
	<li>Cellen naar 15 of 50 mL centrifugebuis, afhankelijk van het aantal ontdooide flesjes overbrengen.</li>
	<li>Afzien van dropwise (5 druppels elke 30 seconden) voorverwarmde (37 ° C) cardiogeen media (tabel 1) tot de oplossing van de cel. Herhaal dit proces tot een 1:3 cryopreservatie media: cardiogeen media verhouding wordt bereikt. Op dit punt, de cardiogeen media toevoeging tarief te verhogen tot een 1:10 cryopreservatie media: cardiogeen media verhouding wordt bereikt. Opmerking: Belangrijk: snelle osmolariteit wijzigingen zal toenemen celdood tijdens het ontdooien; Daarom, dropwise toevoeging van cardiogeen media zoals hierboven beschreven wordt sterk aanbevolen.</li>
	<li>Centrifugeer cel schorsing en pellet cellen door middel van centrifugeren (200 x g gedurende 3 minuten).</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en zachtjes flick centrifugebuis te verjagen cel pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen met cardiogeen media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer. Opmerking: Levensvatbaarheid van de cellen kan variëren van dooi te ontdooien, en in het algemeen, > 65% levensvatbaarheid voorspelt goed plating efficiëntie.</li>
	<li>Verdunde geconcentreerd celsuspensie met cardiogeen media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject-remmer te verkrijgen van de gewenste cel concentratie voor beplating (Zie tabel 2 voor verschillende plaat formaten). Opmerking: Belangrijk: cardiale differentiatie efficiëntie kan weigeren als cellen worden overgeënt te dun.</li>
	<li>Zaad-cellen op plaat.</li>
	<li>Houd plaat in de kap van de weefselcultuur voor 20 min alvorens over te dragen aan weefselkweek incubator.</li>
	<li>Controleren op dag 6 van differentiatie, cel bijlage. Opmerking: Cardiac progenitoren zijn cryopreserved op dag 5 van de differentiatie. 24 h na het ontdooien van de cellen wordt vastgesteld op dag 6 van de differentiatie. Opmerking: De aanwezigheid van zwevende (dode) cellen is gemeenschappelijk.</li>
	<li>Op dag 7, gecombineerd van 50% van de media en vervangen met een gelijke hoeveelheid verse cardiogeen media. Opmerking: De toevoeging van RHO/ROCK traject remmer aan de cardiogeen media is niet nodig na dit punt.</li>
	<li>Vervangen door 50% van de media cardiogeen media om de andere dag.</li>
	<li>Opmerking spontane verslaan die wordt weergegeven tussen dag 11 en dag 13.</li>
	<li>Op dag 15, cardiale differentiatie efficiëntie te kwantificeren met immunofluorescentie met behulp van de DAPI (nucleus vlek) en ACTC1 (pan-cardiale marker).</li>
</ol>7. passeren en het onderhoud van ventriculaire-achtige Cardiomyocytes
Opmerking: Door de dag 14 – 16: een monolayer van spontaan aanbestedende ventriculaire-achtige cardiomyocytes moet worden verkregen. Op dit punt wordt voorgesteld te distantiëren en opnieuw cardiomyocytes Meng de cultuur te voorkomen dat cellen loskoppelen van de plaat plaat.
<ol><li>Alle media uit putten gecombineerd en snel Voeg 1 mL voorverwarmde (37 ° C) 1 x enzym-bevattende dissociatie reagens. Opmerking: 1 x enzym-bevattende dissociatie reagens volumes variëren, afhankelijk van de indeling van de plaat, maar moet volledig bedekt de bodem van het goed oppervlak.</li>
	<li>Pipetteer plaat in een incubator weefselkweek.</li>
	<li>Voorzichtig schudden plaat links naar rechts om de 2 min binnen de incubator te versnellen detachement.</li>
	<li>Na 5 – 15 min, wanneer 80% tot 100% van de cellen zijn losgekoppeld van de onderkant van de plaat, verwijderen de plaat uit de incubator en 1 x enzym-bevattende dissociatie reagens activiteit remmen door een gelijk volume van 10% FBS media toe te voegen. Opmerking: Incubatietijd met 1 x enzym-bevattende dissociatie voor dit proces zal variëren van batch tot batch.</li>
	<li>Verzamelen celsuspensie een centrifugebuis.</li>
	<li>Meng celsuspensie met pipet en het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter.</li>
	<li>Verdun celsuspensie gewenste cel concentratie (Zie tabel 2 voor verschillende plaat formaten) met onderhoud media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.</li>
	<li>Na het zaaien cardiomyocytes op het bord, de cellen verdelen en laat de cellen koppelen voor 10 – 20 min vóór de overbrenging van plaat tot weefselkweek incubator.</li>
	<li>24 h na opnieuw plating, controleren cel gehechtheid en herstel. Opmerking: De aanwezigheid van zwevende (dode) cellen is gemeenschappelijk. 48-72 uur na het opnieuw plating, cardiomyocyte moet hervatten spontane contractie.</li>
	<li>Als u wilt behouden cardiomyocyte cultuur, vervangen door 50% van de media de media onderhoud om de andere dag tot gebruik van ventriculaire-achtige cardiomyocytes voor latere experimenten.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510, 273-277 (2014).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+cardiomyocytes+reveal+abnormal+TGF-beta+signalling+in+left+ventricular+non-compaction+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy.</a> Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li>
<li>Colas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+microRNA+screening+identifies+let-7+and+mir-18+as+regulators+of+germ+layer+formation+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis.</a> Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).</li>
<li>Cunningham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+genes+are+essential+for+early+heart+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Id genes are essential for early heart formation.</a> Genes & development. , (2017).</li>
<li>McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+generation+of+multipotent+mesoderm+%28Kdr%2B%29+progenitor+cells+in+mouse+embryonic+stem+cells+for+functional+genomics+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening.</a> Current protocols in stem cell biology. , Chapter 1, Unit 1F 13(2012).</li>
<li>McKeithan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+assessment+of+congenital+and+drug-induced+arrhythmia+with+hipsc-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+physiology%22%5BJournal%5D)">An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in physiology. 8, 766(2017).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science translational medicine. 9, (2017).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24930130">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature methods. 11, 855-860 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).</li>
<li>Willems, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+TGF-beta+type+II+receptor+degradation+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR%2B+embryonic-stem-cell-derived+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453, 524-528 (2008).</li>
<li>Palpant, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+high-purity+cardiac+and+endothelial+derivatives+from+patterned+mesoderm+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells.</a> Nature protocols. 12, 15-31 (2017).</li>
<li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental cell. 39, 480-490 (2016).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).</li>
<li>Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1509267">Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy.</a> New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+hematology%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor succesvolle differentiaties, zorg ervoor dat instructies boven op de voet volgen. Bovendien, markeren we hier sleutelparameters die differentiatie resultaten sterk te beïnvloeden. Voordat u begint een differentiatie, de volgende drie morfologische parameters moeten worden nageleefd: de morfologie van een stam van hPSCsId1, een hoge cellulaire verdichting en een hoge samenloop (> 90%) van de cultuur op dag 0. In dat opzicht optimale differentiatie voorwaarden zijn beste gemaakt door beplating los gezien hP...

