Name: Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode voor 3D-reconstructie van de Caenorhabditis elegans germline om kernen, eiwitten en cytoskelet te analyseren. Deze techniek vermindert analyse tijd en menselijke fouten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Monash Microimaging voor hun technische ondersteuning. Sommige stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Dit werk werd ondersteund door een Monash University biogeneeskunde Discovery Fellowship NHMRC projectsubsidie (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) en veski innovatie fellowship: VIF 23 tot en met Roger Pocock.

1. voorbereiding en Worm veehouderij
Opmerking: Raadpleeg Tabel van materialen voor alle productinformatie.
<ol><li>OP50 Escherichia coli cultuur: cultuur van OP50 bacteriën in lysogenie Bouillon (LB) (1% trypton gist van 0,5%, 0,5% NaCl, pH 7,0) 's nachts bij 37 ° C zonder antibiotica.</li>
	<li>Zaad van 400 µL van OP50 bacteriën aan nematode groei media (NGM) platen (1,5 g NaCl, 8,5 g agar, 1,25 g pepton, 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 mL van de 1 M MgSO4 en 25 mL van de 1 M KPO4 buffer) en lucht drogen de bacteriën voor 48 uur.</li>
	<li>Kies wormen op geplaatste NGM platen en Incubeer bij 15 ° C of 20 ° C.<ol>
<li>Voor de analyse van de volwassen hermafrodiete germline, kies weldoorvoede L4 wormen aan het bacteriële gazon en na een nacht bebroeden bij 20 ° C.</li>
		<li>Voor het scoren van sperma nummer in hermafrodieten, incubeer L4 wormen bij 20 ° C gedurende 12 uur totdat de wormen bij de L4/volwassene molt. Als u wilt synchroniseren de wormen naar het werkgebied L4, bereiden eieren door het plukken van volwassen wormen met een heleboel eieren in bleekwater oplossing (1 M NaOH en bleekmiddel in 1:1 verhouding). Laat de eieren uitkomen en pick L4 dieren ten behoeve van het experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teflon Microscoop dia's voor te bereiden door het plaatsen van 25 µL van poly-L-lysine oplossing op de dia en verspreiden de oplossing goed, met behulp van een pipet tip. Na het verwijderen van overtollige poly-L-lysine met papieren handdoek, kunt u de dia's te droge lucht en Incubeer de dia's bij 65 ° C gedurende 15-20 min.</li>
</ol>2. Germline dissectie en kleuring6,13
<ol><li>Ter plaatse 10 µL van 0,01% tetramisole (verdoving) op een 22 mm × 22 mm dekglaasje aan en pluk één - dag oud volwassen wormen erin.</li>
	<li>Ontleden van de worm aan de staart, als het wordt verdoofd met behulp van een injectiespuit (5 mL) en een naald (24 "x 1"), en ervoor te zorgen dat de germline niet is beschadigd. Opmerking: De dissectie moet worden uitgevoerd voordat de worm wordt volledig verlamd zodat de negatieve druk in de worm en de worm beweging steun het uitwerpen van de kiemcellen. Voor het scoren van sperma, moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om niet te beschadigen de spermatheca door de naald tijdens dissectie. Raak de germline met de naald met uitzondering van de dissectie-punt na de spermatheca. Als er in het compartiment germline breken of een lozing van de germline wordt waargenomen, moet de germline niet worden gebruikt voor analyse.</li>
	<li>De omgekeerde dekglaasje aan op een poly-L-lysine gecoate dia, houden de ontleed germline op de dia te plaatsen.</li>
	<li>Verwijder overtollige vocht onder het dekglaasje aan door het plaatsen van een toren van papier op een hoek van het dekglaasje aan en plaats de dia in vloeibare stikstof voor 1 min. snel het dekglaasje aan met behulp van een naald met de germlines op de dia verwijderen.</li>
