Name: Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Leer ex vivo calcium imaging voor het visualiseren van neuronale reacties op endocriene signalering in Drosophila. Deze methode maakt screening van peptiden mogelijk om hersenfunctie te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (15K 07147, 17K 07419) van JSPS (Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), een onderzoeksbeurs van Inamori Foundation (naar HI), en het programma van het gezamenlijke gebruik/Research Center for Developmental geneeskunde, op het Instituut voor moleculaire embryologie en genetica, Kumamoto Universiteit (HS). Wij bedanken Dr. Azusa Kamikouchi en Mr. Daichi Yamada voor hun hulp bij het gebruik van de imaging systeem.

1. bereiding van larvale hersenen explantaten
<ol><li>Het maken van een imaging kamer. Opmerking: Stabiele opname vereist dat de hersenen explantaten worden aangebonden. Hier, een goedkope, handgemaakte imaging expositiekamer gebruik wordt gemaakt in de Ca2 + imaging systeem.<ol>
<li>Met behulp van Tang, kras midden onder in een schotel van kunststof cultuur (35 x 10 mm) te maken van een deuk voor het ventrale ganglion van de larvale hersenen waardoor montage eenvoudiger (stap 1.3, Figuur 1).</li>
		<li>Met een tandenstoker, plaats een kleine daling van superlijm aan weerszijden van de deuk en een staaf van wolfraam (0,125 mm diameter, 6 tot 7 mm lang) hechten aan de lijm.</li>
		<li>Met behulp van een klein stukje van putty-achtige herbruikbare lijm, rondom Maak een circulaire muur (10 mm in diameter en 3 mm hoge) de deuk (Figuur 1). Opmerking: De ruimte binnen de muur zal worden later gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH 7,4 ± 0,05 bij 25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dierlijke voorbereiding Opmerking: Voor calcium beeldvorming, is een calcium-indicator, GCaMP6s, uitgedrukt in het celtype van belang, dat gebeurt meestal door middel van combinaties van weefsel-specifieke GAL4 en UAS-GCaMP6s. Om ervoor te zorgen dat het signaal wordt gemedieerd door de kandidaat-receptor, wordt GCaMP6s ook uitgedrukt in een mutant met gebreken in de receptor.<ol>
<li>Wanneer experimentele vergelijkingen voor verschillende genotypen zoals wild type en mutanten vereist zijn, niveau leeftijd de larven van de test van de wedstrijd om te voorkomen dat GCaMP6 expressie variaties en fysiologische verschillen als gevolg van de ontwikkelingsstadia.</li>
		<li>Houd ouderlijke vliegen (30 vliegen voor elk geslacht) in een flesje van de cultuur met standaard vliegen voedsel voor 8 h tot het leggen van eieren toestaan op het oppervlak van het voedsel. De larven van de cultuur in massa onder een 12-h licht-donker cyclus bij 25 ° C en 60-70% relatieve vochtigheid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Van larvale hersendissectie<ol>
<li>90-120 uur na ei leggen (AEL), verzamelen van larven en was ze ten minste 3 keer met gedestilleerd water te verwijderen van aanhangend voedsel puin.</li>
		<li>Plaats een larve op een horlogeglas vierkant 1.5-inch gevuld met ijs koud PBS. Opmerking: De volgende twee stappen worden uitgevoerd in deze horlogeglas onder de Microscoop ontleden.</li>
		<li>Gebruik pincet voorzichtig grijpen het middengedeelte van de larve. Gebruik een ander pincet te grijpen de mond haken en trek de mond haken zachtjes te scheiden van het voorste deel van de larve met de hersenen van de rest van het lichaam. Opmerking: U kunt ook chirurgische schaar kan worden gebruikt.</li>
		<li>Houd het voorste puntje door pincet en draai de larve binnenstebuiten. Verwijderen van vreemde weefsel gehecht aan de hersenen, zoals imaginaire schijven, vet organen en ring klier. Voorzichtig het scheiden van de hersenen van de monddelen.</li>
		<li>Breng 200 µL van PBS aan de binnenkant van de ring gemaakt van de putty-achtige herbruikbare lijm in de beeldvorming zaal. Zachtjes zuigen de ontleed hersenen met PBS in een pipet van Pasteur, en breng het in de beeldvorming kamer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instellen van de hersenen in de beeldvorming kamer<ol>
<li>Gebruik pincet te grijpen van spiervezels die zich uitstrekt van de ventrale ganglia. Plaats de hersenen zachtjes in de deuk onder de draad wolfraam.</li>
		<li>Een ander pincet, trek de draad wolfraam licht tot plaats met de hersenen op de juiste positie voor imaging (Figuur 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. verwerving van Ca2 + fluorescentie beelden
