Name: Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer multi-color lokalisatie microscopie van membraaneiwitten in levende zoogdiercellen met zelf-labelende eiwitten. Deze methode bereikt ~18 nm resolutie voor precieze eiwitdynamica in organellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank de biofysica groep en Jacob Piehler op de Universiteit Osnabrück voor continue ondersteuning, Wlodizlaus Kohl voor technische bijstand en voorbereiding van materiaal en het bestuur van de CellNanOs voor het verstrekken van microscopen voor gebruik. Het project werd gefinancierd door het SFB 944.

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences ">https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences </a> (2016).</li>
<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).</li>
<li>Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+mobility+in+mitochondrial+membranes+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Graham, F. L., van der Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52 (2), 456-467 (1973).</li>
<li>Wedeking, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+Controlled+Reorganization+of+Signaling+Complexes+in+the+Plasma+Membrane+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells.</a> Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).</li>
<li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth1171">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159).</a> Nature Methods. 5 (5), 455(2008).</li>
<li>Elmokadem, A., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Drift+Correction+for+Superresolution+Localization+Microscopy+with+Bayesian+Inference%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference.</a> Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).</li>
<li>Barlag, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+super-resolution+imaging+of+proteins+in+living+Salmonella+enterica+using+self-labelling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes.</a> Sci Rep. 6, 31601(2016).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Jin, S., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-Mediated+Mitophagy+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).</li>
<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
<li>Wiedemann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinery+for+protein+sorting+and+assembly+in+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane.</a> Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).</li>
<li>Thompson, R., Larson, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier, werd een techniek voor het dubbele kleur enkel molecuul lokalisatie van mobiele membraaneiwitten gepresenteerd. Na het protocol, de membraaneiwitten worden gesmolten tot zelf labelen van eiwitten die met de kleurstoffen rhodamine TMR en SiR geconjugeerd met hun respectieve substraten reageren. Rhodamine kleurstoffen zijn helder en photostable en dus zorgen voor de repetitieve imaging1. Voor succesvolle prestaties moeten verschillende voorwaarden en kritische onderwerpen in gedachten worden g...

Het doel van dit protocol is bedoeld als een beeldvorming methode voor het lokaliseren en het bijhouden van één membraaneiwitten in levende cellen. We noemen deze methode Tracking en lokalisatie microscopie (TALM)1,2. Net als stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)3 en fluorescentie Photoactivation lokalisatie microscopie ((F) PALM)4,5is TALM een fluorescentie van één molecuul gebaseerde lokalisatie-techniek. Het verschilt echter in de weg dat de mobiliteit van membraaneiwitten in combinatie met repetitieve beeldvorming van hetzelfde label molecuul op verschillende posities onthult de microcompartment dat toegankelijk is voor de mobiele proteïne. Met andere woorden, worden de mogelijke taalversies van de proteïne ingesteld door de architectuur van het organel en de mobiliteit van de eiwit-1. De methode is complementair aan verschillende andere super resolutie technieken6,7,8 , omdat hieruit blijkt lokalisatie en traject kaarten door imaging mobiele eiwitten. De etikettering is gebaseerd op het gebruik van genetisch gemanipuleerde fusie-eiwitten die per se niet-belichting fluorescerende. Deze fusie-eiwitten zijn enzymen die covalent met een substraat geconjugeerd met een kleurstof reageren zelf labelen. Deze procedure heeft het voordeel dat de labeling mate kan worden gecontroleerd door de hoeveelheid toegevoegde substraat. Bovendien, u kunt variëren de kleur van de fluorescentie, afhankelijk van de gekozen geconjugeerd kleurstof. Verschillende zelfstandige labeling enzym-tags zijn beschikbaar9. Een ander voordeel van het gebruik zelf labelen enzym-tags is, dat de geconjugeerd kleurstoffen meestal zijn stabieler en helderder dan tl eiwitten1 en individuele eiwitten dus worden meer opgenomen kunnen en meer juist totdat ze worden gebleekt. Dit zorgt voor de opname van de trajecten van mobiele eiwitten en de winning van diffusie coëfficiënten10,11.
Hier, we de haalbaarheid van TALM met mitochondriale membraaneiwitten aantonen, maar het kan ook worden toegepast voor andere intra - en extra - cellular membraaneiwitten, met inbegrip van andere cel typen12,13. We laten zien dat multi-color TALM verder voor de gelijktijdige onderscheid van proteïnen in verschillende subcompartments in complementatie bestaande super resolutie fluorescentie microscopie technieken14,15, zorgt 16. TALM is compatibel met levende cel imaging17. De foto-fysica van de gekozen rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) en silicium-Rhodamien (SiR), in het bijzonder hun helderheid en stabiliteit, kunt opnemen één membraaneiwitten via meerdere frames bieden lokalisatie (en traject) kaarten. TALM is echter beperkt voor de lokalisatie van oplosbare eiwitten met hoge diffusie coëfficiënten omdat de bewegingsonscherpte te hoog is en de verzamelde fotonen per frame te laag voor goede lokalisatie zijn. Bovendien, TALM vereist minder excitatie-macht dan bijvoorbeeld STORM of gestimuleerd emissie uitputting (STED) microscopie6,7, vermindering van de fototoxische effecten. Dit is belangrijk, aangezien fototoxische stress vaak organellar morfologie18 en aldus de mobiliteit analyse19 beïnvloedt. Kortom, we presenteren Multi-Color TALM in levende cellen als een techniek die een leemte tussen de lokalisatie Microscopie methodes STORM/STED vult / (F) PALM en technieken die eiwit mobiliteit zoals fluorescentie herstel na photobleaching analyseren (FRAP)20 ,21, fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS)22en fluorescentie correlatie spectroscopie (FCCS)11,23steken.

