Name: Een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde Rat hersenen Microvessels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer een eenvoudige methode om hersenmicrovaten te isoleren van Sprague-Dawley ratten voor bloed-hersenbarrièreonderzoek. Deze techniek maakt hoogwaardige eiwitanalyses mogelijk voor neurofarmacologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01-NS084941) en de Arizona biomedisch onderzoek Commissie (ADHS16-162406) aan PTR. WA heeft ontvangen uit het verleden steun van een-gepromoveerde afspraak tot een nationale instituten van gezondheid opleiding verlenen (T32-HL007249).

Alle procedures die hieronder zijn goedgekeurd door een institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en voldoen aan de National Institutes of Health (NIH) en dier onderzoek: rapportage In Vivo experimenten (aankomen) richtlijnen. De procedurele gegevensstroom voor het protocol is afgebeeld in Figuur 1.
1. de set-up voor de Procedure
<ol><li>Bereiden de hersenen microvessel buffer (BMB). Start door weging 54.66 g D-mannitol, 1.90 g EGTA en 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (d.w.z., Tris) base in een bekerglas van schoon. 1.0 L gedeïoniseerd water toevoegen. Het mengen van de componenten van de BMB-buffer met een magneetroerder. Zodra de oplossing heeft goed zijn gemengd, breng de pH op 7.4 met behulp van 1,0 M HCl.</li>
	<li>Bereid 26% dextran (MW 75.000)-oplossing (m/v) voorafgaand aan het anesthetizing van dieren. Bereid de dextran oplossing zoals beschreven in de volgende stappen. Opmerking: Het is uitermate belangrijk voor te bereiden van deze oplossing tevoren omdat dextran ongeveer 1,5-2 h nemen kunt te ontbinden in waterige buffer.<ol>
<li>Weeg de poedervorm dextran (26 g per 100 mL buffer) in een bekerglas van schoon.</li>
		<li>Meet de juiste hoeveelheid BMB en afzien in een bekerglas van afzonderlijke, schoon.</li>
		<li>Langzaam giet BMB in het bekerglas van gepoederde dextran. Handmatig mengen de poedervorm dextran tijdens het gieten van BMB met behulp van een roer roerstaaf.</li>
		<li>Breng de pH op 7.4 met 1,0 M HCl onmiddellijk vóór gebruik. Opmerking: Een typische isolatie van hersenen microvessels van 12 individuele Sprague-Dawley ratten (mannelijk of vrouwelijk; 3 maanden oud; 200-250 g elke) 200 mL dextran oplossing (dat wil zeggen, de 52 g dextran in 200 mL BMB) vereist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. extractie van hersenweefsel van Sprague-Dawley ratten
<ol><li>Na de gewenste experimentele behandeling, anesthetize Sprague-Dawley ratten met behulp van ketamine (50 mg/kg; 2,5 mL/kg i.p.) en xylazine (10 mg/mL; 2,5 mL/kg ik, p.). Verdun ketamine en xylazine in een 0,9% zoutoplossing om de eindconcentraties van 20 mg/mL en 4,0 mg/mL respectievelijk. Euthanaseren dieren door onthoofding met behulp van een scherp guillotine overeenkomstig de richtsnoeren van de IACUC. Gebruik dezelfde procedure voor zowel mannelijke als vrouwelijke Sprague-Dawley ratten.</li>
	<li>Resect de huid van de rat schedel door een enkele dwarse knippen met behulp van chirurgische scharen.</li>
	<li>Met behulp van rongeurs, verwijder voorzichtig de plaat van de schedel en het blootstellen van de hersenen.</li>
	<li>Het verwijderen van de hersenen met behulp van een spatel. Loskoppelen van de hersenen en de geïsoleerde hersenweefsel plaats in een conische tube van 50 mL, met 5 mL BMB. Voeg 1.0 l proteaseinhibitor cocktail per 1,0 mL BMB buffer onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik.</li>
</ol>3. brain Processing
<ol><li>Het hersenweefsel van de conische tube van 50 mL overbrengen naar een schone petrischaal.</li>
	<li>Met behulp van Tang, zachtjes rollen de hersenen op 12,5 cm diameter filterpapier te verwijderen van de buitenste hersenvliezen, die losjes de hand wordt gehouden aan de hersenschors. Zachtjes druk op het hersenweefsel tegen filtreerpapier en het weefsel weer rollen. Schakel het koffiefilter vaak tijdens deze stap.</li>
	<li>De plexus choroideus van de hersenhelften gebruik van pincet scheiden. Opmerking: De plexus choroideus verschijnt als een duidelijke membraanachtig weefsel gelokaliseerd op het oppervlak van de hersenen ventrikels.</li>
	<li>Voorzichtig plat van het hersenweefsel en verwijder resterende hersenvliezen en bulbus bollen met pincet.</li>
	<li>Plaats de corticale hersenweefsel in een gekoeld glas mortier. 5,0 mL van BMB met proteaseinhibitor cocktail aan het cement toevoegen.</li>
