Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren
30 juni 2018
Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.
Deze techniek kan cruciale vragen beantwoorden in regulerende processen, zoals welke rol eiwitdynamiek en organisatie spelen in functionele aanpassing. Het grote voordeel van deze techniek is dat het in levende cellen kan worden uitgevoerd, waardoor eiwitdynamiek op het niveau van enkele moleculen kan worden onthuld. Hoewel deze methode oorspronkelijk werd geïmplementeerd om inzicht te geven in de ruimte-tijdelijke organisatie van mitochondriale membraaneiwitten, kan het ook worden toegepast op andere organellen en andere membraaneiwitten.
De techniek wordt gedemonstreerd door Timo Appelhans, een afstudeerstudent uit mijn lab. Na het transfecteren en voorbereiden van celmonsters en de microscoop volgens het tekstprotocol, monteer het voorbereide monster met fluorescerende kralen in de monsterhouder tussen de PTFE-ring en de rode rubberen ring. Start de microscoop, alle hardwarecomponenten en alle software die nodig is voor microscopie.
Gebruik een vers, pluisvrij tissue gespoten met isopropanol om de objectieflens en de onderkant van het dekglas schoon te maken. Plaats vervolgens een druppel immersieolie op de pupil van de objectieflens. Plaats vervolgens de monsterhouder met het kralenmonster op het microscoopplatform zodat de onderkant van het dekglas contact maakt met de olie.
Focus vervolgens op de kralen door transmissielicht of een laserlijn te gebruiken. Pas de kracht van de twee excitatielasers aan om een vergelijkbare signaaldichtheid in de twee fluorescentiekanalen te bereiken. Zoek vervolgens naar een gebied met veel verschillende fluorescente signalen.
Genereer een samengevoegd beeld van de fluorescente kanalen door gebruik te maken van de camerabesturingssoftware. Gebruik vervolgens de schroeven bij de beeldsplitter om de interne optische beeldsplitter handmatig te kantelen om de beste overlap van de signalen uit de twee fluorescentiekanalen te bereiken. Start de TIRF-microscoopbesturingssoftware en kies om individuele kanalen weer te geven in de live-streammodus.
Maak een momentopname van alle kanalen waarin fluorescentie wordt opgewekt. Gebruik vervolgens deze afbeelding om de transformatiematrix te produceren. Start de softwareanalyse-plugin en laad de eerder opgenomen dual-color afbeeldingen van fluorescente kralen in de software.
Kies de gebruikte oriëntatie van de fluorescente kanalen. Klik op Ja wanneer u wordt gevraagd om afbeeldingen te kalibreren en selecteer de eerder genomen momentopname. Open de eenheidsbeheerder om eenheidconversiefactoren te definiëren en open vervolgens de lokalisatiebeheerder.
Om de puntspreidingsfunctie, of PSF, te bepalen, drukt u op de knop PSF-radius. Definieer in het geopende PSF-venster van de numerieke apertuur en de emissiemaximum. Klik vervolgens op PSF-radius schatten.
Accepteer vervolgens de verkregen experimentele PSF. Definieer de evaluatiebox, het aantal deflatielussen en hoeveel kernen van de computer worden gebruikt voor berekening. Druk vervolgens op Lokaliseren om de intensiteitsverdeling van enkele deeltjes te passen, met behulp van een 2D symmetrische Gaussische functie.
Open de kalibratiemanager. In de gerenderde, samengevoegde afbeelding van de twee kanalen, worden het oorspronkelijke signaal en de gelokaliseerde centra getoond. Kies de affine modus.
Verbind vervolgens handmatig de overeenkomstige paren van gelokaliseerde centra in de twee kanalen, die afkomstig zijn van dezelfde fluorescente kraal, door een verbindingslijn te tekenen. Verbind de overeenkomstige signalen verdeeld over het gezichtsveld. Druk vervolgens op Accepteren en sla de transformatiematrix op.
Om enkelvoudige moleculaire beeldvorming van mitochondriale membraaneiwitten uit te voeren, monteer de specimendekslip tussen de rubberen en PTFE-ringen. Vul vervolgens de kamer met 0,5 tot 0,8 milliliter beeldvormingsmedium. Reinig de objectieflens en de onderkant van het dekglas.
