Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren
June 30th, 2018
Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.
Deze techniek kan cruciale vragen beantwoorden in regulerende processen, zoals welke rol eiwitdynamiek en organisatie spelen in functionele aanpassing. Het grote voordeel van deze techniek is dat het in levende cellen kan worden uitgevoerd, waardoor eiwitdynamiek op het niveau van enkele moleculen kan worden onthuld. Hoewel deze methode oorspronkelijk werd geïmplementeerd om inzicht te geven in de ruimte-tijdelijke organisatie van mitochondriale membraaneiwitten, kan het ook worden toegepast op andere organellen en andere membraaneiwitten.
De techniek wordt gedemonstreerd door Timo Appelhans, een afstudeerstudent uit mijn lab. Na het transfecteren en voorbereiden van celmonsters en de microscoop volgens het tekstprotocol, monteer het voorbereide monster met fluorescerende kralen in de monsterhouder tussen de PTFE-ring en de rode rubberen ring. Start de microscoop, alle hardwarecomponenten en alle software die nodig is voor microscopie.
Gebruik een vers, pluisvrij tissue gespoten met isopropanol om de objectieflens en de onderkant van het dekglas schoon te maken. Plaats vervolgens een druppel immersieolie op de pupil van de objectieflens. Plaats vervolgens de monsterhouder met het kralenmonster op het microscoopplatform zodat de onderkant van het dekglas contact maakt met de olie.
Focus vervolgens op de kralen door transmissielicht of een laserlijn te gebruiken. Pas de kracht van de twee excitatielasers aan om een vergelijkbare signaaldichtheid in de twee fluorescentiekanalen te bereiken. Zoek vervolgens naar een gebied met veel verschillende fluorescente signalen.
Genereer een samengevoegd beeld van de fluorescente kanalen door gebruik te maken van de camerabesturingssoftware. Gebruik vervolgens de schroeven bij de beeldsplitter om de interne optische beeldsplitter handmatig te kantelen om de beste overlap van de signalen uit de twee fluorescentiekanalen te bereiken. Start de TIRF-microscoopbesturingssoftware en kies om individuele kanalen weer te geven in de live-streammodus.
Maak een momentopname van alle kanalen waarin fluorescentie wordt opgewekt. Gebruik vervolgens deze afbeelding om de transformatiematrix te produceren. Start de softwareanalyse-plugin en laad de eerder opgenomen dual-color afbeeldingen van fluorescente kralen in de software.
Kies de gebruikte oriëntatie van de fluorescente kanalen. Klik op Ja wanneer u wordt gevraagd om afbeeldingen te kalibreren en selecteer de eerder genomen momentopname. Open de eenheidsbeheerder om eenheidconversiefactoren te definiëren en open vervolgens de lokalisatiebeheerder.
Om de puntspreidingsfunctie, of PSF, te bepalen, drukt u op de knop PSF-radius. Definieer in het geopende PSF-venster van de numerieke apertuur en de emissiemaximum. Klik vervolgens op PSF-radius schatten.
Accepteer vervolgens de verkregen experimentele PSF. Definieer de evaluatiebox, het aantal deflatielussen en hoeveel kernen van de computer worden gebruikt voor berekening. Druk vervolgens op Lokaliseren om de intensiteitsverdeling van enkele deeltjes te passen, met behulp van een 2D symmetrische Gaussische functie.
Open de kalibratiemanager. In de gerenderde, samengevoegde afbeelding van de twee kanalen, worden het oorspronkelijke signaal en de gelokaliseerde centra getoond. Kies de affine modus.
Verbind vervolgens handmatig de overeenkomstige paren van gelokaliseerde centra in de twee kanalen, die afkomstig zijn van dezelfde fluorescente kraal, door een verbindingslijn te tekenen. Verbind de overeenkomstige signalen verdeeld over het gezichtsveld. Druk vervolgens op Accepteren en sla de transformatiematrix op.
Om enkelvoudige moleculaire beeldvorming van mitochondriale membraaneiwitten uit te voeren, monteer de specimendekslip tussen de rubberen en PTFE-ringen. Vul vervolgens de kamer met 0,5 tot 0,8 milliliter beeldvormingsmedium. Reinig de objectieflens en de onderkant van het dekglas.
Gebruik vervolgens transmissielicht of een laserlijn om op de cellen te focussen, nadat er een druppel olie op de lens is toegevoegd. Pas vervolgens de kracht van de twee excitatielasers aan om een vergelijkbare intensiteit te bereiken en zoek naar een gebied met veel fluorescente signalen. Pas de verlichtingshoek in de TIRF-microscoopbesturingssoftware aan om een invalshoek te creëren die kleiner is dan de kritische hoek, of de TIR-modus, om het specifieke gebied van belang via een HILO-blad te exciteren.
Het aanpassen van de verlichting van de TIRF-microscoop om celorganellen te exciteren met behulp van de HILO-verlichting vereist een snelle beoordeling van de signaal-tot-achtergrondverhouding en ervaring in TIRF-microscopie, evenals kennis van celmorfologie. Stel de EM-versterking in en kies een belichtingstijd die geschikt is voor het experiment dat voldoende fotonen per frame verzamelt. Pas vervolgens de laserkracht aan om een hoge signaal-ruisverhouding te bereiken, aangezien deze verhouding direct correspondeert met de lokalisatieprecisie.
Zoek een gebied in de celperiferie met niet-overlappende, langwerpige mitochondriën en enkele molecuulsignalen. Als er geen enkele signalen zichtbaar zijn in een of beide kanalen, wacht tot bleken resulteert in het verschijnen van enkele molecuulsignalen. In het geval dat slechts één kanaal moet worden gebleekt, zet de laser van het andere kanaal uit om bleken te voorkomen, voordat dit kanaal wordt opgenomen.
