Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd
8 augustus 2018
Hier beschrijven we een procedure om te testen de cel migratie in vitro met een geautomatiseerde optische camera Microscoop. De kras assay is wijd verbeid gebruikt wanneer de sluiting van de kras gedurende een ingestelde periode wordt gevolgd. De optische Microscoop kunt betrouwbare en goedkope detectie van cel migratie.
Het grootste voordeel van deze techniek is dat je de cellen in realtime kunt bekijken in de automatische optische microscoop. De implicaties van deze behandeling strekken zich uit tot een therapie voor chronische wonden of kanker waarbij migratie een cruciale rol speelt bij deze ziekten. Begin met het wassen van een confluente cultuur van HaCaT-cellen twee keer met vijf milliliter steriele magnesium- en calciumvrije PBS per wasbeurt.
Vervolgens incubeer de cellen met één milliliter trypsine in een incubator van 37 graden Celsius gedurende vijf tot acht minuten. Na het bevestigen van de loslating onder een lichtmicroscoop, stopt u de enzymatische reactie met negen milliliter kweekmedium aangevuld met FBS. En verdun de cellen tot een concentratie van 7,5 keer 10 tot de vierde cellen per 250 microliter medium plus FBS.
Vervolgens zaai je 250 microliter cellen in elk putje van een ronde bodem 48-well weefselkweekplaat en schuif de plaat voorzichtig van links naar rechts om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig over de bodem van de putjes zijn verdeeld. Breng vervolgens de plaat over naar een celkweekincubator. Wanneer de culturen een confluency van 90 tot 95% hebben bereikt, vervang je het supernatant in elk putje met 250 microliter vers bereid medium aangevuld met 10 microgram per milliliter mitomycine C, en breng de plaat terug in de incubator voor nog eens twee uur.
Aan het einde van de incubatie wast u de cellen met 250 microliter PBS en voegt u 250 microliter verse PBS toe aan elk putje. Gebruik vervolgens een 200 microliter micropipettip om een verticale snede te maken in elk cellagen. Wanneer alle cellagen zijn gekrast, vervangt u het PBS in elk putje met 250 microliter van het peptidestimulus van belang en plaatst u de plaat in een optisch camerasysteem met het deksel intact.
Om de optische camera in te stellen, opent u het verwervingsvenster en selecteert u wondgenezing. Selecteer het plaattype en deselecteer de putjes die niet worden gebruikt. Klik vervolgens op inschakelen en klik met de rechtermuisknop op een van de putjes om de focus aan te passen aan de positie van de cellen.
Stel de tijdsperiode voor de beelden in onder beeldinterval en stel het aantal herhalingen in om de gewenste periode te passen. Selecteer vervolgens het juiste analysetype. Klik vervolgens op starten om te beginnen met het in beeld brengen van de cellen.
Wanneer er een wond optreedt, beginnen de huidcellen te prolifereren en te migreren over het wondbed om de wond te sluiten, een proces dat kan worden waargenomen door de optische camera. Na een incubatie van 48 uur induceert behandeling met endotheelgroeifactor een bijna 95% sluiting van de wond, vergeleken met een sluiting van 38% in de onbehandelde controleputjes, en 33 en 62% sluitingen in de lactoferrine en lactoferricine culturen respectievelijk. Het percentage wondsluitaandeel bepaald uit veranderingen in de kloofbreedte vanaf de initiële snede kan ook worden uitgezet voor elke groeistimuli.
Deze video beschrijft een eenvoudig en efficiënt protocol voor het bestuderen van migratie van keratinocyten over een snede gemaakt in een monolaag van gezonde cellen. Hoewel de cellen die in deze test worden gebruikt HaCaT-cellen zijn, kan de methode ook worden toegepast op andere cellijnen, schimmels of zelfs bacteriën, zolang ze hechten aan de bodem van de microtiterplaat.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het testen van celmigratie in vitro met behulp van een geautomatiseerde optische cameramicroscoop. De scratch-assay wordt uitgelicht als een betrouwbare methode om celmigratie in de loop van de tijd te observeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Microscopie
- In vitro technieken
Achtergrond
- De scratch-assay is een veelgebruikte techniek voor het bestuderen van celmigratie.
