Name: Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Leer de Kras-assay voor in vitro celmigratie met een geautomatiseerde optische camera. Deze methode maakt real-time observatie van HaCaT-cellen mogelijk voor onderzoek naar chronische wonden en kankertherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek, technologie en productie, verlenen #4005-00029

De experimentele opzet geen ethische en juridische beperking en werd uitgevoerd in overleg met de Universiteit van Roskilde. Een overzicht van de experimentele opstelling kan worden gezien in Figuur 1 en de mechanismen van de optische camera in Figuur 2.
1. voorbereiding
<ol><li>Voer alle stappen in een steriele laminaire flow-bench door het reinigen van de Bank en alle apparatuur met 70% ethanol vóór de aanvang van het experiment.</li>
	<li>Plaats de optische camera in een conventionele incubator bij 37 ° C met 5% CO2 om optimale omstandigheden voor de cellen.</li>
	<li>HaCaT cellen in DMEM media met 10% FBS en 1 x antibiotica (penicilline en streptomycine) in een maatkolf van T75 groeien.</li>
	<li>Met 1 mL 1 x trypsine kunt loskoppelen van de cellen en sub kweken elke 3-4 dagen, door het te verspreiden over de cellulaire laag. Verwarm tot kamertemperatuur vóór gebruik.</li>
</ol>2. het genereren van een Monolayer van HaCaT cellen in een 48-wells microtiterplaat plaat
<ol><li>Verwijder het medium van de T75 kolf met een pipet van Pasteur.</li>
	<li>Wassen de Adherente cellen in de kolf door toevoeging van 5 mL 1 x steriel PBS aan op de maatkolf T75. Opmerking: Zorg ervoor dat de PBS vrij van calcium en magnesium.</li>
	<li>De PBS circuleren en verwijderen met een pipet van Pasteur.</li>
	<li>Herhaal stap 2.2-2.3.</li>
	<li>1 mL 1 x trypsine Voeg aan de maatkolf en het verspreiden over de cellaag.</li>
	<li>Incubeer de kolf bij 37 ° C in een conventionele incubator totdat de cellen zijn vrijstaand (5-8 min is voldoende voor de meeste cellijnen).</li>
	<li>Bekijken onder de Microscoop als de cellen worden losgemaakt. Zodra de cellen worden losgemaakt, voeg 9 mL van de reguliere media cultuur met 10% FBS voor inactivering van de trypsine 1 x.</li>
	<li>Tellen van de cel met ofwel een hemocytometer, een coulter-teller of soortgelijk. Opmerking: Trypan blauw kan worden gebruikt om dode cellen weer te geven. Echter, in 1 x trypsine HaCaT cellen zijn perfect ronde als levend.</li>
	<li>7.5 x 104 cellen per putje in 250 µL 10% FBS media overbrengen in een rondbodemkolf van 48-well weefselkweek plaat (standaard plaat). Opmerking: Assay kan ook worden ingesteld in 6-, 12-, 24- of 96-wells-platen, die alle onder de optische Microscoop kunnen worden bepaald.</li>
	<li>Ga voorzichtig de plaat van kant naar kant om ervoor te zorgen dat de cellen zijn even verspreid in de putjes of de cellen zal verzamelen in het midden van de putten. Inspecteer onder een lichte Microscoop om ervoor te zorgen dat de cel is gelijkmatig verdeeld in de media</li>
	<li>Zet de plaat in een conventionele CO2 incubator bij 37 ° C's nachts of totdat de cellen aan de onderkant van de putten hebben gehouden.</li>
</ol>3. de toevoeging van Stimuli voor migratie effecten
<ol><li>Controleren of de putten 90-95% heuvels onder een lichte Microscoop zijn.</li>
	<li>Bereiden van 10 µg/mL mitomycine C in een passend bedrag van het medium. Opmerking: In deze studie, wordt mitomycine C bewaard bij 4 ° C in een stamoplossing bij 1 mg/mL. Mitomycine C in oplossing kan worden opgeslagen op één week in het donker bij 2-8 ° C.</li>
	<li>Verwijder het verbruikte medium met een pipet van Pasteur van elk putje.</li>
	<li>Voeg 250 µL van 5 µg/mL mitomycine C toe aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Stimuli van peptiden bereid door verdunning van hen in een passend bedrag van het medium. Opmerking: In deze studie, werden zowel de menselijke als boviene lactoferrine en Lactoferricin getest op 25 µg Mo/mL in een volume van 250 µL</li>
	<li>Verwijder het medium met mitomycine C met een pipet van Pasteur.</li>
	<li>Was de putjes 1 x met 250 µL 1 x PBS (kamertemperatuur) en verwijder het wassen met een Pasteur Pipetteer.</li>
	<li>Voeg 250 µL van 1 x PBS en handmatig kras de putjes verticaal met een 200 µL pipette uiteinde. Gebruik een nieuwe Pipet tip voor elk putje.</li>
	<li>Verwijder van de PBS en voeg 250 µL peptide prikkels.</li>
	<li>Monteer de plaat in optische camerasysteem door de schroeven aan beide zijden van de plaat aan te passen. Laat het deksel op de plaat van de microtiterplaat. Opmerking: De camera kunt bedienen met het deksel open indien nodig.</li>
</ol>4. het programma instellen voor de optische Camera op de Computer
<ol><li>Klik op ophalen in de taakbalk aan de linkerkant.</li>
	<li>Kies de functie wondgenezing in de taakbalk aan de linkerkant.</li>
	<li>Kies de plaat type door hieronder de plaat illustratiete klikken.</li>
	<li>Unselect wells, niet in gebruik, door deze te markeren en klikt u op inschakelen op de bovenste links op het scherm. Opmerking: Alle putjes zijn standaard geselecteerd.</li>
	<li>Pas de focus van de lens op de putten aan de positie van de cellen door met de rechtermuisknop op een van de putten. Opmerking: Autofocus kan ook handmatig worden aangepast door de balk te verplaatsen naar de rechterzijde van de illustratie van de plaat.</li>
	<li>De tijdsperiode voor afbeeldingen onder Afbeelding Interval instellen (bijvoorbeeld (00: 30:00)).</li>
	<li>Stel het aantal herhalingen te passen de gewenste periode (bijvoorbeeld 97 herhalingen).</li>
	<li>De run start door te klikken op de knop Start in de lagere juiste hoek.</li>
</ol>