Grootschalige productie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)-afgeleide cardiale progenitoren en cardiomyocytes is een eerste vereiste voor stamcel gebaseerde therapieën1, modelleren van2,3 en de snelle karakterisering van ziekte nieuwe trajecten regulering van de cardiale differentiatie4,5,6 en fysiologie7,8. Hoewel een aantal studies9,10,11,12,13,14hebben,15 eerder beschreven hoogefficiënte de protocollen van de cardiale differentiatie van hPSCs, geen heeft gericht de hart veld oorsprong van resulterende cardiomyocytes, ondanks de identificatie van moleculaire verschillen tussen links (eerste hart veld) en rechts (tweede hart-veld) ventriculaire cardiomyocytes16 en het bestaan van hart veld-specifieke aangeboren hartziekten; dat wil zeggen, hypoplastic linker hart syndroom17 of arrhythmogenic recht ventriculaire dysplasie18. Dus, de generatie van cardiale voorlopercellen en cardiomyocytes van gedefinieerde hart veld oorsprong van hPSCs wordt steeds een noodzaak teneinde hun relevantie als therapeutische en ziekte modeling tools.
Dit protocol is gebaseerd op de constitutieve overexpressie van Id1, een onlangs geïdentificeerde5 eerste hart veld-opgeven cue thats in combinatie met Activin A, noodzakelijk en voldoende zijn om te starten van cardiogenesis in hPSCs. Met name Cunningham et al. (2017) 5 Toon dat Id1-geïnduceerde progenitoren specifiek express eerste hart-veld (HCN4, TBX5) maar niet het tweede hart veld markeringen (SIX2, ISL1) als ze cardiale differentiatie ondergaan. Bovendien, tonen de auteurs ook dat transgene muis embryo's ontbreekt de hele Id familie van genen (Id1-4), zonder dat zij eerste hart veld cardiale progenitorcellen, terwijl meer mediaal en posterieure cardiale progenitoren (vormen ontwikkelen tweede hart-veld) kan nog steeds vormen, waardoor suggereren dat Id eiwitten essentieel zijn voor het eerste hart veld cardiogenesis geactiveerd in vivo. Gunstig, Id1-geïnduceerde progenitoren kunnen worden cryopreserved en spontaan onderscheiden in cardiomyocytes ventriculaire-achtige kenmerken, met inbegrip van ventriculaire-specifieke markeringen (IRX4, MYL2) expressie weer te geven en ventriculaire-achtige actie potentieel.
Hier beschrijven we een eenvoudige en schaalbare methode voor het genereren van eerste hart veld-achtige (FHF-L) cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van Id1 overexpressing hPSCs. Een belangrijk kenmerk van dit protocol is de mogelijkheid om het afkoppelen van cardiale voorlopercellen generatie van latere cardiomyocyte productie met behulp van een handige cryopreservatie stap. Kortom, dit protocol gegevens de nodige maatregelen om (1) genereren Id1-overexpressing hPSCs, (2) genereren FHF-L cardiale progenitoren uit hPSCs (3) cryopreserve van de resulterende progenitoren en (4) hervatten FHF-L cardiale voorlopercellen differentiatie en genereren hoogverrijkt (> 70-90%) ventriculaire-achtige cardiomyocytes gewonnen.

