Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet
19 april 2018
We presenteren een geautomatiseerde methode voor driedimensionale wederopbouw van de Caenorhabditis elegans germline. Onze methode bepaalt het aantal en de positie van elke kern binnen de kiemcellen en analyses germline eiwit distributie en cytoskeletal structuur.
Het algemene doel van deze methode is om de analyse van een Caenorhabditis elegans kiemcellen te automatiseren om zijn kernen, eiwitten en cytoskeletaalverdeling te bestuderen. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het C.Elegans veld te beantwoorden over het aantal kernen en sperma, kernverdeling en cytoskeletaalstructuur van de kiemcellen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de analysetijd verkort, de steekproefomvang verhoogt en de menselijke fout elimineert die geassocieerd is met de handmatige analyse.
Om de monsters af te beelden, plaatst u dia's met gekleurde kiemcellen in de diahouder boven het 63X objectief van een confocale microscoop en lokaliseert u een kiemcel. Richt u op de bovenkant van de kiemcel en markeert u deze met de confocale microscoopsoftware. Wanneer de totale dikte van de kiemcel is vastgesteld, definieert u de dikte van elke plak tot 0,5 micrometer en markeert u de volledige kiemcel.
Start vervolgens de acquisitie, scant elke plak acht keer en breekt de waarden gemiddeld af om de beeldkwaliteit te verbeteren. Wanneer alle beelden zijn verkregen, importeert u de beelden naar een geschikt beeldanalysesoftwareprogramma en gebruikt u de oppervlaktefunctietool om het mitotische gebied te selecteren. Een afbeelding van het distale uiteinde van de kiemcel zal verschijnen.
Annuleer de automatische oppervlaktecreatiewizard en teken handmatig een gebied van belang rond het mitotische gebied op de eerste en laatste plakken van het beeld van de driedimensionale stapel. Klik op Oppervlak maken, gevolgd door Maskerkanaal, om alle kanalen te maskeren behalve het DAPI-kanaal. Gebruik de spotfunctietool om de grootteparameters van het mitotische gebied te definiëren met een XY-diameter van twee micrometer en met de Z-diameter ongedefinieerd.
Klik op achtergrond aftrekken om de achtergrond af te trekken. Om de minimale drempel te definiëren, verhoogt u de minimale 3D-renderingdrempel op een DAPI-gekleurde wild-type kiemcel totdat de eerste spot buiten de kiemcel verschijnt en genereert u een 3D-model voor elk gebied. Na het opslaan van de beelden, klikt u op tabel om het aantal kernen te bekijken, zoals automatisch gegenereerd door de software, en exporteert u de beelden als TIFF-bestanden.
Voor de overgangszone creëert u een oppervlak zoals eerder uitgelegd. Klik vervolgens op Maskerkanaal om alle kanalen te maskeren behalve het DAPI-kanaal. Gebruik de spotfunctie om een XY-diameter van twee micrometer en Z-diameter van 1,5 micrometer te definiëren en klik op achtergrond aftrekken om de achtergrond af te trekken.
Om de minimale drempel te definiëren, verhoogt u de minimale 3D-renderingdrempel op een DAPI-gekleurde wild-type kiemcel totdat de eerste spot buiten de kiemcel verschijnt en genereert u een 3D-model voor elk gebied. Na het opslaan van de beelden, klikt u op tabel om het aantal kernen te bekijken, zoals automatisch gegenereerd door de software, en exporteert u de beelden als TIFF-bestanden. Voor het scoren van het aantal sperma selecteert u de spermatheca als het gebied van belang, zoals gedemonstreerd voor de kerngebieden, en gebruikt u de spotfunctietool om de XY-diameter tussen 0,75 en één micrometer te definiëren met een ongedefinieerde Z-diameter om elk sperma te detecteren.
Selecteer het vakje Achtergrond aftrekken en gebruik de door de software berekende achtergrondcorrectiewaarden om de achtergrond af te trekken. Pas vervolgens de 3D-renderingdrempel aan om alle DAPI-gekleurde sperma in de spermatheca te detecteren. Voor chromosoomtelling in de eicellen, selecteert u de eicellen en definieert u de XY-diameter als minder dan 0,75 micrometer en definieert u de drempel voordat u de 3D-modellen ontwikkelt.