	<li>Met behulp van een overhead macht homogenizer, meng het hersenweefsel met behulp van 15 op en neer beroertes bij 3700 t/min. Uitvoeren van homogenisering met behulp van een 10 mL mortier en een stamper weefsel grinder. Tussen homogenisering van elke individuele monster, reinig de stamper met 70% ethanol. Opmerking: Homogenisering lijnen verenigbaar zijn in termen van tempo moeten en omvang.</li>
	<li>Giet het homogenaat in gelabelde centrifuge buizen.</li>
</ol>4. centrifugeren stappen
<ol><li>8.0 mL van 26% dextran-oplossing toevoegen aan elke gelabelde centrifugebuis met hersenen homogenaat.</li>
	<li>Omkeren van de buis tweemaal en vervolgens grondig vortex het monster. Het gedrag van de vortexing van elk monster met behulp van meerdere hoeken om ervoor te zorgen een homogenisatie van het mengsel van hersenen homogenaat oplossing met 26% dextran oplossing.</li>
	<li>Centrifugeer steekproeven bij 5.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Opmerking: Voor sommige analyses, het is nuttig om te vergelijken van hersenen microvessels met hersenen parenchym. Moet de beoordeling van de eiwituitdrukking in hersenen parenchym kan nodig hebt, het supernatant van deze stap van centrifugeren (dat wil zeggen, hersenen parenchymal breuk) worden verzameld en opgeslagen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een vacuüm aspirator en glazen pipet van Pasteur. Opmerking: Let op moet men zich niet de pellet te verstoren. Anders zal de microvessels van de hersenen verzamelde hoeveelheid worden verminderd, die zal leiden tot aanzienlijke afname van de opbrengst van de eiwitten van deze procedure.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 5,0 mL van BMB met proteaseinhibitor cocktail (dat wil zeggen, 1,0 μl proteaseinhibitor cocktail per 1,0 mL BMB buffer). Vortex de pellet om homogenisatie van het mengsel.</li>
	<li>Voeg 8.0 mL van 26% dextran toe aan elke centrifugebuis en vortex zoals beschreven in stappen 4.1-4.2 van dit protocol.</li>
	<li>Centrifugeer steekproeven bij 5.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Met behulp van een vacuüm kolf en glazen pipet, gecombineerd supernatant en ervoor zorgen dat pellet met microvessel van de hersenen, hierdoor niet wordt verstoord. Opmerking: Overmaat materiaal dat zich heeft gehouden aan de buiswand bevat geen microvessels en moet zorgvuldig schoongemaakt en verwijderd.</li>
	<li>Herhaal stap 4.5 tot 4,8 een extra twee keer.</li>
	<li>Eenmaal 4 dextran centrifugeren stappen zijn voltooid, 5,0 mL van BMB toevoegen aan elke pellet en vortex aan resuspendeer de steekproef. Opmerking: Na het voltooien van stap 4.10, hele microvessels kunnen worden verzameld voor analyse van eiwit lokalisatie. Dit kan worden bereikt door het nemen van een 50 μl aliquoot opnieuw gesuspendeerde microvessel pellet en smeren op een microscoopglaasje van glas. Microvessels zijn dan warmte-vastgesteld op 95 ° C gedurende 10 minuten op een blok van de verwarming gevolgd door fixatie in ijskoude ethanol voor een extra 10 min. dia's kunnen vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C totdat vereist voor imaging studies.</li>
</ol>5. ultracentrifugatie ter voorbereiding van de monsters van totale hersenen microvasculaire membranen
<ol><li>Monsters overbrengen in het gekoelde glas homogenizer.</li>
	<li>Met behulp van een overhead macht homogenizer, meng hersenweefsel met behulp van 8-10 op en neer beroertes bij 3000 t/min. Homogenisering wordt uitgevoerd met behulp van een 10 mL mortier en een stamper weefsel grinder. Reinig de stamper met 70% ethanol na homogenisatie van elke individuele monster.</li>
	<li>Overdracht van monsters voor de reiniging van de ultracentrifuge buizen. Nummer en elke individuele buis wegen. Evenwicht en koppel de buizen vóór het laden in de rotor van de ultracentrifuge. Opmerking: Alle wegen en koppeling van de ultracentrifuge buizen moeten worden uitgevoerd met de caps op om ervoor te zorgen nauwkeurige meting van de gewichten van de buis.</li>
	<li>Centrifugeer steekproeven bij 150.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Met behulp van een vacuüm kolf en glazen pipet van Pasteur, bovendrijvende substantie gecombineerd met behulp van zorg niet te verstoren de capillaire membraan-pellet.</li>