Gebruik vervolgens transmissielicht of een laserlijn om op de cellen te focussen, nadat er een druppel olie op de lens is toegevoegd. Pas vervolgens de kracht van de twee excitatielasers aan om een vergelijkbare intensiteit te bereiken en zoek naar een gebied met veel fluorescente signalen. Pas de verlichtingshoek in de TIRF-microscoopbesturingssoftware aan om een invalshoek te creëren die kleiner is dan de kritische hoek, of de TIR-modus, om het specifieke gebied van belang via een HILO-blad te exciteren.
Het aanpassen van de verlichting van de TIRF-microscoop om celorganellen te exciteren met behulp van de HILO-verlichting vereist een snelle beoordeling van de signaal-tot-achtergrondverhouding en ervaring in TIRF-microscopie, evenals kennis van celmorfologie. Stel de EM-versterking in en kies een belichtingstijd die geschikt is voor het experiment dat voldoende fotonen per frame verzamelt. Pas vervolgens de laserkracht aan om een hoge signaal-ruisverhouding te bereiken, aangezien deze verhouding direct correspondeert met de lokalisatieprecisie.
Zoek een gebied in de celperiferie met niet-overlappende, langwerpige mitochondriën en enkele molecuulsignalen. Als er geen enkele signalen zichtbaar zijn in een of beide kanalen, wacht tot bleken resulteert in het verschijnen van enkele molecuulsignalen. In het geval dat slechts één kanaal moet worden gebleekt, zet de laser van het andere kanaal uit om bleken te voorkomen, voordat dit kanaal wordt opgenomen.
Neem op totdat het aantal signalen te laag is voor redelijk vervolg. Start de beeldverwerkingssoftware en controleer mitochondriale structuren door een cumulatieve rendered-sum afbeelding van minimaal 1.000 opgenomen frames te genereren. Start de softwareanalyse-plugin.
Om gegevensverwerking voor lokalisatie en tracking uit te voeren, laadt u de ruwe gegevens. Controleer meerkleurig. Kies de juiste oriëntatie van beide kanalen.
Wanneer u wordt gevraagd om afbeeldingen te kalibreren, laadt u de transformatiematrix. De kanalen worden afzonderlijk weergegeven. Open de ruwe gegevens van de beeldcontainer door op Tonen te klikken.
Open vervolgens de eenheidsbeheerder in het bovenste tabblad en definieer de eenheidconversiefactoren in elk kanaal. Open de lokalisatiebeheerder in het bovenste tabblad en definieer de evaluatiebox en het aantal deflatielussen. Klik op PSF-radius om de PSF-schatting te openen.
Stel de numerieke apertuur en het emissiemaximum in om de theoretische PSF-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor multi-kleurenlokalisatie van enkelvoudige membraanproteïnen in organellen van levende cellen met behulp van zelf-labelende proteïnen. De techniek maakt een nauwkeurige lokalisatie van proteïnen binnen verschillende membraancompartimenten mogelijk, waarbij een resolutie van ongeveer 18 nm wordt bereikt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Live cell imaging
Achtergrond
- Het begrijpen van proteïnedynamiek is essentieel voor het ontrafelen van regulerende processen.
- Deze methode biedt inzicht in de spatiotemporele organisatie van membraanproteïnen.
- Oorspronkelijk ontwikkeld voor mitochondriale proteïnen, is deze methode toepasbaar op diverse organellen.
- Uitgevoerd in levende cellen, onthult deze methode de dynamiek van individuele proteïnemoleculen.
Doel van de studie
- Om een protocol te demonstreren voor het lokaliseren van membraaneiwitten in levende cellen.
- Om de rol van eiwitorganisatie in cellulaire functies te onderzoeken.
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Transfecteren en voorbereiden van celmonsters voor beeldvorming.
- Gebruikmaken van fluorescerende beads voor het monteren van monsters.
- Bedienen van een microscoop met de benodigde hardware en software.
- Gebruikmaken van zelflabelende eiwitten voor de binding van fluoroforen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle lokalisatie van eiwitten binnen organellen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de techniek op diverse membraaneiwitten.
- Inzichten in eiwitdynamiek en -organisatie in levende cellen.