Opmerking: Hersenen explantaten ondergedompeld in PBS zijn beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop uitgerust met een 20 X water-immersie objectief (N.A. = 0,5). PBS worden cellen in de hersenen niet geactiveerd. Als z-as beelden nodig zijn, is het objectief met een piëzo-elektrische-geactiveerde lens mover gemonteerd. Een draaiende schijf confocal hoofd wordt gebruikt voor het verbeteren van de resolutie van de tijd. Voor weinig licht imaging, is een elektron te vermenigvuldigen charge - coupled apparaat camera gemonteerd op de Microscoop. De beeldvorming van GCaMP6s fluorescentie (excitatie/emissie: 488/509 nm) vereist een 488-nm laser voor excitatie met een dichroïde balk splitter en een uitstoot-filter (bv., 528 ± 38 nm band bandfilter filter).
<ol><li>Plaats de imaging cupje met de explant hersenen onder de Microscoop.</li>
	<li>Lager het objectief totdat het raakt de PBS. Onder heldere-veld de verlichting, de hersenen plaats en brengen het in beeld. Ga naar tl-licht en de focus op de cellen van GCaMP6s-label aanpassen. Opmerking: De basale groene fluorescentie van de GCaMP6s zichtbaar moet zijn.</li>
	<li>Start acquisitie bij 250 ms/frame met een resolutie van 512 x 512 pixels in watergekoelde modus met behulp van de juiste acquisitie software (bijv., µManager). Pas de belichtingstijd te verkrijgen van de fluorescentie waarden binnen het dynamisch bereik van de CCD-camera, maar niet lager dan 1000 (willekeurige eenheden), met 16-bits afbeeldingen (dynamisch bereik 0-65.535). Opmerking: Er is een geringe blootstellingstijd dient te minimaliseren foto-bleken van de GCaMP6s. Blootstellingstijd moet worden geoptimaliseerd in elk experiment, aangezien het afhangt van de niveaus van de expressie van de GCaMP6 en de gevoeligheid van het detectiesysteem. Het was 100 ms bij het gebruik van onze experiment dilp2 > GCaMP6s. Wanneer z-profielen nodig om een bepaalde imaging diepte zijn, kunnen verschillende z-sectie beelden afhankelijk van de blootstelling tijd en frame intervallen worden verworven. Als de camera genoeg ruimtelijke resolutie heeft, worden de binning grootte (aantal registers op de chip, die zal worden weggegooid in een digitale pixel) opgevoerd ter vermindering van de blootstellingstijd.</li>
	<li>Zodra de imaging parameters worden bepaald, nemen beelden voor 1 min vóór peptide administratie te detecteren basislijn signaal intensiteit (F0).</li>
	<li>Toepassing van de test-peptide; hiervoor los 100 µL van peptide oplossing in PBS en Pipetteer het rechtstreeks in het larvale bad een optimale concentratie opleveren. Opmerking: De peptide-oplossing langzaam moet worden geïnjecteerd (b.v., stroom tarief 20 µL/s) in de oplossing van de bad met behulp van een precisiepipet. Niet-verwante synthetische peptide opgelost in PBS wordt gebruikt als een negatieve controle.</li>
	<li>Het opnemen van de uitstoot van de GCaMP6s voor een paar minuten.</li>
</ol>3. de gegevensanalyse
Opmerking: Imaging gegevens worden geanalyseerd off line met de ImageJ. Tijdens de time-lapse beeldvorming, pipetting zorgt ervoor dat de larvale hersenen om te gaan. Daarom moeten de positionele aberraties van de seriële beelden vóór de analyse worden gecorrigeerd. De correctie kan worden uitgevoerd met behulp van een plug-in, ImageJ TurboReg als volgt.
<ol><li>Open de software van de analyse en het gebruik van het eerste frame (vóór de toepassing van de peptide) als een referentiebeeld.</li>
	<li>Selecteer Plugins | Registratie | TurboReg.</li>
	<li>Kies het seriële afbeeldingsbestand als de bron en het referentiebeeld als het doel.</li>
	<li>Controleer Vastlichaam (parallelle verschuiving en draaiing van beelden) en Accurate ("Snelle" is grof maar snelle analyse in plaats daarvan) voor de verwerkingsmethode en kwaliteit, respectievelijk.</li>
	<li>Klik op de partij om te beginnen de beeldverwerking.</li>
	<li>Selecteer meerdere regio's van belang (ROIs) met behulp van de Analyze | Tools | ROI Manager in ImageJ.</li>
	<li>Meten van de intensiteit van de pixel door te klikken op meer | Multi maatregel | OK in het venster van de Manager van de ROI.</li>
	<li>Berekenen van ΔF/F0 = (F - F0) / f0, waar F is de intensiteit van de ROI op het moment van de stimulus, en F0 is de intensiteit op een tijd-venster onmiddellijk voordat een bepaalde experimentele gebeurtenis (bijvoorbeeld 30 frames voorafgaande aan de stimulans begin).</li>
	<li>Herhaal het experiment met behulp van meerdere hersenen monsters, het uitvoeren van statistische verwerking om te verkrijgen van het gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) op elk tijdstip.</li>
</ol>