- Geautomatiseerde optische microscopen maken real-time observatie van cellen mogelijk.
- Inzicht in celmigratie is cruciaal voor therapieën bij chronische wonden en kanker.
- Deze methode is kosteneffectief en betrouwbaar voor het detecteren van celbeweging.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode aan te tonen voor het beoordelen van celmigratie.
- Om de implicaties van celmigratie bij de behandeling van chronische wonden en kankertherapie te onderzoeken.
- Om geautomatiseerde optische microscopie te gebruiken voor real-time analyse.
Gebruikte methoden
- Wassen van confluente culturen van HaCaT-cellen met PBS.
- Incuberen van cellen met trypsine voor loskoppeling.
- Stoppen van de enzymatische reactie met kweekmedium.
- Verdunnen van cellen tot een specifieke concentratie voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Realtime observatie van celmigratie is gerealiseerd.
- De methode bleek effectief voor het monitoren van de sluiting van de kras.
- De resultaten kunnen bijdragen aan therapeutische strategieën voor chronische wonden en kanker.
- Geautomatiseerde microscopie verbetert de betrouwbaarheid van migratiebeoordelingen.
Conclusies
- De geautomatiseerde optische microscoop is een waardevol instrument voor het bestuderen van celmigratie.
- Deze techniek kan het onderzoek naar chronische wondgenezing en kankertherapieën bevorderen.
- Verdere studies kunnen de toepassingen ervan uitbreiden naar diverse biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Celmigratie-assays zijn essentieel voor het evalueren van therapeutische kandidaten bij wondgenezing en oncologie, maar traditionele scratch-assays hebben last van randartefacten en knelpunten bij de handmatige analyse. Dit geoptimaliseerde protocol pakt reproduceerbaarheidsproblemen aan door kation-gemedieerde celaccumulatie te elimineren en geautomatiseerde imaging te integreren, wat consistente, kwantitatieve migratie-uitlezingen mogelijk maakt. De aanpak ondersteunt vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie door betrouwbare real-time gegevens te leveren over pro- en anti-migratorische verbindingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door migratieveranderingen te kwantificeren als reactie op stimuli zoals lactoferrine of groeifactoren.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit door handmatige scratch-analyse en temperatuurschommelingen middels geautomatiseerde optische beeldvorming.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve metrics voor wondsluiting op vanuit identieke scratch-secties gedurende een bepaalde tijd.
- Operationele waarde: Elimineert arbeidsintensieve image-cycling en analyse, waardoor de doorvoersnelheid voor compound-screening wordt verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van ziekterelevante HaCaT-keratinocyten om epitheliale migratie te modelleren, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Operationele waarde: Garandeert de continuïteit van de assay van ontdekking tot preklinische evaluatie via reproduceerbare, geautomatiseerde workflows.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, waarbij zij hypothesetests in de vroege fase van ontdekking ondersteunt en kwantitatieve identificatie van leadverbindingen mogelijk maakt via meetbare inhibitie of stimulatie van migratie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door migratie te isoleren als afhankelijke variabele in reactie op behandelingen met peptiden of cytokinen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten (bijv. % wondsluiting) die vergelijking tussen compound-bibliotheken of eiwitvarianten mogelijk maken.
- Analytics: Genereert tijdreeksgegevens van migratie die geschikt zijn voor statistische vergelijking en dosis-responsmodellering.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verband met preklinische relevantie door het gebruik van menselijke keratinocyten en een context van wondgenezing.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar, geautomatiseerd platform voor migratie-assays over meerdere projecten en celtypen heen.
Operationele & Ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in migratie-assays te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door geautomatiseerde beeldvorming en consistente scratch-preparatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroeg in de pipeline betrouwbare, kwantitatieve migratiegegevens te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van gevalideerde migratie-effecten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek en steriele technieken voor de bereiding van monolagen.
- Afhankelijk van geautomatiseerde optische camerasystemen met time-lapse en analysemogelijkheden.
- Vereist standaardisatie van de krasbreedte en timing tussen de wells voor vergelijkbare gegevens.
- Omvat optimalisatie van PBS-wasstappen om randartefacten in verschillende cellijnen te voorkomen.
- Beperkt tot adherente cellen die compatibel zijn met hechting aan de bodem van microtiterplaten.