<ol><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+wound+care%22%5BJournal%5D)">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li>
<li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+biological+therapy%22%5BJournal%5D)">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li>
<li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li>
<li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+motility%3A+lessons+from+migration+in+confined+spaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li>
<li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li>
<li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+journal+of+dermatology%22%5BJournal%5D)">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li>
<li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li>
<li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells%3A+toxicity%2C+wound+healing%2C+uptake+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li>
<li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li>
<li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput%2C+interactive+imaging%2C+bright-field+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li>
<li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Räsänen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives%2C+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign%2C+not+in+malignant+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li>
<li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li>
<li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C%3A+small%2C+fast+and+deadly+%28but+very+selective%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li>
<li>Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/biomat.2016.17.issue-1-2/bnm-2016-0002/bnm-2016-0002.xml">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li>
<li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li>
<li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin%2Flactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein%2Fpeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li>
<li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+properties+of+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li>
<li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+desmosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li>
<li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanali%2C+C+%22Whitepaper+a+Digital+Time-Lapse+Bright+Field+Technology+To+Drive+Faster%2C+Higher+Throughput+Bioanalysis%22">Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis</a>. , (2016).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
<li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het belang van de migratie in studies van de ontwikkeling, wondgenezing, immunologie en kanker heeft geleid tot verschillende methoden om te studeren van migratie. Migratie kan een expressie van de uitbreiding of de sluiting van de kloof door de cellen. Meestal de sluiting van de kras wordt getest, zoals het is makkelijker om te groeien van cellen in een enkelgelaagde en breng een kras dan groeit de cellen in een specifiek formulier8. Onze studie toont een geoptimaliseerde methode voor handmatige ...