<ol><li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li>
<li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li>
<li>Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100081">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).</li>
<li>Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100044">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).</li>
<li>Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100019">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).</li>
<li>Claeys, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+neuropeptide+and+peptide+hormone+receptors%3A+current+knowledge+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions.</a> Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).</li>
<li>Gade, G., Goldsworthy, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+peptide+hormones%3A+a+selective+review+of+their+physiology+and+potential+application+for+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control.</a> Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10731132">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li>
<li>Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+peptidergic+cells+in+Drosophila%3A+where+DIMM+fits+in%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in.</a> PLoS One. 3 (3), 1896(2008).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8381210">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+regulate+insulin+producing+cells+and+their+output+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila.</a> Frontiers in Physiology. 4, 252(2013).</li>
<li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26020940">The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genetics. 11 (5), 1005209(2015).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
<li>Sabado, V. aN., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015(2018).</li>
<li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193(2016).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De Ca2 + beeldvorming van de hier beschreven methode is een nuttig systeem voor het testen van de functie van hormonen in de hersenen. In vivo, de hersenen ontvangt hormonen van verschillende endocriene organen. Daarnaast ziet de hersenen voortdurend oplopende zintuiglijke informatie, waardoor spontane neuronale activering. Dit systeem ex vivo elimineert deze ruis en levert een betere signaal/ruis-verhouding dan in vivo imaging. In dit systeem, kunnen de moleculen worden getest afzon...