	<li>Op basis van de grootte van de pellet, het toevoegen van een passende volume van opslag buffer, die uit gedeïoniseerd water en BMB in een verhouding van 1:1 (v/v bestaat). Typisch, pellets zijn geresuspendeerde in 400-500 μL van opslag buffer. Protease inhibitor cocktail toevoegen aan de buffer van de opslag in een verhouding van 1,0 μl per 1,0 mL opslag buffer.</li>
	<li>Vortex monsters resuspendeer de pellet in opslag buffer.</li>
	<li>Met behulp van een glazen pipet van Pasteur, transfer capillaire membraan monsters naar een gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
	<li>Pass monster door een naald syringe 5 x om het monster wordt grondig gemengd en dat er geen cellulaire aggregaten bestaan.</li>
	<li>Opslaan van monsters bij-80 ° C totdat vereist voor analyse. Opmerking: Eiwitgehalte van elk monster microvessel membraan is gemeten met behulp van de methode Bradford.</li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection%3A+Relevance+to+Treatment+of+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cent+Nerv+Syst+Dis%22%5BJournal%5D)">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802(2017).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+transporters%3A+promoting+blood-brain+barrier+repair+in+response+to+oxidative+stress+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury.</a> Brain Res. 1623, 39-52 (2015).</li>
<li>Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypoxia-reoxygenation+on+rat+blood-brain+barrier+permeability+and+tight+junctional+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).</li>
<li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+oligomeric+assemblies+at+tight+junctions+of+the+blood-brain+barrier+are+altered+by+hypoxia+and+reoxygenation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress.</a> J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).</li>
<li>Lochhead, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+increases+blood-brain+barrier+permeability+and+induces+alterations+in+occludin+during+hypoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).</li>
<li>Lucke-Wold, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryostatin-1+Restores+Blood+Brain+Barrier+Integrity+following+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).</li>
<li>Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+inhibition+prevents+inflammatory+pain+induced+changes+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier.</a> Brain Res. , 6-13 (2008).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+signaling+alters+substrate+permeability+and+tight+junction+protein+expression+at+the+blood-brain+barrier+during+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).</li>
<li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain%3A+a+role+for+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li>
<li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li>
<li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+%28Oatp1a4%29+at+the+blood-brain+barrier%3A+relevance+to+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li>
<li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li>
<li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li>
<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li>
<li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li>
<li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceramide+1-Phosphate+Increases+P-Glycoprotein+Transport+Activity+at+the+Blood-Brain+Barrier+via+Prostaglandin+E2+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling.</a> Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).</li>
<li>Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexose+transport+and+phosphorylation+by+capillaries+isolated+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain.</a> Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li>
<li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li>
<li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+%28Mrp1%29+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li>
<li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier%3A+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery%3F%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel, wordt een eenvoudige en effectieve methode voor te bereiden membraan EiwitSteekproeven van microvessels vers geïsoleerd van rat hersenweefsel beschreven. Verschillende benaderingen voor isolatie van rat hersenen microvessels en/of generatie van membraan preparaten van geïsoleerde microvasculature zijn gemeld in de literatuur13,20,21,22 , 24. Ho...