Migratie is een belangrijk proces die invloeden van verschillende fysiologische aspecten. In de wondgenezing vergemakkelijkt de migratie opnieuw epithelization van de huid. In niet-genezende wonden, zoals chronische wonden, opportunistische bacteriën veroorzaken infectie van de wond en open wonden zijn ideaal voor bacteriën groei en vorming van biofilms1,2. Biofilm is een van de oorzaken van de ontwikkeling van resistente bacteriën, één van de grootste bedreigingen voor onze moderne samenleving-3. In de wondgenezing, kunnen niet de immuuncellen de biofilm doordringen. Bij kanker is migratie van de kankercellen een cruciale stap van metastase, die de belangrijkste doodsoorzaak voor patiënten met stevige tumors4,5. Het is daarom van cruciaal belang om de studie van de migratie te kunnen.
De kras bepaling wordt vaak gebruikt voor het testen van cel migratie, want het is goedkoop en gemakkelijk uit te voeren op aanhangend cellijnen, zoals fibroblast, endotheel, en6,7van de lijnen van de epitheliale cellen. Vandaag, er bestaan verschillende methoden voor het uitvoeren van krassen8, en verschillende materialen hebben gemeld moet worden gebruikt, met inbegrip van tandenstokers9, cel schrapers10, lasers11en12van de elektrische stromen. Alle methodes hebben verschillende voor- en nadelen, en de methode moet worden vastgesteld volgens de cel type, begroting en analyse tool. Als voorbeeld, als het gebruikte celtype vereist coating, manuele druk verwijdering, bijvoorbeeld met een tandenstoker of pipette uiteinde, invloed zal hebben op migratie binnen het gebied, een andere methode moet worden gebruikt. In deze studie zullen we ons richten op handmatige schrapen.
Een nadeel voor handmatige schrapen is de variatie van de grootte, vormen van de krassen en accumulatie van cel aan de randen van de kras. Er zijn veel protocollen, en een zeer geciteerde papier adviseert verhoogde snelheid en/of grondig wassen na het krassen van13. Bovendien hebben verschillende methoden zijn gebruikt om te minimaliseren van proliferatie, aangezien de proliferatie van de cellen kan niet onderscheiden van migratie worden en daarom vals-positieve resultaten van de migratie geven kan. Sommige meldden methoden zijn serum honger voorafgaand aan de kras14 en daalt de hoeveelheid serum15. Geen van deze methoden kan er echter voor zorgen dat er geen wildgroei is. Daarom, rapporteren we een voorbehandeling van de cellen met mitomycine C om echte resultaten van de migratie. Mitomycine C is een antibioticum dat remt de synthese van DNA door de vorming van een covalente binding met het DNA, die verhindert dat het DNA scheiden van16. Door vooraf te behandelen met mitomycine C en wassen met PBS voor krassen, toont de gedetecteerde sluiting van de kloof de echte migratie van de cellen (Figuur 1).
Een kenmerk van alle methoden is de noodzaak van een systeem voor het analyseren van het proces van migratie17. Een gemeenschappelijk en een goedkope methode voor het analyseren van de vooruitgang is het gebruik van een licht-veld microscoop om beelden te nemen van de kras op vooraf bepaalde tijdstippen, gevolgd door een analyse van de sluiting van de kloof in een afbeelding software18,19. Deze methode is tijdrovend, onbetrouwbaar met betrekking tot het nemen van foto's op de zelfde plek en de focus, en de beweging van incubator naar camera dwingt cycli van temperatuurveranderingen terwijl foto's zijn genomen. Andere methoden zijn ontwikkeld voor het detecteren van migratie door het meten van de stroom. De huidige veranderingen, cellen bestrijken meer ruimte op de plaat, die wordt gelezen als een verhoging van de impedantie-20. De omgeving van de cellen wordt niet beïnvloed door het meten van impedantie, en de methode wordt daarom beschouwd als niet-invasieve. Deze methode berust op gespecialiseerde platen met gouden elektroden, die duur zijn, maar ze inschakelen detectie van vele processen, zoals de naleving van de cellulaire, proliferatie, migratie en celdood. Een groot nadeel van deze methode is dat de impedantie-meting geeft niet direct aan migratie, aangezien factoren zoals temperatuur een grote impact op de impedantie hebben. Wijzigingen in de impedantie kunnen worden veroorzaakt door verschillende factoren die niet worden beoordeeld door de software, de analyse van de gegevens moeilijker te maken. Het ontbreken van visualisatie vereist daarom een conventionele lichte Microscoop om te controleren of de migratie.
Om te overwinnen veel van de nadelen van de beschikbare technieken, we gebruiken een real-time automatische optische camera. De optische camera is een detectiesysteem met een hoge gegevensdoorvoer Microscoop in een klein platform met een lens, verlichting unit en een digitale camera. Het heeft een ingebouwde software, die migratie en proliferatie o.a. kunt testen. U wilt opsporen migratie, worden twee algoritmen gebruikt om de groei en de kinetiek van de migratie van de cellen, die de verspreiding en de wond genezing analyse, respectievelijk heten te analyseren. De proliferatie analyse is gebaseerd op een in twee stappen afbeelding segmentatie algoritme dat textuur analyse om te detecteren het verschil tussen cel bedekte gebieden (getoond in het geel) van toepassing is en lege achtergrond gebieden door geavanceerde histogram analyse. De wond genezing analyse is gebaseerd op een drie-stappen-algoritme dat de cel enkelgelaagde detecteert, zoekt de kloof van de wond en bepaalt de breedte van de tussenruimte. Deze stappen zijn uitgevoerd op gebruiker-bepaald tijd-punten, en de gegevens worden gepresenteerd als overdekte ruimte, Breedte tussenruimte en gap omgeving. Een van de grote voordelen van deze machine is dat hierdoor beeldvorming van Adherente cellen door vloeistof vanwege de hoek van de camera-21. De camera lenstakes bewogen beelden die worden geprojecteerd naar een z-stack van een enkel z-vliegtuig genereren om ervoor te zorgen dat de foto's in-focus (Figuur 2 zijn). z-stacks worden gegenereerd door het samenvoegen van de reeks van foto's (bijvoorbeeld 40) genomen loodrecht naar de rand van de wond, en over de gehele wond. De z-stacks kunt vastleggen van de diepte van de cellaag evenals een vliegtuig in-focus over de wond. Bovendien kan de reeks beelden samen worden gebracht aan een video-collectie van de beelden, met de klik van een knoop.
We tonen een geoptimaliseerde protocol voor de detectie van de migratie in de Keratinocyt cellijn HaCaT. We testten lactoferrine en de N-terminale peptide, Lactoferricin, van mens en koeien, voor het analyseren van hun effect op de migratie, zoals deze moleculen hebben aangetoond dat tal van toepassingen als antimicrobiële en immune modulerende moleculen22 , 23. de vier stoffen werden vergeleken met onbehandelde HaCaT cellen en epidermale groeifactor (EGF) werd gebruikt als positieve controle.

