Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de endocrinologie en de neurowetenschappen, zoals ons onderzoek om de hersenreacties op endocriene signalen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat je de directe effecten van endocriene signalen op de hersenen kunt onderzoeken, gescheiden van andere weefsels. Om deze procedure te starten, gebruik je een pincet om de bodem van het midden van een plastic kweekschaal te krassen om een kuiltje te maken voor een gemakkelijkere montage van het ventrale ganglion van de larvale hersenen na de dissectie.

Plaats met een tandenstoker een kleine druppel superlijm aan weerszijden van de kuil en bevestig een wolfraamstaafje aan de lijm. Maak vervolgens met een klein stukje herbruikbaar plakmiddel een cirkelvormige muur rond de kuil. Om de larvale hersenen te dissekteren, verzamel 90 tot 120 uur na het leggen van de eieren larven en was ze minimaal drie keer met gedestilleerd water om voedselresten te verwijderen.

Leg vervolgens een larve op een vierkante glasplaat van anderhalve inch gevuld met ijskoud PBS. Gebruik een pincet om het middelste deel van de larve voorzichtig vast te grijpen. Gebruik een ander paar pincetten om voorzichtig aan de mondhaken te trekken om het voorste deel van de larve met de hersenen te scheiden van de rest van het lichaam.

Houd vervolgens het voorste uiteinde met de pincetten vast en draai de larve binnenstebuiten. Verwijder de overtollige weefsels die aan de hersenen zijn bevestigd, zoals imaginale schijven, vetlichamen en ringklier. Scheid voorzichtig de hersenen van de monddelen.

Breng vervolgens 200 microliter PBS aan aan de binnenkant van de eerder voorbereide kleefringen in de beeldvormingskamer. Zuig voorzichtig de gedissekteerde hersenen met PBS op in een Pasteur-pipet en breng ze over naar de beeldvormingskamer. Grijp in de beeldvormingskamer de spiervezels die zich uitstrekken van de ventrale ganglia en breng de hersenen voorzichtig in de kuil onder de wolfraamdraad.

Trek vervolgens de wolfraamdraad lichtjes omhoog om de hersenen op de juiste positie voor beeldvorming te plaatsen. Om calciumfluorescentiebeelden te verkrijgen, plaatst u de beeldvormingskamer met de hersenexaat onder de microscoop. Laat het objectief zakken tot het de PBS raakt en positioneer onder helder veldverlichting de hersenen en breng ze scherp.

Schakel over naar fluorescentielicht en pas de focus aan op de GCaMP-succes gelabelde cellen. Start de acquisitie bij 250 ms/frame, bij een resolutie van 512 x 512 pixels in watergekoelde modus. Pas vervolgens de belichtingstijd aan om de fluorescentiewaarden binnen het dynamische bereik van de CCD-camera te verkrijgen, maar niet lager dan 1000 willekeurige eenheden met 16-bits beelden.

Zodra de beeldvormingsparameters zijn bepaald, neemt u de beelden gedurende één minuut voor peptidetoediening om de basislijn signaalintensiteiten te detecteren. Breng vervolgens het testpeptide direct aan door 100 microliter van de bereide peptideoplossing in het larvale bad te pipetten. Registreer de GCaMP-succesemissie gedurende enkele minuten.

Om de gegevens te analyseren, opent u de analysesoftware en gebruikt u het eerste frame dat vóór peptidetoediening was als referentiebeeld. Selecteer vervolgens Plugins, TurboReg. Kies het seriële beeldbestand als de bron en het referentiebeeld als doelwit.

Controleer vervolgens Rigid Body en Accurate voor de verwerkingsmethode en kwaliteit, respectievelijk. Klik vervolgens op Batch om met beeldverwerking te beginnen. Selecteer meerdere interessegebieden door Analyze, Tools, ROI Manager in het beeldlade te gebruiken.

Meet vervolgens de pixelintensiteit door op Meer, Multi Meet, OK te klikken in het ROI Manager-venster. In dit experiment werd Wild type-hersenen blootgesteld aan CCHa2, Ghrelin en Nociceptin, terwijl CCHa2-receptormutante hersenen werden blootgesteld aan CCHa2. GCaMP6-signalen in insulineproducerende cellen werden gedetecteerd door confocale microscopie bij 250 ms/frame, en hier zijn de stilstaande beelden van geselecteerde tijdstippen.

De verhouding van de verandering van de ROI-intensiteit tot de basislijn signaalintensiteit op elk tijdstip werd geplot. ROI's werden ingesteld op cellichamen die in hetzelfde brandpuntsvlak werden gedetecteerd. De doorlopende lijnen geven het gemiddelde van vijf tot 10 steekproeven aan, en de stippellijnen markeren de bovenste en onderste grenzen van de standaardfout van het gemiddelde.

De geschaduwde gebieden geven de variatie van de signalen in de experimenten aan. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd, als deze goed wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het hersenmonster snel moet worden voorbereid om schade te voorkomen.

Deze procedure kan worden gecombineerd met genetica om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals over receptorspecificiteit. Het systeem dat in dit protocol wordt gebruikt, is eenvoudig te bereiden en herbruikbaar. Dit protocol zal dus nuttig zijn voor, bijvoorbeeld screenings.

Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van de endocrinologie en neurowetenschappen om hormonale netwerken te onderzoeken die de hersenfunctie bij Drosophila regelen.