Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd

Het grootste voordeel van deze techniek is dat je de cellen in realtime kunt bekijken in de automatische optische microscoop. De implicaties van deze behandeling strekken zich uit tot een therapie voor chronische wonden of kanker waarbij migratie een cruciale rol speelt bij deze ziekten. Begin met het wassen van een confluente cultuur van HaCaT-cellen twee keer met vijf milliliter steriele magnesium- en calciumvrije PBS per wasbeurt.

Vervolgens incubeer de cellen met één milliliter trypsine in een incubator van 37 graden Celsius gedurende vijf tot acht minuten. Na het bevestigen van de loslating onder een lichtmicroscoop, stopt u de enzymatische reactie met negen milliliter kweekmedium aangevuld met FBS. En verdun de cellen tot een concentratie van 7,5 keer 10 tot de vierde cellen per 250 microliter medium plus FBS.

Vervolgens zaai je 250 microliter cellen in elk putje van een ronde bodem 48-well weefselkweekplaat en schuif de plaat voorzichtig van links naar rechts om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig over de bodem van de putjes zijn verdeeld. Breng vervolgens de plaat over naar een celkweekincubator. Wanneer de culturen een confluency van 90 tot 95% hebben bereikt, vervang je het supernatant in elk putje met 250 microliter vers bereid medium aangevuld met 10 microgram per milliliter mitomycine C, en breng de plaat terug in de incubator voor nog eens twee uur.

Aan het einde van de incubatie wast u de cellen met 250 microliter PBS en voegt u 250 microliter verse PBS toe aan elk putje. Gebruik vervolgens een 200 microliter micropipettip om een verticale snede te maken in elk cellagen. Wanneer alle cellagen zijn gekrast, vervangt u het PBS in elk putje met 250 microliter van het peptidestimulus van belang en plaatst u de plaat in een optisch camerasysteem met het deksel intact.

Om de optische camera in te stellen, opent u het verwervingsvenster en selecteert u wondgenezing. Selecteer het plaattype en deselecteer de putjes die niet worden gebruikt. Klik vervolgens op inschakelen en klik met de rechtermuisknop op een van de putjes om de focus aan te passen aan de positie van de cellen.

Stel de tijdsperiode voor de beelden in onder beeldinterval en stel het aantal herhalingen in om de gewenste periode te passen. Selecteer vervolgens het juiste analysetype. Klik vervolgens op starten om te beginnen met het in beeld brengen van de cellen.

Wanneer er een wond optreedt, beginnen de huidcellen te prolifereren en te migreren over het wondbed om de wond te sluiten, een proces dat kan worden waargenomen door de optische camera. Na een incubatie van 48 uur induceert behandeling met endotheelgroeifactor een bijna 95% sluiting van de wond, vergeleken met een sluiting van 38% in de onbehandelde controleputjes, en 33 en 62% sluitingen in de lactoferrine en lactoferricine culturen respectievelijk. Het percentage wondsluitaandeel bepaald uit veranderingen in de kloofbreedte vanaf de initiële snede kan ook worden uitgezet voor elke groeistimuli.

Deze video beschrijft een eenvoudig en efficiënt protocol voor het bestuderen van migratie van keratinocyten over een snede gemaakt in een monolaag van gezonde cellen. Hoewel de cellen die in deze test worden gebruikt HaCaT-cellen zijn, kan de methode ook worden toegepast op andere cellijnen, schimmels of zelfs bacteriën, zolang ze hechten aan de bodem van de microtiterplaat.