Mededeling van de orgel-naar-orgel is een evolutionair geconserveerde strategie voor het behoud van de homeostase om te gaan met veranderingen in het milieu. Bij de mens, een scala aan hormonen arereleased van de endocriene klieren in de circulatie. Veel van deze hormonen richten de hypothalamus van de hersenen, die regelt metabole processen en fundamentele gedrag zoals het voederen van1,2. Veel hormonen hebben ontdekt met behulp van zoogdieren modellen. Nochtans, de mechanismen van hun optreden, met name de interorgan netwerken waaraan zij deelnemen, grotendeels onduidelijk blijven.
Drosophila melanogaster heeft ontpopt als een nuttig model voor het bestuderen van de mededeling van de orgel-naar-orgel. Bij insecten, worden veel fysiologische processen gecontroleerd door hormonen. Vroege studies gericht op groei en metamorfose gebruikt grote insecten. In deze studies voorspelde de verwijdering of transplantatie van specifieke organen het bestaan van Inter orgel signalering moleculen; later, waren Juvenile hormoon (JH), Prothoracicotropic hormoon (PTTH) en Ecdysone biochemically gezuiverde3,4,5. Een grote familie van intercellulaire signalering peptiden wordt gedacht te worden betrokken bij diverse fysiologische evenementen tijdens de levenscyclus van de insecten6,7. De meeste van deze peptides handelen op de G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCRs), hoewel de specifieke GPCRs in eerste instantie moeilijk waren te identificeren met behulp van conventionele benaderingen. De publicatie van de Drosophila hele genoom reeks8 was de doorbraak die de identificatie van Drosophila bioactieve peptiden op basis van hun homologie met die gevonden in andere insecten ingeschakeld. Daarnaast werden de receptoren voor verschillende peptides geïdentificeerd van GPCRs voorspeld in het genoom met behulp van cel-cultuur-gebaseerde GPCR-ligand bindende analyses. Vervolgens voorspelde expressie analyses de orgel-naar-orgel trajecten ontlokte door deze peptiden en de receptoren. Met name worden veel van de vermeende peptide receptoren uitgedrukt in de hersenen, wat suggereert dat de hersenen een belangrijk doelwit van peptide hormonen9 is. Bovendien hebben de geavanceerde genetische hulpmiddelen in Drosophila bijgedragen tot de identificatie van fysiologische functies van peptide-GPCR combinaties. Bijvoorbeeld, inschakelen de GAL4 en de LexA gebaseerde binaire transcriptionele systemen gene knockdown of overexpressie in een ruimtelijk en tijd gecontroleerde manier. GAL4, een transcriptiefactor geïdentificeerd in gist, bindt aan een specifieke cis-regulerende opeenvolging Upstream activering sequentie (UAS) genoemd. In de GAL4/UAS-systeem, de driver regel biedt weefsel-specifieke of expressie van fase-specifieke GAL4 en de responder-lijn draagt UAS stroomopwaarts van het gen van belang of de constructie op station shRNA expressie. LexA/LexAop systeem is gebaseerd op een soortgelijk mechanisme. Fenotypische analyse van weefsel-specifieke peptide-knockdown en weefsel-specifieke GPCR-knockdown dieren kunnen onthullen informatie over de peptide-GPCR signalering modus en werkplek waar de activiteiten. De conclusies die bereikbaar uitsluitend per genetische gegevens zijn echter beperkt. Aan de andere kant, zodra het vermeende doelwit van een bepaalde peptide hormonen is teruggebracht tot een type weefsels of cellen, kan ex vivo calcium beeldvorming in orgel explantaten worden gebruikt voor het ophelderen van de mededeling van de orgel-naar-orgel gemedieerd door peptide-GPCR signalering. Bij het activeren van een GPCR Gq-combinatie, wordt de intracellulaire Ca2 + concentratie verhoogd door de vrijval van Ca2 + van de ER10. In de hersenen verheft de neurale activering ook de intracellulaire Ca2 + niveaus. Dergelijke Ca2 + verhogingen kunnen worden gedetecteerd door een calcium-sensor, GCaMP, die conformationele veranderingen in aanwezigheid van Ca2 + resulterend in fluorescentie emissie11ondergaat.
In dit artikel wordt een calcium beeldvorming methode met behulp van Drosophila hersenen explants beschreven. Om te testen op het vermogen van een peptide te activeren van specifieke neuronen, een test-peptide wordt toegepast op de GCaMP-uiten hersenen explant, en fluorescentie wijzigingen worden gecontroleerd door confocale microscopie. De betrokkenheid van de GPCR wordt vervolgens bevestigd door het uitvoeren van de dezelfde bepaling met behulp van een mutant hersenen ontbreekt de GPCR. Deze combinatie van beeldvorming en genetica biedt nauwkeurige informatie over de mededeling van de orgel-naar-orgel door peptiden-GPCRs. mogelijke modificaties en toepassingen van dit protocol worden ook besproken.

```html
<table><tbody><tr><td>Wolfraamstaaf</td><td>A-M systemen, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Parijs, Frankrijk</td><td>3049100</td><td>kits-achtige herbruikbare lijmen</td></tr><tr><td>Kijkglas, vierkant, 1 5/8 in</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td>Fosfaat gebufferde zouten</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokio, Japan</td><td></td><td>Op maat gemaakt peptide</td></tr><tr><td>Ghrelin</td><td>Peptide Institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptine</td><td>Peptide Institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland</td><td>Axio Imager A2</td><td>fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>Objectief W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland</td><td>420957-9900-000</td><td>objectieflens voor waterimmersie</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC objectiefscanner met lange afstandsbereik</td><td>Physik Instrumente GmbH &amp; Co. KG, Karlsruhe, Duitsland</td><td>N/A</td><td>piëzo-geactiveerde lensbeweger</td></tr><tr><td>Confocale scannereenheid CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokio, Japan</td><td>CSU-W1</td><td>confocale kop met draaiende schijf</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD-camera</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>488-nm laser</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dichroische beamsplitter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>dichroische beam splitter</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/38-25</td><td>emissiefilter</td></tr><tr><td>&micro;Manager</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>
```