<table><tbody><tr><td>(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES)</td><td>Biochrom</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1: Dichroic beam splitter&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>discontinued</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca &amp; Mg)</td><td>Sigma-Aldrich &amp; Co.</td><td>#RNBF8311</td><td></td></tr><tr><td>Earle&acute;s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l)</td><td></td><td></td><td>Imaging medium</td></tr><tr><td>Earle&acute;s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA)</td><td></td><td></td><td>Growth medium</td></tr><tr><td>EF: Emission filter quadbandpass</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>Andor iXON 897</td><td>EMCCD camera</td></tr><tr><td>Emission filter QuadView filter cubes, orange</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637</td><td>bandpass 582 - 619 nm</td></tr><tr><td>Emission filter QuadView filter cubes, red</td><td>Chroma</td><td></td><td>bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS (Fetal bovine serum) superior</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent beads: TetraSpeck&trade; Microspheres, 0.1 &micro;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>fluorescent microspheres</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Biochrom</td><td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks</td></tr><tr><td>Hela cells CI::paGFP, stable</td><td>Muster et al., PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image splitter</td><td>Photometrics</td><td>Dual-View QV2</td><td>image splitter emission</td></tr><tr><td>Imaging processing software&nbsp;</td><td>ImageJ2 / Fiji</td><td>freeware</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser 561 nm, 200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>561 nm emission</td></tr><tr><td>Laser 642 nm, 140 mW</td><td>Omicron</td><td>Luxx-642-140</td><td>642 nm emission</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>version R2013a</td><td></td></tr><tr><td>MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR</td><td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred</td><td>Biochrom</td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td>dye</td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Green FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>dye</td></tr><tr><td>Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer&nbsp;</td><td>Rapp Polymere GmbH Tübingen</td><td></td><td>coverslip coating</td></tr><tr><td>non-essential amino acids (NEAA)</td><td>Biochrom</td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 %</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art No. 0263.1</td><td>coverslip coating</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom</td><td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression</td><td>Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (1.2 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich &amp; Co.</td><td>Cat. No.P9155</td><td>coverslip coating</td></tr><tr><td>RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim</td><td></td><td>coverslip coating / Intergrin receptor motif</td></tr><tr><td>Silicon Rhodamine linked to HaloTag&reg;-Ligand (SiRHTL)&nbsp;</td><td>personal gift from Kai Johnson</td><td></td><td>dye</td></tr><tr><td>Software analysis plugin</td><td>self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell&reg; TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar)&nbsp;</td><td>New England Biolab&reg;</td><td>S9105S</td><td>dye</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine linked to HaloTag&reg;-Ligand (TMRHTL)&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td>dye</td></tr><tr><td>TIRF condensor</td><td>Olympus</td><td>Cell^TIRF MITICO System</td><td>TIRF condensor</td></tr><tr><td>TIRF microscope controlling software</td><td>Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF objective</td><td>Olympus</td><td>150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>Water H2O 99,5 % Rotipuran&reg; Low organic&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art. No. HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Kennis over de lokalisatie van eiwitten in de cellulaire subcompartments is van cruciaal belang te begrijpen hun specifieke functie. Hier presenteren we een super resolutie-techniek die het mogelijk voor de bepaling van de microcompartments die toegankelijk zijn voor de eiwitten maakt door het genereren van lokalisatie en het bijhouden van de kaarten van deze proteïnen. Bovendien, door Multi-Color lokalisatie microscopie, de lokalisatie en bijhouden van de profielen van proteïnen in verschillende subcompartments worden verkregen gelijktijdig. De techniek is specifiek voor de levende cellen en is gebaseerd op de repetitieve beeldvorming van interne mobiele membraaneiwitten. Proteïnen van belang zijn genetisch gefuseerd met specifieke, zogenaamde zelf labeling tags. Deze tags zijn enzymen die met een substraat op covalente wijze reageren. Geconjugeerd met deze substraten zijn fluorescente kleurstoffen. Reactie van de enzym-gelabelde proteïnen met de fluorescentie label substraten resultaten in gelabelde proteïnen. Hier, worden Tetramethylrhodamine (TMR) en silicium Rhodamine (SiR) gebruikt als fluorescente kleurstoffen die zijn aangesloten op de verschillende ondergronden van de enzymen. Met behulp van substraat concentraties in de pM naar nM-bereik, wordt sub stoichiometrische labeling bereikt die tot verschillende signalen leidt. Deze signalen zijn gelokaliseerd met ~ 15 – 27 nm precisie. De techniek maakt het mogelijk voor Multi-Color beeldvorming van afzonderlijke moleculen, waarbij het aantal kleuren wordt beperkt door de beschikbare membraan-permeabele kleurstoffen en het repertoire van zelf labeling enzymen. Laten we de haalbaarheid van de techniek door bepaling van de lokalisatie van de kwaliteitscontrole enzym (Pten)-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) in verschillende mitochondriale compartimenten tijdens de verwerking ervan in relatie tot andere membraaneiwitten. De test voor echte fysieke interactie tussen anders gelabelde interne eiwitten door enkel molecuul FRET of co tracking is echter beperkt, omdat de lage labeling graden de kans verlagen voor het feit dat twee aangrenzende eiwitten label op hetzelfde moment. Terwijl de techniek sterk is voor imaging-eiwitten in het membraan compartimenten, in de meeste gevallen is het niet passend om te bepalen van de lokalisatie van uiterst mobiele oplosbare eiwitten.