<table><tbody><tr><td>ACTC1 antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Activine A</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Hu Recom Activin A</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement zonder - insuline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement zonder - vitamine A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>CDH5 antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7930</td><td>Cryopreservation reagent</td></tr><tr><td>DMEM met hoge glucose</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS met Ca &amp; Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt membraanpotentiaal kit&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td>Voor optische actiepotentiaalregistratie, zie McKeithan et al. 2017</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Coating reagent</td></tr><tr><td>mTeSR1 media kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>PBS zonder Ca &amp; Mg</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycin&nbsp;</td><td>Acros</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td>Enzymevrije dissociatiereagent</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TAGLN antibody</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72254</td><td>RHO/ROCK-route-remmer</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605 -010</td><td>1X enzym-bevattend dissociatiereagens</td></tr><tr><td>Tyrodes oplossing mix-pakketten&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td><td>(Voor optische actiepotentiaalregistratie, zie McKeithan et al. 2017)</td></tr></tbody></table>

generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

De generatie van grote hoeveelheden van functionele menselijke pluripotente stamcellen cardiale voorlopercellen en cardiomyocytes van gedefinieerde hart veld oorsprong is een vereiste voor cel-gebaseerde cardiale therapieën en modellering van de ziekte. We hebben onlangs aangetoond dat Id genen zowel noodzakelijk zijn en voldoende om aan te geven van de eerste veld voorlopercellen van het hart tijdens de ontwikkeling van de gewervelde. Deze differentiatie-protocol maakt gebruik van deze bevindingen en Id1 overexpressie gebruikt in combinatie met Activin A potent opgeven signalen te produceren eerste hart veld-achtige (FHF-L) progenitoren. Bovenal differentiëren resulterende progenitoren efficiënt (~ 70-90%) in ventriculaire-achtige cardiomyocytes. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode 1) worden gegenereerd Id1-overexpressing hPSCs en 2) schaalbare hoeveelheden cryopreservable FHF-L progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes onderscheiden.