ex vivo calcium imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Orgel-naar-orgel communicatie door endocriene signalering, bijvoorbeeld is vanuit de periferie naar de hersenen, essentieel voor het behoud van homeostase. Als een dier model voor endocriene onderzoek, wordt Drosophila melanogaster, die heeft verfijnde genetische hulpmiddelen en genoominformatie, steeds meer ingezet. Dit artikel beschrijft een methode voor de calcium-beeldvorming van Drosophila hersenen explantaten. Deze methode kan de detectie van de directe signalering van een hormoon aan de hersenen. Het is algemeen bekend dat vele peptide hormonen via de G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCRs) handelen, wiens activering een verhoging van de intracellulaire Ca2 +concentratie veroorzaakt. Neurale activering verheft ook intracellulaire Ca2 + niveaus, variërend van zowel Ca2 + toestroom en de vrijlating van Ca2 + opgeslagen in het endoplasmatisch reticulum (ER). Een calcium-sensor, GCaMP, kan deze Ca2 + wijzigingen controleren. Bij deze methode GCaMP wordt uitgedrukt in de neuronen van belang, en de GCaMP-uiten larvale hersenen is ontleed en gekweekte ex vivo. De test-peptide wordt vervolgens toegepast op de hersenen explant, en de fluorescerende wijzigingen in GCaMP worden gedetecteerd met behulp van een draaiende schijf confocal microscoop uitgerust met een CCD-camera. Met behulp van deze methode, een in water oplosbare molecuul kan worden getest, en verschillende cellulaire gebeurtenissen die zijn gekoppeld aan de neurale activering kunnen worden beeld met behulp van de passende fluorescerende indicatoren. Bovendien, door aanpassing van de beeldvorming kamer, deze methode kan worden gebruikt om het imago van de organen van andere Drosophila of de organen van andere dieren.