- Precieze lokalisatie bereikt met een resolutie van ~18 nm.
Conclusies
- Dit protocol vergroot het inzicht in het gedrag van eiwitten in levende cellen.
- Het opent mogelijkheden voor verder onderzoek naar de dynamiek van membraaneiwitten.
- De techniek kan worden aangepast voor diverse organellen naast mitochondriën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Meerkleurige lokalisatiemicroscopie maakt een nauwkeurige mapping van individuele membraaneiwitten in levende zoogdiercellen mogelijk, wat cruciale inzichten verschaft in proteïnedynamiek en organelspecifieke organisatie. Deze mogelijkheid ondersteunt de validatie van targets door subcellulaire transportpatronen en functionele microcompartimentalisatie bloot te leggen, wat essentieel is voor het verminderen van risico's bij mechanistische hypothesen in de vroege ontdekkingsfase. De toepasbaarheid van deze techniek op levende cellen en meerdere organellen vergroot de translationele relevantie voor het beoordelen van eiwitgedrag onder fysiologische omstandigheden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de dynamiek van eiwitlokalisatie te onderzoeken om functionele rollen in ziekte-relevante pathways te verduidelijken.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve ruimtelijke gegevens ter ondersteuning van target de-risking en hypothesevalidatie.
- Translationele waarde: Koppelt eiwitgedrag aan organel-specifieke functies, waardoor het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets wordt verbeterd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert lokalisatie- en trackingkaarten met hoge precisie voor membraaneiwitten in levende cellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt standaardisatie van assays door middel van reproduceerbare detectie van signalen op enkelmolecuulniveau.
- Translationele waarde: Maakt meerkleurenprofilering mogelijk om eiwitgedrag te vergelijken tussen verschillende condities of genetische varianten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Volgt eiwitverwerking en compartimentalisatie, zoals de mitochondriale import van PINK1, onder normale omstandigheden en stresscondities.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale beeldvorming mogelijk om eiwittransport te beoordelen als reactie op metabole of farmacologische perturbaties.
- Translationele waarde: Verbindt subcellulaire lokalisatie met functionele uitkomsten, wat bijdraagt aan targetvalidatie op basis van biomarkers.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door subcellulaire resolutiegegevens te leveren die beslissingen over target-validatie en lead-identificatie ondersteunen, met name voor membraangeassocieerde targets.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door de eiwitdistributie in organellen zoals mitochondriën, het ER of het plasmamembraan in kaart te brengen.
- Screening: Maakt kwantitatieve, reproduceerbare read-outs mogelijk voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de eiwitlokalisatie.
- Analytiek: Biedt lokalisatieprecisie op nanometerschaal en co-trackingmogelijkheden om eiwitdynamiek te kwantificeren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt lokalisatiegegevens uit de ontdekkingsfase met preklinische modellen via geconserveerde organel-targetingmechanismen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Creëert een aanpasbaar platform voor multi-organel, multi-kleur single-molecule imaging over verschillende projecten heen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door het eiwitgedrag in natuurlijke membraanomgevingen te ontrafelen.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie tussen laboratoria mogelijk via gekalibreerde imaging- en analyse-pipelines.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door target-engagement en subcellulaire specificiteit in een vroeg stadium te valideren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets met bevestigde organelspecifieke werking.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging, TIRF/HILO-microscopie en software voor single-molecule analyse.
- Afhankelijk van toegang tot superresolutie-microscopiesystemen met tweekleurige kalibratie en driftcorrectie.
- Vereist standaardisatie van zelflabelende tags, substraatconcentraties en imaging-protocollen tussen teams.
- Aanpassing aan verschillende organellen kan optimalisatie van de labeling-efficiëntie en de verlichtingscondities vereisen.
- Beperkt nut voor zeer oplosbare eiwitten vanwege de lage signaaldichtheid bij sub-stoichiometrische labeling.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Physical Alignment of Image Splitter Generated Images
2:25
Alignment of Spectrally Separated Channels by Software Performing Spatial Transformation
4:34
Single Molecule Imaging of Mitochondrial Membrane Proteins
8:32
Results: Multi-color Localization of Mammalian Mitochondrial PINK1
10:15
Conclusion