Bewaar vervolgens de beelden voor export als TIFF-bestanden. Voor cytoskeletaal kiemcelreconstructie identificeert u het mitotische gebied van belang in de kiemcel en creëert u een oppervlaktemasker zoals eerder gedemonstreerd. Klik op Maskerkanalen om alle kanalen te maskeren behalve het phalloidin-kanaal en gebruik de oppervlaktefunctietool om een oppervlaktedetail van 0,25 micrometer te definiëren.
Na het aftrekken van de achtergrond, past u de 3D-renderingdrempel aan om de ontwikkelde 3D-afbeelding op te slaan voor export als een TIFF-bestand. De kernverdeling is afhankelijk van het differentiatiefase. Bijvoorbeeld, in het mitotische gebied, verschijnt de binnenste actine als een massieve massa waarop de kernen zijn georganiseerd.
In een wild-type kiemcel bevat het mitotische gebied ongeveer 250 kernen en is het stevig gevuld met kernen vergeleken met de rest van de kiemcel. Terwijl de kernen zich echter van het distale uiteinde verwijderen, lijken ze dichter bij de omtrek van de kiemcel te liggen, waarbij de verandering in verdeling begint bij de overgangszone en eindigt als de kernen de derde fase van profase in meiose binnengaan. Bij de overgangszone neemt de binnenste actine van de kiemcel een meer cilindrische structuur aan en wordt een holle cilinder wanneer het de pachyteen bereikt.
De tweede actinelaag bedekt de binnenste laag en geeft vorm aan de kiemcel. Deze cilinder binnen een cilinder actinestructuur verdwijnt richting de eicelregio, waarbij de actine verschijnt als dikke vezels die de eicellen bedekken. In de spermatheca vormt de actine zich ook tot dikke bundels van vezels, hoewel deze vezels strakker lijken te zijn verpakt dan in de eicelregio.
Driedimensionale weergave van het proximale uiteinde van de kiemcel, zoals gedemonstreerd, onthult een gemiddelde van 151 sperma in elke spermatheca. Zodra deze analyse is beheerst, kan deze in 10 minuten per kiemcel worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de analyseparameters te definiëren volgens de vergroting van het objectief dat wordt gebruikt om de kiemcel in uw experiment te visualiseren.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een automatische analyse van een kiemcel kunt uitvoeren en cytos
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een geautomatiseerde methode voor de driedimensionale reconstructie van de kiemlijn van Caenorhabditis elegans, met de nadruk op de analyse van kernen, eiwitdistributie en cytoskeletstructuur. De methode is erop gericht de efficiëntie en nauwkeurigheid van de kiemlijnanalyse te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de structuur van de kiemlijn van C. elegans is cruciaal voor ontwikkelingsstudies.
- Handmatige analyse van kiemlijnmonsters is tijdrovend en foutgevoelig.
- Geautomatiseerde methoden kunnen dit proces stroomlijnen.
- Eerdere technieken waren onvoldoende efficiënt bij het analyseren van grote steekproefomvangen.
Doel van de studie
- Om de analyse van de kiemlijn van C. elegans te automatiseren.
- Om het aantal en de positie van kernen nauwkeurig te bepalen.
- Om de eiwitdistributie en de cytoskeletstructuur te analyseren.
Gebruikte methoden
- Monsters worden gekleurd en op objectglazen geplaatst voor beeldvorming.
- Objectglazen worden gepositioneerd boven een 63X objectief van een confocale microscoop.
- De kiemlijn wordt gelokaliseerd en gemarkeerd met behulp van confocale software.
- De dikte van de kiemlijn wordt gedefinieerd en opgedeeld in secties van 0,5 micrometer.
Belangrijkste resultaten
- De methode reduceert de analysetijd aanzienlijk.
- Het vergroot de hoeveelheid monsters die geanalyseerd kan worden.
- Menselijke fouten die gepaard gaan met handmatige analyse worden geminimaliseerd.
- Er wordt een nauwkeurige mapping van kernen en eiwitdistributie bereikt.