Multi kleur beeldvorming en colocalization analyse kan helpen om te bepalen van de sub-organellar lokalisatie van eiwitten. We toonden dit eerder met de cytosolische fosfatase en Tenzin homologe, PINK1, die verschillende sub-mitochondriale locaties als gevolg van de verwerking ervan door mitochondriale proteasen17 heeft. PINK1 is een belangrijke factor die mitochondrial functionaliteit34,35te garanderen. Om...

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Deze techniek kan cruciale vragen beantwoorden in regulerende processen, zoals welke rol eiwitdynamiek en organisatie spelen in functionele aanpassing. Het grote voordeel van deze techniek is dat het in levende cellen kan worden uitgevoerd, waardoor eiwitdynamiek op het niveau van enkele moleculen kan worden onthuld. Hoewel deze methode oorspronkelijk werd geïmplementeerd om inzicht te geven in de ruimte-tijdelijke organisatie van mitochondriale membraaneiwitten, kan het ook worden toegepast op andere organellen en andere membraaneiwitten.De techniek wordt gedemonstreerd door Timo Appelhans, een afstudeerstudent uit mijn lab. Na het transfecteren en voorbereiden van celmonsters en de microscoop volgens het tekstprotocol, monteer het voorbereide monster met fluorescerende kralen in de monsterhouder tussen de PTFE-ring en de rode rubberen ring. Start de microscoop, alle hardwarecomponenten en alle software die nodig is voor microscopie.Gebruik een vers, pluisvrij tissue gespoten met isopropanol om de objectieflens en de onderkant van het dekglas schoon te maken. Plaats vervolgens een druppel immersieolie op de pupil van de objectieflens. Plaats vervolgens de monsterhouder met het kra

multi-color-localization-microscopy-single-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Conventionele BODIPY conjugaten kunnen worden gebruikt voor live-cel single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) door de exploitatie van hun tijdelijk vormende, rood verschoven grond staat dimers. We presenteren een geoptimaliseerd SMLM-protocol om subcellulaire neutrale lipiden en vetzuren in levende zoogdier- en gistcellen op nanoscopische lengteschaal te volgen en op te lossen.

Conventionele BODIPY Conjugates voor Live-Cell Super-Resolution Microscopie en Single-Molecule Tracking

Dit protocol presenteert een workflow voor de voortplanting, differentiatie en kleuring van gekweekte SH-SY5Y-cellen en primaire hippocampusneuronen van ratten voor visualisatie en analyse van de mitochondriale ultrastructuur met behulp van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie.

Het gebruik van levende cel STED beeldvorming om de ultrastructuur van het mitochondriale binnenmembraan in neuronale celmodellen te visualiseren

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Dit protocol beschrijft expressie en kwantificatie van neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van de zoogdier-Neuro-2a-cellijn. pH-gevoelige fluorescentielabels en confocale microscopie maken een nauwkeurige evaluatie mogelijk van receptorlokalisatie bij het plasmamembraan ten opzichte van die in pH-neutrale intracellulaire compartimenten, wat de studie van nAChR-transport en farmacologische modulatie vergemakkelijkt.

Lokalisatie van plasmamembraan en intracellulaire neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van kwantitatieve beeldvorming in zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

Leer multi-color lokalisatie microscopie van membraaneiwitten in levende zoogdiercellen met zelf-labelende eiwitten. Deze methode bereikt ~18 nm resolutie voor precieze eiwitdynamica in organellen.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Meer video's verkennen