Generatie van hPSCs Id1 lijnen hPSCs zijn besmet met een lentivirus bemiddelen Id1 overexpressie(Figuur 1). Zodra hPSCId1 worden gegenereerd, wordt transgenic expressie gekwantificeerd door qRT-PCR (Figuur 1B). Alleen hPSCId1 regels uitdrukken Id1 mRNA niveau groter is dan 0,005 vouw die van GAPDH<...

Hier beschrijven we een schaalbare methode, met behulp van een eenvoudige combinatie van Activin A en lentivirus-gemedieerde Id1-overexpressie, voor het genereren van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Het grootste voordeel van deze eenvoudige techniek is het genereren van cardiale progenitors en cardiomyocyten van gedefinieerde hartveld-oorsprong en -subtypes. De resulterende cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor een breed scala aan onderzoekstoepassingen, waaronder fundamentele ontwikkelingsbiologie, proof-of-concept cel-gebaseerde therapie en studies naar modellering van hartziekten. Sean Spiering en Michael Yu uit mijn laboratorium zullen de procedure demonstreren.Om te beginnen, coat je voldoende putjes van een 96-putjesplaat met 50 microliter coatingreagens om de volgende stappen voor celzaaien en virale infectie te kunnen uitvoeren, en voeg dan een milliliter dissociatiereagens toe aan een put in de zes-putjesplaat om de gezaaide pluripotente stamcellen los te maken. Gebruik vervolgens een steriele pipet om de celsuspensie over te brengen naar een 15-milliliter plastic centrifugeerbuis. Voeg in de buis vijf milliliter PBS met calcium en magnesium toe om het dissociatiereagens te neutraliseren.Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende drie minuten bij 200 keer g. Na het centrifugeren gooi je het supernatant weg en schudt je voorzichtig de buis om de pellet los te maken. Los vervolgens de cellenpellet op in een milliliter stamcelmedium.Gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller om het aantal cellen te tellen. Zodra het tellen is voltooid, zaai je 20.000 levensvatbare cellen in elke put van een 96-putjesplaat die 50 microliter stamcelmedium bevat, aangevuld met een RHO/ROCK-remmingsmiddel van twee micromolair. Controleer na 24 uur de celhechting en vervang vervolgens het medium een uur voor de lentivirale infectie door 100 microliter stamcelmedium.Thaw vervolgens het Id1-lentiviruus op ijs en voeg drie microliter gezuiverd lentivirus toe per put. Breng de plaat na toevoeging van het lentivirus terug naar de celcultuurincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Voeg 24 uur na de virale infectie 100 microliter vers stamcelmedium toe aan de geïnfecteerde cellen.Na 48 uur vervang je het virusbevattende medium door 200 microliter vers stamcelmedium, aangevuld met één microgram per milliliter puromycine. Ververs elke dag het medium met vers 200 microliter stamcelmedium, aangevuld met één microgram per milliliter puromycine. Begin op dag 0 met het differentiatieproces door het stamcelmedium te vervangen door 1,5 milliliter inductiemedium met Activin A in een 12-putjesplaat.24 uur nadat de differentiatie is gestart, vervang je het medium door twee milliliter inductiemedium zonder Activin A. Vervang op de derde dag door twee milliliter inductiemedium zonder Activin A. Op de vijfde dag zuig je het gehele medium uit de put met de FHF-L CP's en voeg je onmiddellijk een milliliter warm enzymbevattend dissociatiereagens toe in de put, en incubeer je de cultuurplaat bij 37 graden Celsius. Na een minuut schudt je de plaat in de incubator en haalt je deze na twee minuten uit de incubator, en voeg je een milliliter medium met 10% foetaal bovien serum toe in de put. Maak de cellen los van de plaat door voorzichtig met de pipet de cellen op en neer te pipetten.Breng vervolgens de celsuspensie over naar een centrifugeerbuis en centrifugeer deze. Na de centrifugatie lost u de cellenpellet op in twee milliliter cryopreserveringsreagens en telt u het aantal cellen. Breng vervolgens de cellen over in de cryopreserveringsbuisjes en laat de buisjes afkoelen.Breng vervolgens het apparaat gedurende een nacht bij min 80 graden Celsius. Na 24 uur breng je de buisjes in vloeibare stikstof over voor langdurige opslag. Vlak voor het ontdooien van de FHF-L CP's coat je de putten van de 12-putjesplaat met twee milliliter coatingreagens.Breng vervolgens de vijf dagen oude FHF-L CP's over vanuit de vloeibare stikstof in een droog ijscontainer. Breng vanaf het droog ijs de buis over naar een waterbad van 37 graden Celsius gedurende twee minuten om volledige ontdooiing te garanderen. Nadat de cellen volledig zijn ontdooid, breng je de cellen over naar een centrifugeerbuis en pipetteer je elke 30 seconden 10 druppels voorverwarmd cardiogeen medium in de celoplossing.Voeg het cardiogeen medium door totdat de verhouding cryopreserverings- en cardiogeen medium één op drie bedraagt. Breng de cellen vervolgens onder invloed van centrifugatie. Verwijder na de centrifugatie het supernatant en schudt u voorzichtig de buis, en lost u de cellenpellet op in cardiogeen medium, aangevuld met een RHO/ROCK-remmingsmiddel van twee micromolair.Verdun vervolgens de celsuspensie met cardiogeen medium om de gewenste celconcentratie te bereiken. Zaai vervolgens de cellen op de cultuurplaat met twee milliliter cardiogeen medium. Laat de plaat 20 minuten in de weefselcultuurhood staan voordat je hem naar de incubator verplaatst.Controleer op de zesde dag van differentiatie de celhechting. Op de zevende dag zuig je de helft van het cardiogeen medium af en vervang je het door vers medium. Vervolgens ververs je elke dag 50% van het cardiogeen medium en op de vijftiende dag kwantificeer je de hartdifferentiatie.Hier wordt het expressieniveau van Id1-mRNA gekwantificeerd in de hESC- en hPSC-cellijnen. Alleen hPSC-lijnen die Id1-mRNA expresseren op niveaus hoger dan 0,005-voudig GAPDH worden gebruikt voor differentiatie. Hier worden helderveldbeelden getoond na differentiatie van optimale, subconfluente en overconfluente hPSC's op dag 0.Bij verdere differentiatie bereiken de cellen na 24 uur een confluency van 75%. Op dag 3 vormen de differentiërende cellen een cluster en op dag 5 blijven de cellen in nauw verbonden clusters met een homogene morfologie. Op dag 6 bedekken de FHF-L CP's meer dan 90% van de oppervlakte van de putten.In feite beginnen de cardiomyocyten op dag 12 te kloppen en hartcontracties te vertonen. Verder in het differentiatieproces zijn er verhoogde mRNA-expressieniveaus van MYL2 en IRX4 na dag 15. Beide eiwitten vertegenwoordigen ventriculaire-specifieke markers binnen de cardiomyocyten.Hier vertegenwoordigt de actiepotentiaal de snelle