De bloed - hersenbarrière (BBB) bestaat op het raakvlak tussen het centrale zenuwstelsel (CNS) en de systemische circulatie en speelt een essentiële rol in het behoud van de homeostase van de hersenen. In het bijzonder de BBB functies juist controle opgeloste concentraties in extracellulaire vloeistof van de hersenen en de voedingsstoffen die nodig zijn om te voldoen aan de aanzienlijke metabole eisen van de CNS1door hersenweefsel efficiënt te verstrekken. Deze rollen impliceren dat de BBB, die voornamelijk op het niveau van de microvasculaire endothelial cel bestaat, moet beschikken over een discrete mechanismen waarmee sommige stoffen tot hersenen parenchym en tegelijkertijd te garanderen dat potentieel schadelijke xenobiotica niet accumuleren. Inderdaad, microvasculaire endothelial hersencellen zijn niet fenêtré en vertonen beperkte Pinocytose, die zorgt voor een gebrek aan niet-selectieve permeabiliteit2. Bovendien express microvessel endothelial hersencellen tight junction en adherens junction eiwitten die te vormen een fysieke handelen "zegel" tussen aangrenzende endotheliale cellen en sterk beperken paracellular verspreiding van bloed overdraagbare stoffen in de hersenen Parenchym. Inderdaad, selectieve permeabiliteit van endogene en exogene stoffen vereist functionele uitdrukking van opname- en efflux vervoerders3. Algemene, strakke kruispunten, adherens kruispunten en vervoerders werken samen om de unieke barrière-eigenschappen van de BBB.
De BBB is een dynamische barrière die op farmacologische, fysiologische en pathofysiologische stimuli reageert. Bijvoorbeeld, is hypoxie/heroxygenatie stress aangetoond dat het moduleren van expressie van kritische tight junction eiwitten (dat wil zeggen, occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), die wordt geassocieerd met verhoogde paracellular permeabiliteit aan dergelijke vasculaire markeertekens als sacharose4,5,6. Vergelijkbare waarnemingen zijn gedaan bij de BBB in de omgeving van traumatische hersenen letsel7 en perifere inflammatoire pijn8,9. Deze dezelfde ziekten kunnen ook moduleren vervoer mechanismen op de BBB10,11,12,13,14. Inderdaad, hypoxie/heroxygenatie letsel verbetert functionele uitdrukking van organische anion vervoeren polypeptide 1a4 (Oatp1a4) op de BBB, die kunnen leiden tot een aanzienlijke stijging van het vervoer van bloed-aan-hersenen van specifieke Oatp vervoer substraten zoals taurocholate en Atorvastatine13. BBB eigenschappen kunnen ook worden gewijzigd door farmacotherapie zelf, een mechanisme dat kan een basis voor beide ingrijpende veranderingen in de effectiviteit van de drug in de hersenen en voor interactie van de drug-drug vormen. Bijvoorbeeld, signalering mechanismen van doelen van paracetamol nucleaire receptor in de hersenen microvasculaire endotheliale cellen, functionele expressie van de kritische efflux vervoerder P-glycoproteïne (P-gp) verhoogt, en wijzigt de tijd-afhankelijke analgesie verleend door morfine, vervoeren een opioïde pijnstillende drug en gevestigde P-gp substraat15. Een grondige kennis van BBB veranderingen, die kan worden opgewekt door ziekten of door drugs, vereist ook identificatie en karakterisering van specifieke regulerende mechanismen waarmee deze wijzigingen. Inderdaad, discrete signaalroutes zijn geïdentificeerd in hersenen microvasculaire endotheliale cellen die de moleculaire uitdrukking van strakke junction eiwitten16,17 en vervoerders15, bepalen 18,19. Samen genomen, deze opmerkingen aangeven dat complexe moleculaire pathways bij de regulering van BBB strakke kruispunten en vervoerders in zowel de volksgezondheid als de ziekte betrokken zijn.
Een belangrijke uitdaging in de studie van de BBB is de absolute vereiste van een eenvoudige en effectieve methode voor het isoleren van microvessels van hersenweefsel afkomstig van proefdieren en latere bereiding van de monsters van het membraan. Deze monsters moeten worden voorbereid, zodat ze zijn zowel met microvasculaire endothelial hersencellen verrijkt en in aanwezigheid van andere celtypes beperkt. In de afgelopen jaren, zijn meerdere methoden voor het isoleren van microvasculature van knaagdier hersenen gemeld in de wetenschappelijke literatuur13,20,21,22. Dit artikel beschrijft een eenvoudig, robuust, en reproduceerbare methode voor isolatie van de microvessels van de rat hersenen en voor de bereiding van endothelial membraan verrijkte monsters die kunnen worden gebruikt voor de analyse van eiwit expressie. Een voordeel van dit protocol van de isolatie microvessel is de mogelijkheid om een individuele proefdieren staalvoorbereiding van hoge kwaliteit en met voldoende eiwit opbrengst te verkrijgen. Hierdoor is de behandeling van dieren variabiliteit in eiwit expressie. Dergelijke een voorschot in dit protocol is sterk verbeterd de robuustheid van BBB studies omdat overschatting (of onder schatting) van de ware omvang van eiwit veranderingen bij de BBB kan nu worden vermeden. Daarnaast maakt de integratie van meerdere centrifugeren stappen met dextran verbeterde verrijking van microvessels in experimentele monsters terwijl het verwijderen van ongewenste cellulaire bestanddelen zoals neuronen vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Component van buffer voor hersenmicrovaten</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Component van buffer voor hersenmicrovaten</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Component van buffer voor hersenmicrovaten</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Component van buffer voor hersenmicrovaten</td></tr><tr><td>Dextran (MW 75.000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dextran gebruikt in centrifugatiestap om microvaten te scheiden van hersenparenchym</td></tr><tr><td>Zetamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>Algemeen anestheticum</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>Algemeen anestheticum</td></tr><tr><td>0,9% zoutoplossing</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>Verdunning voor algemeen anestheticum</td></tr><tr><td>Filterpapier (12,5 cm diameter)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Gebruikt voor verwijdering van hersenvliezen uit hersenweefsel</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Wegwerpbuizen gebruikt voor dextran centrifugatiestap</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Coomassie Plus (Bradford) Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Meting van eiwitconcentratie in membraanpreparaten</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Vereist voor homogenisatie van monsters</td></tr><tr><td>10,0 ml glazen mortel en pestel weefselsnijder</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#358039</td><td>Vereist voor homogenisatie van monsters</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Vereist voor pH-aanpassing van buffers</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Eiwitstandaard voor Bradford Assay</td></tr><tr><td>Standaard Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>Gebruikt voor dissectie van hersenweefsel</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>Gebruikt voor het openen van de schedel om de hersenen te isoleren</td></tr><tr><td>50 ml conische centrifugebuizen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Gebruikt voor het verzamelen van hersenweefsel na isolatie</td></tr><tr><td>Glazen Pasteur Pipetten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Gebruikt voor aspiratie van cellulaire restanten na dextranspins</td></tr><tr><td>Ethanol, watervrij</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Gebruikt voor het schoonmaken van de weefselsnijder; verdund tot 70% met gedistilleerd water</td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuizen</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Gebruikt voor ultracentrifugatie van monsters</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde rat hersenen microvessels