Neem op totdat het aantal signalen te laag is voor redelijk vervolg. Start de beeldverwerkingssoftware en controleer mitochondriale structuren door een cumulatieve rendered-sum afbeelding van minimaal 1.000 opgenomen frames te genereren. Start de softwareanalyse-plugin.
Om gegevensverwerking voor lokalisatie en tracking uit te voeren, laadt u de ruwe gegevens. Controleer meerkleurig. Kies de juiste oriëntatie van beide kanalen.
Wanneer u wordt gevraagd om afbeeldingen te kalibreren, laadt u de transformatiematrix. De kanalen worden afzonderlijk weergegeven. Open de ruwe gegevens van de beeldcontainer door op Tonen te klikken.
Open vervolgens de eenheidsbeheerder in het bovenste tabblad en definieer de eenheidconversiefactoren in elk kanaal. Open de lokalisatiebeheerder in het bovenste tabblad en definieer de evaluatiebox en het aantal deflatielussen. Klik op PSF-radius om de PSF-schatting te openen.
Stel de numerieke apertuur en het emissiemaximum in om de theoretische PSF-
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor multi-kleur lokalisatie van enkele membraaneiwitten in levende celorganellen met behulp van zelf-labeling eiwitten. De techniek maakt nauwkeurige lokalisatie van eiwitten binnen verschillende membraancompartimenten mogelijk, met een resolutie van ongeveer 18 nm.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvorming van levende cellen
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitdynamica is cruciaal voor het ophelderen van regulerende processen.
- Deze methode geeft inzicht in de ruimtelijk-tijdelijke organisatie van membraaneiwitten.
- Oorspronkelijk ontwikkeld voor mitochondriale eiwitten, is het toepasbaar op verschillende organellen.
- Uitgevoerd in levende cellen, onthult het enkel-molecuul eiwitdynamica.
Doel van de studie
- Om een protocol te demonstreren voor het lokaliseren van membraaneiwitten in levende cellen.
- Om de rol van eiwitorganisatie in cellulaire functies te onderzoeken.
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor onderzoekers in het veld.
Gebruikte methoden
- Transfectie en voorbereiding van celmonsters voor beeldvorming.
- Gebruik van fluorescente kralen voor monstermontage.
- Gebruik van een microscoop met noodzakelijke hardware en software.
- Gebruik van zelf-labeling eiwitten voor fluorofoorbevestiging.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle lokalisatie van eiwitten binnen organellen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de techniek op verschillende membraaneiwitten.
- Inzichten in eiwitdynamica en organisatie in levende cellen.
- Precisielokalisatie bereikt met ~18 nm resolutie.
Conclusies
- Dit protocol verbetert het begrip van eiwitgedrag in levende cellen.
- Het opent wegen voor verder onderzoek naar membraaneiwitdynamica.
- De techniek kan worden aangepast voor verschillende organellen buiten mitochondria.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Multi-color localization microscopy enables precise mapping of single membrane proteins in live mammalian cells, providing critical insights into protein dynamics and organelle-specific organization. This capability supports target validation by revealing subcellular trafficking patterns and functional micro-compartmentalization, which are essential for de-risking mechanistic hypotheses in early discovery. The technique’s applicability to live cells and multiple organelles enhances translational relevance for assessing protein behavior under physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein localization dynamics to clarify functional roles in disease-relevant pathways.
- Operational Value: Provides quantitative spatial data to support target de-risking and hypothesis validation.
- Translational Value: Links protein behavior to organelle-specific function, improving predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-precision localization and tracking maps for membrane proteins in live cells.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible single-molecule signal detection.
- Translational Value: Enables multi-color profiling to compare protein behavior across conditions or genetic variants.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks protein processing and compartmentalization, such as PINK1 mitochondrial import, under normal and stress conditions.
- Operational Value: Allows longitudinal imaging to assess protein trafficking in response to metabolic or pharmacological perturbations.
- Translational Value: Connects subcellular localization to functional outcomes, supporting biomarker-aligned target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing subcellular resolution data that informs target validation and lead identification decisions, particularly for membrane-associated targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving protein distribution in organelles like mitochondria, ER, or plasma membrane.
- Screening: Enables quantitative, reproducible readouts for assessing compound effects on protein localization.
- Analytics: Delivers nanometer-scale localization precision and co-tracking capabilities to quantify protein dynamics.
- Translational Research: Connects discovery-phase localization data to preclinical models via conserved organelle targeting mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a adaptable platform for multi-organelle, multi-color single-molecule imaging across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving protein behavior in native membrane environments.
- Operational Value: Enables standardization across labs via calibrated imaging and analysis pipelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target engagement and subcellular specificity early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets with confirmed organelle-specific action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, TIRF/HILO microscopy, and single-molecule analysis software.
- Depends on access to super-resolution microscopy systems with dual-color calibration and drift correction.
- Necessitates standardization of self-labeling tags, substrate concentrations, and imaging protocols across teams.
- Adaptation to different organelles may require optimization of labeling efficiency and illumination conditions.
- Limited utility for highly soluble proteins due to low signal density from sub-stoichiometric labeling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Physical Alignment of Image Splitter Generated Images
2:25
Alignment of Spectrally Separated Channels by Software Performing Spatial Transformation
4:34
Single Molecule Imaging of Mitochondrial Membrane Proteins
8:32
Results: Multi-color Localization of Mammalian Mitochondrial PINK1
10:15
Conclusion