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>Opticale camera</td></tr><tr><td>UniExplorer software&nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr><td>HaCaT cel</td><td></td><td></td><td>Gedoneerd door Bispebjerg Ziekenhuis</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>Medium voor HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Fétaal bovien serum</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Zonder Mg+ en Ca2+</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Trypsine (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Remt proliferatie</td></tr><tr><td>Microtiterplaat</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37&deg;C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Assistent</td><td></td><td>Türk (0.1 mm)</td></tr><tr><td>Pipet boy</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kras assay voor in vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische camera geoptimaliseerd

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cel migratie is een belangrijk proces invloed op vele aspecten van de gezondheid, zoals wondgenezing en kanker, en het is dus cruciaal voor de ontwikkeling van methoden om te bestuderen van de migratie. De kras assay is al lang de meest voorkomende in vitro methode voor het testen van verbindingen met de eigenschappen van de anti - en pro - migration vanwege zijn lage kosten en eenvoudige procedure. Een vaak gemeld probleem van de test is echter de accumulatie van cellen over de rand van de kras. Bovendien, om gegevens te verkrijgen van de bepaling, beelden van verschillende belichtingen moeten worden genomen over een periode van tijd op exact dezelfde plek om te vergelijken van de bewegingen van de migratie. Analyse van de verschillende programma's kunnen worden gebruikt voor het beschrijven van de kras sluiting, maar ze zijn arbeidsintensief, onjuist, en krachten cycli van temperatuurveranderingen. Wij tonen in deze studie, een geoptimaliseerde methode voor het testen van het migratie-effect, bijvoorbeeld met de natuurlijk voorkomende eiwitten mens - en runderen-lactoferrine en hun N-terminale peptide Lactoferricin op de epitheliale cellijn HaCaT. Een cruciale optimalisatie is te wassen en kras in PBS, die de bovengenoemde accumulatie van cellen langs de rand elimineert. Dit kan worden verklaard door de verwijdering van kationen, waarvan is gebleken dat een effect op Keratinocyt cel verbinding. Om te zorgen voor echte detectie van migratie, werd vooraf behandelen met mitomycine C, een DNA-synthese-inhibitor, toegevoegd aan het protocol. Tot slot tonen wij de geautomatiseerde optische camera, die elimineert buitensporige temperatuur cycli, handenarbeid met kras sluiting analyse, terwijl de verbetering op de reproduceerbaarheid en het waarborgen van de analyse van identieke secties van de kras na verloop van tijd.