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

De bloed - hersenbarrière (BBB) is een dynamische barrière-weefsel dat op verschillende pathofysiologische en farmacologische stimuli reageert. Dergelijke veranderingen ten gevolge van deze prikkels kunnen sterk moduleren drug levering naar de hersenen en, bij uitbreiding, aanzienlijke uitdagingen bij de behandeling van het centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten veroorzaken. Vele BBB veranderingen die invloed op farmacotherapie, waarbij eiwitten die zijn gelokaliseerd en uitgedrukt op het niveau van endotheliale cellen. Inderdaad, heeft deze kennis op BBB fysiologie in gezondheid en ziekte leidde tot aanzienlijke belangstelling voor de studie van deze membraaneiwitten. Vanuit een oogpunt van de fundamentele wetenschap onderzoek impliceert dit een verplichting voor een simpel maar robuust en reproduceerbare methode voor isolatie van de microvessels van hersenweefsel geoogst van proefdieren. Ter voorbereiding van membraan monsters van vers geïsoleerde microvessels, is het essentieel dat de staalvoorbereiding worden verrijkt in de endotheliale cellen maar in het bijzijn van andere celtypes van de neurovasculaire eenheid (dat wil zeggen, astrocyten, microglia, neuronen beperkt, pericytes). Een bijkomend voordeel is de mogelijkheid om voor te bereiden van monsters van individuele dieren om te vangen de ware variabiliteit van eiwit expressie in een experimentele bevolking. In dit manuscript vindt u details over een methode die wordt gebruikt voor isolatie van rat hersenen microvessels en bereiding van de monsters van het membraan. Verrijking van de Microvessel, van monsters afgeleid, wordt bereikt met behulp van vier centrifugeren stappen waar dextran is opgenomen in de steekproef buffer. Dit protocol kan gemakkelijk aangepast worden door andere laboratoria voor hun eigen specifieke toepassingen. Monsters die zijn gegenereerd op basis van dit protocol is aangetoond dat de opbrengst van robuuste experimentele gegevens van eiwit analyse experimenten die het begrip van BBB reacties op stimuli van farmacologische, fysiologische en pathofysiologische sterk kunnen helpen.