Conclusies
- Deze geautomatiseerde methode verbetert de bestudering van de kiemlijn van C. elegans.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor het analyseren van complexe biologische structuren.
- De techniek kan toekomstig onderzoek in de ontwikkelingsbiologie faciliteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Geautomatiseerde driedimensionale analyse van de kiemlijn van C. elegans maakt high-throughput fenotypische screening mogelijk voor doelwitvalidatie en mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Door de distributie van kernen, eiwitlokalisatie en de architectuur van het cytoskelet te kwantificeren, biedt deze methode voorspellend vertrouwen in genetische en farmacologische interventies. Deze aanpak vermindert handmatige variabiliteit en verhoogt de reproduceerbaarheid, wat de schaalbare ontwikkeling van assays voor ziekterelevante systemen faciliteert.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door kwantitatieve mapping van kernpositionering en eiwitexpressiepatronen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door reproduceerbare read-outs van de kiemlijnarchitectuur over verschillende genetische achtergronden te verschaffen.
- Predictieve waarde: Verbetert de validatie van targets door cytoskeletale veranderingen te correleren met ontwikkelingsfenotypes, wat helpt bij de identificatie van lead-compounds.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor de telling van kernen, het aantal spermatozoïden en de cytoskeletstructuur om betrouwbare screening van verbindingen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verhoogt de doorvoer en reproduceerbaarheid van de assay door geautomatiseerde beeldacquisitie en -analyse, waardoor handmatige bias wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de preparatie van gevalideerde kiemlijnmodellen voor downstream-workflows in fenotypische screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt systeemmodellering van ziekte-relevante processen mogelijk door kiemlijnstructurele veranderingen te koppelen aan functionele uitkomsten in stamcelontwikkeling en apoptose.
- Mechanische risicoreductie: Biedt inzicht in ruimtelijke ontwikkelingsvereisten via analyse van de cytoskeletarchitectuur, wat bijdraagt aan de verfijning van preklinische modellen.
- Risicogebaseerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door consistente, drempelwaarde-gebaseerde fenotypische read-outs te leveren over verschillende experimentele condities heen.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische beoordeling, door het leveren van gestandaardiseerde, kwantificeerbare kiemlijnfenotypes.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests en het verduidelijken van signaalpaden door 3D-visualisatie van de nucleaire en eiwitdistributie in verschillende kiemlijnregio's mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door geautomatiseerde, reproduceerbare kwantificering van kernen en sperma, waardoor een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk wordt.
- Analytics: Genereert statistische outputs, zoals nucleaire dichtheid en metrieken voor de cytoskeletale architectuur, die vergelijkingen tussen condities en de selectie van hits mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische continuïteit door structurele fenotypes van de kiemlijn te koppelen aan stamceldynamiek en meiotische progressie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform dat toepasbaar is op meerdere genetische achtergronden en experimentele paradigma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door objectieve, 3D-gebaseerde kwantificering van de architectuur van de kiemlijn, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door menselijke fouten te minimaliseren en snelle analyse mogelijk te maken (10 minuten per kiemlijn).
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de steekproefomvang te vergroten en go/no-go-beslissingen in targetvalidatie-pipelines te versnellen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering mogelijk door reproduceerbare fenotypische gegevens te leveren voor de evaluatie van lead-verbindingen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie en 3D-beeldanalyse-software voor nauwkeurige segmentatie van de kiemlijn en het instellen van drempelwaarden.
- Afhankelijk van toegang tot een confocale microscoop met een 63X objectief en fluorescentiekleuringmogelijkheden voor DAPI, phalloïdine en eiwitdoelen.
- Noodzaak tot cross-team standaardisatie van parameters voor beeldacquisitie (plakdikte, middeling, achtergrondaftrekking) om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Vereist aanpassing van de definities van het interessegebied (region-of-interest) en de parameters van de spotfunctie bij toepassing op verschillende genetische achtergronden of kleuringsprotocollen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van geoptimaliseerde kleurings- en montageprotocollen om de structuur van de kiemlijn te behouden voor een nauwkeurige 3D-reconstructie.