HaCaT is een Keratinocyt cellijn, een van de meest voorkomende soorten van de cellen in de huid. Wanneer een wond optreedt, wordt de huidcellen beginnen te vermenigvuldigen en migreer over aan het bed van de wond te sluiten van de wond (Figuur 3). Beide processen zijn daarom van het grootste belang voor een goede genezing.
De optische camera kunt beide processen in real-time volgen. Voor migratie, h...

Hier beschrijven we een procedure om te testen de cel migratie in vitro met een geautomatiseerde optische camera Microscoop. De kras assay is wijd verbeid gebruikt wanneer de sluiting van de kras gedurende een ingestelde periode wordt gevolgd. De optische Microscoop kunt betrouwbare en goedkope detectie van cel migratie.

Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Het grootste voordeel van deze techniek is dat je de cellen in realtime kunt bekijken in de automatische optische microscoop. De implicaties van deze behandeling strekken zich uit tot een therapie voor chronische wonden of kanker waarbij migratie een cruciale rol speelt bij deze ziekten. Begin met het wassen van een confluente cultuur van HaCaT-cellen twee keer met vijf milliliter steriele magnesium- en calciumvrije PBS per wasbeurt.Vervolgens incubeer de cellen met één milliliter trypsine in een incubator van 37 graden Celsius gedurende vijf tot acht minuten. Na het bevestigen van de loslating onder een lichtmicroscoop, stopt u de enzymatische reactie met negen milliliter kweekmedium aangevuld met FBS. En verdun de cellen tot een concentratie van 7,5 keer 10 tot de vierde cellen per 250 microliter medium plus FBS.Vervolgens zaai je 250 microliter cellen in elk putje van een ronde bodem 48-well weefselkweekplaat en schuif de plaat voorzichtig van links naar rechts om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig over de bodem van de putjes zijn verdeeld. Breng vervolgens de plaat over naar een celkweekincubator. Wanneer de culturen een confluency van 90 tot 95% hebben bereikt, vervang

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Het vermogen om te migreren is een belangrijke functie van veel verschillende celtypen, inclusief mesenchymale stromale cellen (MSC's). Het kwantificeren van veranderingen in migratievermogen na schade is echter een uitdaging. Dit protocol beschrijft een eenvoudig aanpasbare migratietest die rigoureuze statistiek gebruikt om veranderingen in het migratievermogen van MSC's na schade te kwantificeren.

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Cel migratie is essentieel voor de ontwikkeling, weefsel onderhoud en reparatie en tumorvorming en wordt gereguleerd door groeifactoren, chemokines en cytokinen. Dit protocol beschrijft de stip assay, een twee-dimensionale, onbeperkte migratie test om te beoordelen van de trekkende fenotype van geschakelde, samenhangende cel bladen in reactie op microenvironmental signalen.

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Deze studie richt zich op een in vitro model voor wond genezing (kras assay) als een mechanisme om te bepalen hoe milieu aanwezige contaminanten zoals arsenicum invloed cellulaire migratie. De resultaten tonen aan dat deze in vitro -assay snelle en vroege aanwijzingen van wijzigingen in cellulaire migratie vóór in vivo experimenten biedt.

In Vitro Kras Assay om aan te tonen van de gevolgen van arsenicum huid cel migratie

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

We presenteren een kosteneffectieve methode om de scratch migratie test die een nieuwe aanpak voor het bepalen van celmigratie biedt zonder het gebruik van apparatuur-intensieve methoden. Terwijl fibroblasten werden gebruikt in dit protocol, kan het worden aangepast en gebruikt om extra celtypen en invloeden op celmigratie te bestuderen.

Een kosteneffectieve en aanpasbare scratchmigratietest

Dit protocol biedt een methode voor primaire muizen T-celisolatie en time-lapse-microscopie van T-celmigratie onder specifieke omgevingsomstandigheden met kwantitatieve analyse.

Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Leer de Kras-assay voor in vitro celmigratie met een geautomatiseerde optische camera. Deze methode maakt real-time observatie van HaCaT-cellen mogelijk voor onderzoek naar chronische wonden en kankertherapie.

Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd

Meer video's verkennen