De experimentele stroom voor isolatie van rat hersenen microvessels en voor de bereiding van microvessel membraan monsters is afgebeeld in Figuur 1. Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, succesvolle Isolatievan intact microvessels van rat hersenen is aangetoond (figuur 2A). Deze schepen werden verkregen na voltooiing van centrifugeren met dextran en onmiddellijk vóór ultracentrifugatie te bereiden membraan monsters ...

Hier wordt een methode voor het isoleren van de rat hersenen microvessels en voor de bereiding van de eindmonsters membraan beschreven. Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het produceren van verrijkte microvessel monsters met aanvaardbare eiwit van individuele dieren opbrengst. Steekproeven kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses van de robuuste proteïne in de hersenen microvasculaire endotheel.

Een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde Rat hersenen Microvessels

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

Het algemene doel van deze procedure is om cerebrale microvaten te isoleren uit rattenhersenen voor biochemisch onderzoek gericht op het begrijpen van moleculaire kenmerken van de bloed-hersenbarrière van zoogdieren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de fysiologie en neurofarmacologie van de bloed-hersenbarrière, zoals regulatie, lokalisatie en expressie van tight junction-eiwitten en endogene transporters in gezondheid en ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een voldoende aantal hoogwaardige microvaten kunnen isoleren van een individueel dier, terwijl rekening wordt gehouden met de natuurlijke variabiliteit in eiwitexpressie tussen individuele dieren.Bianca Reilly, een uitstekende bachelorstudent uit mijn laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Na het euthanaseren en onthoofden van een Sprague-Dawley-rat volgens het tekstprotocol, gebruik chirurgische schaar om de huid van de schedel van de rat te reseceren door een enkele transversale snede te maken. Gebruik ronguiers om voorzichtig de schedelplaat te verwijderen en breng de hersenen bloot.Vervolgens, met een spatel, verwijder het orgaan. Los het cerebrum en plaats

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Intravenously inject fluorophore-tagged albumin, which crosses the damaged BBB, reaching the brain.

Preparation of Rat Brain Sections for Electron Microscopy Analysis of Blood-Brain Barrier Integrity

This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse's brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

This video demonstrates the dissociation of frozen rat brain tissue into a single-cell suspension using enzymatic digestion and mechanical trituration. The prepared cells are fixed and permeabilized with ethanol for downstream applications like flow cytometry or gene expression analysis.

Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

We beschrijven een protocol dat de zuivering van het vasculaire compartiment van de muizenhersenen mogelijk maakt. Geïsoleerde hersenvaten omvatten endotheelcellen die zijn verbonden door strakke verbindingen en omringd door een continue basale lamina, pericyten, vasculaire gladde spiercellen, evenals perivasculaire astrogliale membranen.

Zuivering van Mouse Brain Schepen

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Wij beschrijven procedures voor de verwerking van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen hoge-resolutie elektronen micrografen voor Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals. De met deze methoden verkregen micrografen kunnen ook gebruikt worden om de morfologie van een aantal andere cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen.

Voorbereiding van pasgeboren rat hersenweefsel voor Ultrastructurele Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals

We presenteren een protocol voor de extractie van Murine cerebrale pericytes. Gebaseerd op een antibioticum-vrije verrijkings georiënteerde pericyte extractie, is dit protocol een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies die een hoge zuiverheid en hoge opbrengst bieden, waardoor het aantal gebruikte proefdieren afneemt.

Een hoge Uitvoermethode om cerebrale Pericytes van de muis te isoleren

Leer een eenvoudige methode om hersenmicrovaten te isoleren van Sprague-Dawley ratten voor bloed-hersenbarrièreonderzoek. Deze techniek maakt hoogwaardige eiwitanalyses mogelijk voor neurofarmacologische studies.

Een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde Rat hersenen Microvessels

Meer video's verkennen