generation-first-heart-field-like-cardiac-progenitors-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Het doel van deze methode is het genereren van hartgebied-specifieke cardiale stamcellen in vitro om de stamvader cel specificatie en functionele eigenschappen te bestuderen, en het genereren van kamer specifieke cardiale cellen voor hart-en vaatziekten modellering.

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Hier beschrijven we een protocol om ontwikkelingsrelevante menselijke hartorganoïden (hHO's) efficiënt te maken met behulp van menselijke pluripotente stamcellen door zelforganisatie. Het protocol is gebaseerd op de sequentiële activering van ontwikkelingssignalen en produceert zeer complexe, functioneel relevante menselijke hartweefsels.

Het genereren van zelfassemblerende organoïden voor het menselijk hart afgeleid van pluripotente stamcellen

Hier wordt een reeks protocollen gepresenteerd voor het genereren en cryopreservatie van cardiale sferoïden (CSs) uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten gekweekt in een multidimensionaal formaat met hoge doorvoer. Dit driedimensionale model functioneert als een robuust platform voor ziektemodellering, high-throughput screenings en behoudt zijn functionaliteit na cryopreservatie.

Generatie, high-throughput screening en biobanking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiale sferoïden

Ontdek een schaalbare methode voor het genereren van cardiale progenitorcellen en ventriculaire cardiomyocyten uit menselijke pluripotente stamcellen met Activin A en Id1-overexpressie. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar hartontwikkeling en ziekte.

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen