Een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde Rat hersenen Microvessels
7 mei 2018
Hier wordt een methode voor het isoleren van de rat hersenen microvessels en voor de bereiding van de eindmonsters membraan beschreven. Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het produceren van verrijkte microvessel monsters met aanvaardbare eiwit van individuele dieren opbrengst. Steekproeven kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses van de robuuste proteïne in de hersenen microvasculaire endotheel.
Het algemene doel van deze procedure is om cerebrale microvaten te isoleren uit rattenhersenen voor biochemisch onderzoek gericht op het begrijpen van moleculaire kenmerken van de bloed-hersenbarrière van zoogdieren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de fysiologie en neurofarmacologie van de bloed-hersenbarrière, zoals regulatie, lokalisatie en expressie van tight junction-eiwitten en endogene transporters in gezondheid en ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een voldoende aantal hoogwaardige microvaten kunnen isoleren van een individueel dier, terwijl rekening wordt gehouden met de natuurlijke variabiliteit in eiwitexpressie tussen individuele dieren.
Bianca Reilly, een uitstekende bachelorstudent uit mijn laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Na het euthanaseren en onthoofden van een Sprague-Dawley-rat volgens het tekstprotocol, gebruik chirurgische schaar om de huid van de schedel van de rat te reseceren door een enkele transversale snede te maken. Gebruik ronguiers om voorzichtig de schedelplaat te verwijderen en breng de hersenen bloot.
Vervolgens, met een spatel, verwijder het orgaan. Los het cerebrum en plaats het geïsoleerde hersenweefsel in een 50-milliliter conische buis met vijf milliliter BMB en 5,0 microliter cocktail van proteaseremmers. Om het weefsel te verwerken, breng het over naar een schone petrischaal.
Gebruik vervolgens, met behulp van pincetten, voorzichtig de hersenen op een filterpapier met een diameter van 12,5 centimeter om de buitenste hersenvliezen te verwijderen, die losjes zijn gehecht aan de cerebrale cortex. Tijdens deze stap moet ervoor worden gezorgd dat al het meningeale weefsel van het hersenweefselspecimen is verwijderd. De hersenvliezen kunnen worden gevisualiseerd als een helder membraanachtig weefsel dat gemakkelijk van het hersenweefsel kan worden verwijderd.
Druk voorzichtig op het hersenweefsel tegen het filterpapier en rol het weefsel opnieuw, waarbij het filterpapier vaak wordt gedraaid tijdens deze stap. Gebruik vervolgens pincetten om de choroïdale plexus te scheiden van de hersenhelften. Flatten vervolgens het hersenweefsel opnieuw voorzichtig en gebruik pincetten om de reuklobben naast het witte hersenweefsel te verwijderen.
Plaats het corticale hersenweefsel in een gekoelde glazen vijzel. Voeg vervolgens vijf milliliter BMB toe met cocktail van proteaseremmers. Gebruik een overhead power homogenisator, steek een stamper in de vijzel en homogeniseer het hersenweefsel met 15 op en neer bewegingen bij 3.700 tpm.
Pour vervolgens het homogenaat in gelabelde centrifugeerbuisjes. Gebruik tussen de monsters 70% ethanol om de stamper schoon te maken. Om centrifugatie uit te voeren, voeg 8,0 milliliter 26% dextranoplossing toe aan elk gelabeld centrifugeerbuisje met hersenhomogenaat.
Keer de buis tweemaal om en vortex het monster vervolgens grondig. Voer het vortexen van elk monster uit met behulp van meerdere hoeken om een grondige menging van hersenhomogenaat oplossing met 26% dextran oplossing te garanderen. Centrifugeer de monsters bij 5.000 g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.
Aspireer de supernatant en resuspendeer het pellet in 5,0 milliliter BMB met cocktail van proteaseremmers. Vortex vervolgens het pellet om een grondige menging te garanderen. Voeg vervolgens 8,0 milliliter 26% dextran toe aan elk centrifugeerbuisje en vortex zoals zojuist is gedemonstreerd.
Centrifugeer vervolgens de monsters opnieuw. Gebruik een vacuümkolf en glazen pipettering om de supernatant te aspireren en zorg ervoor dat het pellet met de hersenmicrovat niet wordt verstoord. Resuspendeer het pellet in BMB met proteaseremmer en vervolgens 26% dextran nog twee keer.
Na de laatste centrifugatie, voeg 5,0 milliliter BMB toe aan elk pellet en vortex om het monster te resuspenderen. Met behulp van het protocol dat in deze video wordt gedemonstreerd, werd een succesvolle isolatie van intacte microvaten uit rattenhersenen uitgevoerd. In deze afbeelding is de microvat gekleurd met behulp van een antilichaam tegen Oatp1a4, een transporter die goed tot expressie komt in het plasmamembraan van hersengeweven endotheliale cellen.
Zoals aangetoond door western blot, waren membraanpreparaten van microvaten die werden geoogst uit vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten verrijkt in PECAM-1, ook bekend als CD31, een markereiwit voor hersenmicrovaten. Tijdens optimalisatie van dit protocol werd PECAM-verrijking waargenomen in membraanmonsters bereid met behulp van twee en vier dextran centrifugatie stappen. Zoals bepaald door de Bradford-eiwitassay en vermeld in deze tabel, geven membraanpreparaten doorgaans eiwitconcentraties op die variëren tussen 5,0 milligram per milliliter en 10,0 milligram per milliliter.
De eiwitwaarden werden bepaald op basis van een standaardcurve die werd gegenereerd met behulp van BSA als standaard. Hier is een western blot voor het BBB-transporteiwit Glut1. Heldere enkele banden op 54 kilodalton werden gedetecteerd voor dit sterk tot expressie komende BBB-eiwit in elk membraanmonster.
Deze grafiek illustreert een hogere expressie van Glut1 bij de BBB in mannelijke versus vrouwelijke ratten. Er werd geen verschil in expressie van natrium/kalium-ATPase waargenomen tussen mannelijke en vrouwelijke dieren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee tot 2 1/2 uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle monsters gedurende het hele protocol op ijs te houden en om voorzichtig te zijn bij het aspireren van de supernatant uit het microvatenpellet na de centrifugatie stappen. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals co-immunoprecipitatieanalyse, worden uitgevoerd op microvatenmonsters om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de associatie van verschillende eiwitten binnen hetzelfde eiwitcomplex bij de bloed-hersenbarrière. Na de ontwikkeling van deze techniek, heeft het de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van de fysiologie en neurofarmacologie van de bloed-hersenbarrière om moleculaire kenmerken van de bloed-hersenbarrière te onderzoeken in gezondheid en in knaagdiermodellen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het isoleren van microvaten uit rattenhersenen om de bloed-hersenbarrière (BBB) te onderzoeken. De methode maakt hoogwaardige eiwitanalyses van individuele dieren mogelijk, wat het onderzoek naar tight junction-eiwitten en transporteurs gerelateerd aan neurofarmacologie en fysiologie vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Proteïneanalyse
- Fysiologie van de bloed-hersenbarrière
Achtergrond
- De bloed-hersenbarrière speelt een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase van het centrale zenuwstelsel.
- Inzicht in de moleculaire kenmerken van de BBB kan bijdragen aan studies naar neurologische aandoeningen.
- Deze methode houdt rekening met de variabiliteit in eiwitexpressie tussen verschillende ratten.
- Verrijkte microvatmonsters zijn essentieel voor de vooruitgang van neurofarmacologisch onderzoek.
Doel van de studie
- Om cerebrale microvaten uit rattenhersenen te isoleren voor biochemische studies.
- Om moleculaire componenten geassocieerd met de BBB onder verschillende fysiologische omstandigheden te analyseren.
- Om de expressie en regulatie van specifieke eiwitten gerelateerd aan de BBB-functie te evalueren.
Gebruikte methoden
- Het hoofdplatform omvat chirurgische technieken gevolgd door homogenisatie en centrifugatie van hersenweefsel.
- Het biologische model bestaat uit Sprague-Dawley ratten, wat individuele analyse van de kenmerken van microvaten mogelijk maakt.
- Er werd geen multi-omics workflow vermeld.
- De belangrijkste stappen omvatten weefselresectie, homogenisatie en meerdere centrifugatiecycli om de microvaten te isoleren.
- De eiwitopbrengst en zuivering worden beoordeeld via Western blotting en Bradford-eiwitassays.
Belangrijkste Resultaten
- Intacte microvaten werden succesvol geïsoleerd en gekenmerkt op basis van proteïne-expressie.
- Verrijking van PECAM-1 (CD31) en Glut1 werd bevestigd in de microvatenpreparaten.
- Proteïneconcentraties varieerden na het protocol doorgaans van 5 tot 10 mg/mL.
- Er werd een opmerkelijk verschil in Glut1-expressie waargenomen tussen mannelijke en vrouwelijke ratten.
Conclusies
- Deze studie biedt een betrouwbare methode voor het isoleren van hersenmicrovaten, wat de weg vrijmaakt voor toekomstig onderzoek naar de bloed-hersenbarrière.
- Het protocol verdiept het begrip van neurofarmacologische dynamiek en de fysiologie van de BBB.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan betere therapeutische benaderingen voor neurologische aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het isoleren van cerebrale microvaten maakt mechanistische risicoreductie van drugtargets in het centraal zenuwstelsel mogelijk door endotheelverrijkte monsters te leveren die fysiologische variabiliteit weerspiegelen. Deze methode ondersteunt targetvalidatie en assay-ontwikkeling voor studies naar penetratie van de bloed-hersenbarrière, waardoor het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen wordt vergroot. Reproduceerbare membraanpreparatie van individuele dieren verbetert de translationele biomarker-afstemming en portfolio-triage in neurofarmacologisch R&D.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar endotheel-specifieke targets, zoals transporters en tight junction-eiwitten, in een ziekterelevant systeem.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbare isolatie van microvaten uit individuele ratten mogelijk om inter-individuele variabiliteit in targetexpressie vast te leggen.
- Strategische waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing en biologische risicoreductie van CNS-targets voorafgaand aan lead-optimalisatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert membraanmonsters die geschikt zijn voor kwantitatieve analyse van de eiwitexpressie en functie van de BBB.
- Operationele waarde: Levert consistente eiwitopbrengsten (5–10 mg/mL), wat gestandaardiseerde assay-inputs mogelijk maakt voor screeningscampagnes.
- Strategische waarde: Faciliteert de assay-gereedheid voor het evalueren van effecten van verbindingen op endotheliale targets in een schaalbaar formaat.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft de ziekterelevantie door microvaten te isoleren uit knaagdiermodellen om de respons van de BBB op farmacologische stimuli te bestuderen.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie met behulp van bij elkaar passende biologische systemen.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door target engagement bij de BBB te bevestigen.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode past binnen het continuüm van ontdekking, van doelwitvalidatie tot preklinische evaluatie, door endotheliaal-verrijkte monsters te leveren voor mechanistische studies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en de bevestiging van targets door verrijking van microvasculaire markers zoals PECAM-1 en Glut1.
- Screening: Levert reproduceerbare monsters met kwantificeerbare eiwitoutputs voor compound-screening en target-engagement assays.
- Analytiek: Maakt Western blot- en Bradford-assay-uitlezingen mogelijk om de eiwitexpressie tussen verschillende condities en geslachten te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door rattenhersenmicrovaten te gebruiken als een ziekterelevant systeem voor therapeutica gericht op de BBB.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform voor meerdere projecten gericht op drug delivery in het CZS en BBB-modulatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij de validatie van BBB-targets te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde centrifugatiestappen en dextran-gebaseerde verrijkingsstappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door endothelspecifieke gegevens te leveren die het biologische risico in een laat stadium bij CNS-programma's verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde expressie in hersenmicrovaten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in neuroanatomie en weefselverwerking om cerebrale microvaten zonder contaminatie te isoleren.
- Toegang tot homogenisatieapparatuur, centrifuges die 5.000 g bij 4°C kunnen bereiken en infrastructuur voor de bereiding van dextran is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van de monsterverwerking tussen teams om consistentie in eiwitopbrengst en zuiverheid te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van de methode op andere soorten of ziekteverschijningsmodellen buiten de rattenhersenen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om monsters op ijs te bewaren en het voorkomen van verstoring van de pellet tijdens het aspireren van het supernatant.