	<li>Breng de dia's in methanol van-20 ° C voor 30-60 s in een kamer en incubeer gedurende 30 min. in vers bereide fixing oplossing (1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO4, 0.8 mM ethyleen glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra zuur (EGTA) en 3,7% paraformaldehyde) bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen van de dia's door in een cupje met 1 x PBS, pH 7.4 te plaatsen met 0,1% Tween-20 voor 10 min. Herhaal deze stap eenmaal.</li>
	<li>Blokkeren van de germlines met 30 µL van het blokkeren van de oplossing (30% van de geit serum bereid door toevoeging van 900 µL van geit serum in 1700 ÂµL van gedistilleerd H2O en 300 µL van 10 x PBS) in een vochtige kamer voorbereid door het plaatsen van natte papieren handdoek in een plastic doos bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Voeg 50 µL van REC-8 antilichaam oplossing bereid in 30% geit serum in een verhouding 1:300 aan elk monster. Na een nacht bebroeden bij 4° C.</li>
	<li>Wassen van de dia's door te plaatsen in een cupje met 1 x PBS met 0,1% Tween-20 voor 10 min. de stap eenmaal herhaald en verwijderen van de overtollige vloeistof door het plaatsen van een papieren handdoek op de hoek van de dia.</li>
	<li>Bereid secundair antilichaam-oplossing door het verdunnen van groene fluorophore (488 nm emissie golflengte) geconjugeerd secundair antilichaam (1:1000), phalloidin (actine vlek, 1:4000) en DAPI (DNA vlek, 1:4000) in 30% normale geit serum.</li>
	<li>50 µL van secundair antilichaam oplossing aan de dia toevoegt.</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen van de dia's tweemaal door te plaatsen in een cupje met 1 x PBS met 0,1% Tween-20 voor 10 min. veeg overtollige vocht.</li>
	<li>Voeg 30 µL van de vaststelling van de reagens in de dia verschijnt en plaats een 12 mm2 x 1,5 µm dekglaasje aan op bovenkant en dia's bij 4 ° C's nachts droog.</li>
</ol>3. confocale microscopie
<ol><li>Inschakelen van de confocal microscoop, lasers, resonant scanner en confocal microscoop software. De dia's met gekleurde germlines plaats op de dia houder boven de 63 X-doelstelling.</li>
	<li>Zoek een germline, focus op de bovenkant van de kiemcellen en markeren met behulp van de confocal microscoop software. Ook richten op de bodem van de kiemcellen en markeren om de totale germline dikte.</li>
	<li>Beeld de hele germline door het definiëren van de dikte van elk segment tot 0,5 µm. Mark de volledige germline en verwerving van start. Scan van elk segment 8 keer en de gemiddelden om beeldkwaliteit te verbeteren. De resonerende scanner toestaat snel scannen om te voorkomen dat bleken tijdens imaging. Als de Microscoop beschikt niet over een resonante scanner, verminderen het aantal scans naar vier te vermijden bleken.</li>
</ol>4. post Imaging analyse van kernen aantal en de verdeling
Opmerking: Raadpleeg aanvullende figuur 1 voor screenshots van de hulpmiddelen van de software en de knoppen gebruikt.
<ol><li>Importeer het image Imaris 8.4.1 of latere versies van de software.</li>
	<li>Mitotische regio, overgangszone, Meiotische regio, oöcyt regio en spermatheca van de germline definiëren door het identificeren van de nucleaire morfologie in elke regio.</li>
	<li>Gebruik de oppervlakte functieknop (aanvullende figuur 1A) van de software om te selecteren van de regio van belang.</li>
	<li>Automatische oppervlakte creatie wizard annuleert en handmatig tekenen de regio van belang bij het eerste en het laatste segment van de afbeelding van de drie-dimensionale stack.</li>
	<li>Klik op maken oppervlak. Opmerking: De software zal automatisch de stapels tussen de eerste en laatste stack ontwikkelen.</li>
	<li>Alle kanalen, behalve DAPI maskeren door te klikken op de knop van het masker kanaal (Aanvullende figuur 1B-C).</li>
	<li>Nucleaire grootte parameters met behulp van de plek functieknop (aanvullende figuur 1A) definiëren. Voor de mitotische regio, definieert u een XY-diameter van 2 µm terwijl Z diameter undefined. Definiëren voor het overgangsgebied, een diameter van 2 µm van XY en Z diameter als 1,5 µm. (aanvullende figuur 1 d). Opmerking: Problemen oplossen met de diameters volgens de vergroting en de specificaties van de Microscoop. Voor het huidige protocol, het doel gebruikt was 63 X en voorzien van een extra 1,70 keer vergroting tijdens imaging. Als de doelstelling, bijvoorbeeld 40 X verandert, moeten de diameters dienovereenkomstig worden gewijzigd. Oplossen van problemen moet worden uitgevoerd met wildtype germlines om vast te stellen van de juiste parameters. De mitotische regio voor een wild type germline arm heeft ongeveer 250 kernen. De diameter moet worden gewijzigd om deze waarde. Gebruik ten minste 15 germlines om te bepalen van de optimale waarde voor de diameter. Een soortgelijke benadering moet worden gebruikt voor het kalibreren van de overgangszone (150-170 kernen) en Meiotische regio (600-700 kernen).</li>
	<li>Het opsporen van plekken beperken door het definiëren van de minimumdrempel (aanvullende figuur 1E). Gebruik DAPI gekleurd wild type germlines om vast te stellen minimum drempel door verhoging van de drempel van de minimale driedimensionale weergave totdat de eerste plek buiten de germline verschijnt.</li>
	<li>Sla de afbeelding en het aantal kernen ophalen uit de tabel automatisch door de software gegenereerd. De beelden als TIF-bestanden exporteren.</li>
</ol>5. post Imaging analyse voor het scoren van sperma en aantal chromosomen
<ol><li>Driedimensionaal renderen uitvoeren door het selecteren van de spermatheca als de regio van belang. Wilt detecteren elke sperma, definieert u de plek diameter tussen 0,75 - 1.0 µm voor X en Y-as, terwijl Z diameter ongedefinieerd blijft. Gebruik de functieknoppen van de plekken zoals in aanvullende figuur 1.</li>
	<li>Aftrekken van de achtergrond door tikt achtergrond aftrekken vak en het gebruik van correctie achtergrondwaarden berekend door de software (aanvullende figuur 1 d). Opmerking: Imaris software picks hoge intensiteit punten eerst, dus het effect van de achtergrond is minimaal, zolang er is significant verschil tussen de regio van belang en de achtergrond. Een tweede methode is om handmatig de achtergrondcorrectie definiëren, in voorkomend geval waarden kan worden gegeven voor de achtergrond. Handmatige achtergrondcorrectie dient als de intensiteit van onafhankelijke steekproeven vergelijking moet.</li>
	<li>Aanpassen van de driedimensionale weergave drempel om te sporen alle DAPI gekleurd sperma in de spermatheca (aanvullende figuur 1E).</li>
	<li>Voor het tellen van chromosoom, bepalen de plek diameter < 0,75 µm voor X en Y-as voor het ontwikkelen van driedimensionale modellen.</li>
	<li>De afbeelding opslaan en exporteren als een TIF-bestand.</li>
</ol>6. post Imaging analyse voor Cytoskeletal reconstructie van de kiemcellen
<ol><li>Identificeren van de regio van belang in de kiemcellen en alle kanalen, behalve phalloidin te maskeren door te klikken op de knop masker kanalen .</li>
	<li>Definieer een oppervlakte detail van 0,25 µm met behulp van de oppervlakte functieknop (aanvullende figuur 1). Opmerking: Dit betekent dat elke 0,25 µm wordt weergegeven in drie-dimensionale modellen. Oppervlakte detail kunnen constant voor elke regio van de germline waar een driedimensionaal oppervlak model wordt gemaakt voor elke 0,25 µm. Echter, voor de regio van de oöcyt, oppervlakte detail kan worden verhoogd tot 0.35 - 0,5 µm vanwege de aanwezigheid van welomschreven actine vezels in deze regio.</li>
	<li>Aftrekken van de achtergrond door tikt achtergrond aftrekken vak en het gebruik van correctie achtergrondwaarden berekend door de software (aanvullende figuur 1 d).</li>
	<li>Driedimensionaal renderen drempel afhankelijk van de structuur die analyse (aanvullende figuur 1E) aanpassen.</li>
	<li>De ontwikkelde drie-dimensionale afbeelding opslaan en exporteren als een TIF-bestand.</li>
</ol>

<ol><li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+germ+line%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419785">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li>
<li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li>
<li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372(2014).</li>
<li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+sperm%2Foocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li>
<li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li>
<li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-3+and+control+of+the+mitosis%2Fmeiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li>
<li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li>
<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338(2012).</li>
<li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22872476">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li>
<li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li>
<li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-1%2C+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation%2C+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li>
<li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li>
<li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li>
<li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1%2C+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li>
<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li>
<li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li>
<li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li>
<li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S6K+links+cell+fate%2C+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li>
<li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Het doel van dit protocol is minder tijd nodig voor germline analyse te verbeteren van de nauwkeurigheid. Na standaard voorbereiding van ontleed germlines, wordt een driedimensionaal model van germline kernen bereid door computationele renderen. Terwijl het toestaan van de waarneming van germline kernen distributie in de ruimte, berekent driedimensionaal renderen het aantal kernen op specifieke regio's van de kiemcellen. De kritische aspect van onze methode is nauwkeurige definitie van grootte en vorm parameters van kern...

De instandhouding van de signalering trajecten met zoogdieren maakt C. elegans een uitstekend model voor het bestuderen van meerdere biologische processen1,2. In ons lab gebruiken we de C. elegans germline te bestuderen van de cel van de stam ontwikkeling, apoptosis en genexpressie. Terwijl de germline een driedimensionale structuur is, zijn veel studies twee dimensionale het tijdrovend en arbeidsintensief karakter van drie-dimensionale analyse. Het is zeer waarschijnlijk dat de twee-dimensionale analyse in vivo gebeurtenissen in de kiemcellen kan verkeerd. De volwassen hermafrodiet van C. elegans heeft twee germline armen, die elk een somatische distale tip-cel (DTC) die distale kiemcellen in een ongedifferentieerde staat3,4 onderhoudthuizen. Deze geslachtscellen beginnen te onderscheiden als ze verder weg van de DTC, ontsnappen aan haar invloed, en worden eicellen en sperma als ze het proximale einde van de germline bereikt. Tijdens dit proces ondergaan kiem celkernen mitose, vóór de overgang naar de meiose5,6. Productie van zaadcellen wordt gecompleteerd door larvale stadium 4 (L4) van de ontwikkeling, waarna eicellen worden geproduceerd tijdens de volwassenheid. De zaadcellen worden opgeslagen in de spermatheca waar ze eicellen bevruchten tot embryo's.
Er zijn meerdere genetische en ecologische factoren die invloed kunnen uitoefenen op germline ontwikkeling in C. elegans wat resulteert in veranderingen in het aantal kernen, aantal apoptotic evenementen, de dynamiek van het chromosoom, en eiwit expressie en/of lokalisatie7 ,8,9,10,11. De analyse van deze gebeurtenissen vereist de identificatie van elke fase van differentiatie op basis van nucleaire morfologie en distributie. Om deze parameters handmatig met de grootte van een grote steekproef nauwkeurig te analyseren is arbeidsintensief en tijdrovend. Om deze nadelen te omzeilen en om de consistentie van analyse, ontwikkelden we een automatische methode voor driedimensionale onderzoek van de C. elegans germline voor kernen tellen, kernen distributie, eiwit expressie, en cytoskeletal structuur. Door het combineren van confocale microscopie met driedimensionale rendering, we genereerden grootte en vorm parameters voor de identificatie van elk stadium van de kiem celdifferentiatie. Deze methode kan verder tellen van geslachtscellen kernen en sperma plus scoring van chromosoom nummer in elke oöcyt.
Een cruciale structuur in de kiemcellen is het cytoskelet, waarmee de stabiliteit germline compartiment aids cytoplasmatische streaming en bescherming tot germline kernen12. Met behulp van computationele rendering, we drie-dimensionale reconstructie van het cytoskelet germline uitgevoerd en afzonderlijke cytoskeletal functies binnen de germline geïdentificeerd. Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol om te illustreren hoe computationele analyse gecombineerd met confocal imaging maakt uitgebreide analyse van de C. elegans germline.
Wij stellen voor een snelle methode voor de drie-dimensionale analyse van C. elegans germline (Figuur 1). Met behulp van drie-dimensionale analyse, is het mogelijk om te studeren het driedimensionale distributie van germline kernen (Figuur 2 en Figuur 3), geautomatiseerde tellen van cellen (Figuur 2), reconstructie van het cytoskelet germline ( Figuur 3), distributie van eiwitten (Figuur 4), en het aantal zaadcellen in de spermatheca en chromosomen in eicellen (Figuur 5) scoren. De methode kan niet alleen gemakkelijk en nauwkeurig kwantificering van de germline maar identificeert fysiologisch relevante fenotypen.

<table><tbody><tr><td>C. elegans stammen: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli bacteriën</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nematodengroeimedia (NGM) platen</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaal konijn anti-REC-8&nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 geconjugeerd antilichaam vervaardigd in geit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Cytoskeletaal kleurmiddel phalloidin&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES buffer, pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% Paraformaldehyde-oplossing</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield fixeermiddel&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&deg;C &amp; 25&deg;C Incubatiekast&nbsp;</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop&nbsp;&nbsp;</td><td>Elk merk (Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer uitgerust met Imaris suit 8.4.1 of latere versie, volledige licentie om de software en Matlab-software te gebruiken.</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon microscoopglaasjes&nbsp;</td><td>Tekdon&nbsp;</td><td>&nbsp;941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

computationele analyse van de caenorhabditis elegans germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

De germline Caenorhabditis elegans (C. elegans) wordt gebruikt om verschillende biologisch belangrijke processen, met inbegrip van de cel van de stam ontwikkeling, apoptosis en chromosoom dynamiek te bestuderen. Terwijl de germline een uitstekend model is, is de analyse vaak twee dimensionale als gevolg van de tijd en de arbeid die nodig is voor de drie-dimensionale analyse. Grote uitlezingen in dergelijke studies zijn de nummer/positie van kernen en eiwit spreiding in de kiemcellen. Hier presenteren we een methode voor het uitvoeren van de geautomatiseerde analyse van de confocal microscopie en computationele benaderingen gebruiken om te bepalen van het aantal en de positie van de kernen in elke regio van de germline germline. Onze methode analyseert ook germline eiwit distributie waarmee het driedimensionale onderzoek van eiwituitdrukking in verschillende genetische achtergronden. Onze studie toont verder variaties in cytoskeletal architectuur in verschillende regio's van de germline die rekening met specifieke eisen voor ruimtelijke ontwikkeling houden kan. Tot slot, onze methode kunt geautomatiseerde tellen van de zaadcellen in de spermatheca van elke germline. Tezamen, maakt onze methode een snelle en reproduceerbare fenotypische analyse van de C. elegans germline.

Figuur 1 geeft aan dat de tijd die nodig is voor driedimensionale germline analyse. L4 hermafrodieten bij 20 ° C geïncubeerd waren ontleed om te isoleren van de germlines en gekleurd met DAPI, phalloidin en antilichamen tegen germline proteïnen. Germlines zijn beeld met behulp van de confocal microscopie. Kleuring en confocal microscopie vereist ongeveer 24 h. computationele analyse voor de volledige germline 10-15 min vereist te tellen van het aantal en de p...

We presenteren een geautomatiseerde methode voor driedimensionale wederopbouw van de Caenorhabditis elegans germline. Onze methode bepaalt het aantal en de positie van elke kern binnen de kiemcellen en analyses germline eiwit distributie en cytoskeletal structuur.

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Het algemene doel van deze methode is om de analyse van een Caenorhabditis elegans kiemcellen te automatiseren om zijn kernen, eiwitten en cytoskeletaalverdeling te bestuderen. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het C.Elegans veld te beantwoorden over het aantal kernen en sperma, kernverdeling en cytoskeletaalstructuur van de kiemcellen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de analysetijd verkort, de steekproefomvang verhoogt en de menselijke fout elimineert die geassocieerd is met de handmatige analyse.Om de monsters af te beelden, plaatst u dia's met gekleurde kiemcellen in de diahouder boven het 63X objectief van een confocale microscoop en lokaliseert u een kiemcel. Richt u op de bovenkant van de kiemcel en markeert u deze met de confocale microscoopsoftware. Wanneer de totale dikte van de kiemcel is vastgesteld, definieert u de dikte van elke plak tot 0,5 micrometer en markeert u de volledige kiemcel.Start vervolgens de acquisitie, scant elke plak acht keer en breekt de waarden gemiddeld af om de beeldkwaliteit te verbeteren. Wanneer alle beelden zijn verkregen, importeert u de beelden naar een geschikt beeldanalysesoftwareprogramma en g

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de...

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

We presenteren een immunofluorescentie-imaging methode voor ruimtelijke en temporele lokalisatie van actieve ERK in de ontleed C. elegans gonade. De hier beschreven protocol kan worden aangepast voor visualisatie van elke signalering of structurele eiwit in het C. elegans gonade, mits een geschikt antilichaam reagens beschikbaar is.

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.

Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Dit is een veelgebruikte methode voor C. elegans gonad-dissectie gevolgd door vriesscheur, die kiembaanmonsters produceert voor immunofluorescentie via antilichaamkleuring, of voor eenvoudige DAPI-kleuring om DNA te visualiseren. Dit protocol is succesvol geweest voor studenten in een onderzoekslaboratorium en in een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring.

C. elegans Gonad dissectie en freeze crack voor immunofluorescentie en DAPI-kleuring

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

Leer een geautomatiseerde methode voor 3D-reconstructie van de Caenorhabditis elegans germline om kernen, eiwitten en cytoskelet te analyseren. Deze techniek vermindert analyse tijd en menselijke fouten.

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet (Video) | JoVE Journal

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

Meer video's verkennen