Met behulp van dit protocol, werd de activering van de insuline-producerende hersencellen (IPCs) door de peptide hormonen, CCHa2, onderzocht. IPCs van de wild-type hersenen waren gelabeld met GCaMP6s met behulp van een combinatie van dilp2 -GAL412 (een geschenk van Dr. Rulifson) en UAS-GCaMP6s13 (een geschenk van Dr. Kim). Larvale hersenen explantaten werden behandeld met een synthetisch CCHa2 peptide, en de fluorescentie v...

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de endocrinologie en de neurowetenschappen, zoals ons onderzoek om de hersenreacties op endocriene signalen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat je de directe effecten van endocriene signalen op de hersenen kunt onderzoeken, gescheiden van andere weefsels. Om deze procedure te starten, gebruik je een pincet om de bodem van het midden van een plastic kweekschaal te krassen om een kuiltje te maken voor een gemakkelijkere montage van het ventrale ganglion van de larvale hersenen na de dissectie.Plaats met een tandenstoker een kleine druppel superlijm aan weerszijden van de kuil en bevestig een wolfraamstaafje aan de lijm. Maak vervolgens met een klein stukje herbruikbaar plakmiddel een cirkelvormige muur rond de kuil. Om de larvale hersenen te dissekteren, verzamel 90 tot 120 uur na het leggen van de eieren larven en was ze minimaal drie keer met gedestilleerd water om voedselresten te verwijderen.Leg vervolgens een larve op een vierkante glasplaat van anderhalve inch gevuld met ijskoud PBS. Gebruik een pincet om het middelste deel van de larve voorzichtig vast te grijpen. Gebruik een ander paar pincetten om voorzichtig aan de mondhaken te trekken om het voorste deel van de larve met de hersenen te scheiden van de rest van het lichaam.Houd vervolgens het voorste uiteinde met de pincetten vast en draai de larve binnenstebuiten. Verwijder de overtollige weefsels die aan de hersenen zijn bevestigd, zoals imaginale schijven, vetlichamen en ringklier. Scheid voorzichtig de hersenen van de monddelen.Breng vervolgens 200 microliter PBS aan aan de binnenkant van de eerder voorbereide kleefringen in de beeldvormingskamer. Zuig voorzichtig de gedissekteerde hersenen met PBS op in een Pasteur-pipet en breng ze over naar de beeldvormingskamer. Grijp in de beeldvormingskamer de spiervezels die zich uitstrekken van de ventrale ganglia en breng de hersenen voorzichtig in de kuil onder de wolfraamdraad.Trek vervolgens de wolfraamdraad lichtjes omhoog om de hersenen op de juiste positie voor beeldvorming te plaatsen. Om calciumfluorescentiebeelden te verkrijgen, plaatst u de beeldvormingskamer met de hersenexaat onder de microscoop. Laat het objectief zakken tot het de PBS raakt en positioneer onder helder veldverlichting de hersenen en breng ze scherp.Schakel over naar fluorescentielicht en pas de focus aan op de GCaMP-succes gelabelde cellen. Start de acquisitie bij 250 ms/frame, bij een resolutie van 512 x 512 pixels in watergekoelde modus. Pas vervolgens de belichtingstijd aan om de fluorescentiewaarden binnen het dynamische bereik van de CCD-camera te verkrijgen, maar niet lager dan 1000 willekeurige eenheden met 16-bits beelden.Zodra de beeldvormingsparameters zijn bepaald, neemt u de beelden gedurende één minuut voor peptidetoediening om de basislijn signaalintensiteiten te detecteren. Breng vervolgens het testpeptide direct aan door 100 microliter van de bereide peptideoplossing in het larvale bad te pipetten. Registreer de GCaMP-succesemissie gedurende enkele minuten.Om de gegevens te analyseren, opent u de analysesoftware en gebruikt u het eerste frame dat vóór peptidetoediening was als referentiebeeld. Selecteer vervolgens Plugins, TurboReg. Kies het seriële beeldbestand als de bron en het referentiebeeld als doelwit.Controleer vervolgens Rigid Body en Accurate voor de verwerkingsmethode en kwaliteit, respectievelijk. Klik vervolgens op Batch om met beeldverwerking te beginnen. Selecteer meerdere interessegebieden door Analyze, Tools, ROI Manager in het beeldlade te gebruiken.Meet vervolgens de pixelintensiteit door op Meer, Multi Meet, OK te klikken in het ROI Manager-venster. In dit experiment werd Wild type-hersenen blootgesteld aan CCHa2, Ghrelin en Nociceptin, terwijl CCHa2-receptormutante hersenen werden blootgesteld aan CCHa2. GCaMP6-signalen in insulineproducerende cellen werden gedetecteerd door confocale microscopie bij 250 ms/frame, en hier zijn de stilstaande beelden van geselecteerde tijdstippen.De verhouding van de verandering van de ROI-intensiteit tot de basislijn signaalintensiteit op elk tijdstip werd geplot. ROI's werden ingesteld op cellichamen die in hetzelfde brandpuntsvlak werden gedetecteerd. De doorlopende lijnen geven het gemiddelde van vijf tot 10 steekproeven aan, en de stippellijnen markeren de bovenste en onderste grenzen van de standaardfout van het gemiddelde.De geschaduwde gebieden geven de variatie van de signalen in de experimenten aan. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd, als deze goed wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het hersenmonster snel moet worden voorbereid om schade te voorkomen.Deze procedure kan worden gecombineerd met genetica om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals over receptorspecificiteit. Het systeem dat in dit protocol wordt gebruikt, is eenvoudig te bereiden en herbruikbaar. Dit protocol zal dus nuttig zijn voor, bijvoorbeeld screenings.Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van de endocrinologie en neurowetenschappen om hormonale netwerken te onderzoeken die de hersenfunctie bij Drosophila regelen.

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Deze video beschrijft in vivo calcium beeldvorming in Drosophila neuronen met behulp van GCaMP. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u veranderingen in GCaMP-fluorescentie van paddestoellichaamneuronen kunt registreren tijdens een olfactorisch conditioneringsexperiment.

Drosophila In Vivo Calcium imaging: een methode voor functionele beeldvorming van neuronale activiteit

This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Source: Lark, A. R., et. al.,  In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates real-time imaging of calcium dynamics using Green fluorescent protein-aequorin bioluminescence in Drosophila's deep brain structures.

Bioluminescence Imaging for Studying Calcium Transients in Drosophila Brain Structures

De voorpoten en slurf van Drosophila bevatten een rijk repertoire van gustatoire sensorische neuronen. Hier presenteren we een methode met behulp van calciumbeeldvorming om fysiologische reacties van sensorische neuronen in de voorpoot en slurf van levende vliegen te meten na exogeen aanbrengen van een gustatoir feromoon.

Meten van fysiologische reacties<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca 2+ tijdens ei activering in Drosophila.

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een protocol voor ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila met GCaMP6-expressie om epileptiforme activiteiten te monitoren. Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van ictale gebeurtenissen bij volwassen Drosophila door middel van ex vivo calciumbeeldvorming, waardoor de mogelijke mechanismen van epilepsie op cellulair niveau kunnen worden onderzocht.

Ex Vivo Calciumbeeldvorming voor Drosophila-model van epilepsie

We presenteren calciumbeeldvormingsprotocollen voor een Drosophila-larvale olfactorische neuron, met behulp van een topische weefsellijm voor immobilisatie. Deze methode verbetert de stabiliteit en maakt betrouwbare in- en ex-vivo-experimenten mogelijk. Aangepaste R-scripts analyseren calciumsignalen en bieden een efficiënt platform voor gedetailleerd neurofysiologisch onderzoek.

In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar

Leer ex vivo calcium imaging voor het visualiseren van neuronale reacties op endocriene signalering in Drosophila. Deze methode maakt screening van peptiden mogelijk om hersenfunctie te onderzoeken.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Meer video's verkennen