Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de combinatorische techniek van het microfluïde systeem en het moleculaire biotechnologieveld, zoals microfluïde apparaten en asymmetrie-PCR-methode. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het efficiënt genereren van sterk gehomogeniseerde microsferen en de productie van enkelstrengs DNA zonder extra scheidingsstappen. De implicaties van deze techniek breiden zich uit naar de diagnose of therapie van verschillende ziekten.

Omdat het genereren van single-streng DNA de sleutel is voor ap-ta-mo-sis tests, kan het worden gebruikt voor detectie en behandeling. Hoewel deze methode inzicht kan geven in driedimensionaal microfluïdisch systeem in MEMS, kan het ook worden toegepast op andere systemen die worden gebruikt voor detectie en behandeling van ziekten. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal moeite hebben om goed te controleren vloeistoffen uit stroomt in de omgekeerde richting.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang om de microsfeervorming in de flow-focus geometrie en stolling van gegenereerde microsferen te observeren. Bereid eerst 20 milliliter vloeibaar PDMS-voorpomeer voor door basispolymeer en katalysator te mengen in een verhouding van 10 op één. Giet 10 milliliter van de vloeibare PDMS op een voorbereide SU-8 mal op een siliciumwafer voor het bovenste deel van het microfluïde netwerk.

Voor het onderste vlakke deel, giet hetzelfde volume van vloeibare PDMS op het silicium wafer zonder een schimmelstructuur. Plaats twee siliciumwafers bedekt met vloeibare PDMS voorpomeer op een voorverwarmde kookplaat en genezen op 75 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na deze, handmatig afpellen van de genezen PDMS laag van de SU-8 mal.

Lijn een rond gatpons met een diameter van 1,5 millimeter uit op de oliepoort van het gerepliceerde microfluïde netwerk voor het interfacing van micron-schaal stroomkanalen met de macrovloeistoffenmonsters. Dan handmatig punch uit de door-gat. Na het herhalen van het ponsproces drie keer, uitvoeren hydrofiele oppervlakte behandeling op zowel de bovenste en onderste PDMS lagen met behulp van een handheld corona treater voor enkele seconden per monster.

Stapel twee met plasma behandelde PDMS-lagen en verwarm gedurende 30 minuten op een kookplaat op een kookplaat voor het PDMS-naar-PDMS-bindingsproces. Vortex en kort centrifugeren een standaard single-stranded DNA acrydite-label sonde en een 19-op-een acrylamide bis voorraad oplossing. Bereid oplossing een door het mengen van 25 microliters van 40% acrylamide bis oplossing, 10 microliter van enkelstrengs DNA, 10 microliter van 5X TBE buffer, en vijf microliter water.

Bereid oplossing twee met 50 microliter van 20% ammonium persulfaat. Bereid twee spuiten individueel gevuld met oplossing een en oplossing twee en monteer ze op de spuitpomp om oplossingsstromen in het microfluïde platform te introduceren. Bereid minerale olie gemengd met 0,4%TEMED voor oppervlaktevastheid van de microsfeer.

Na het vullen van een glazen fles met de minerale olie, steek twee buizen aan de pneumatische en vloeibare poorten in de dop van de glazen fles als een microfluïde reservoir. Sluit buizen aan tussen de glazen fles en de oliepoort in het microfluidic apparaat. Sluit de buizen aan op de twee oplossingspoorten in het microfluïde apparaat om de twee oplossingen van de spuitpompen te leveren.

Steek vervolgens de buizen in de uitlaatpoort om de gegenereerde microsfeer in het bekerglas over te brengen. Stel vervolgens de stroomsnelheid van de spuitpomp in op 0,4 tot 0,7 milliliter per uur. Pas de persluchtdruk van de compressor aan met behulp van een regelaar.

Plaats een glazen beker met magnetische roerstaaf op een kookplaat en stel de rotatiesnelheid in. Bedien de spuitpomp en lever de perslucht die door een externe compressor wordt gegenereerd in de glazen fles met behulp van de aan-uit-controle van een elektromagnetische klep. Met behulp van een digitale microscoop, observeren de vorming van microsferen in de stroom-focus geometrie en stolling van gegenereerde microsferen in het glas bekerglas.

Het observeren van de vorming van microsferen is een van de meest kritieke stappen, omdat het een belangrijk proces in deze studie om microsferen en microfluïde systeem te produceren. Breng hierna 100 microliter van de microsferen over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Verwijder vervolgens de supernatant door middel van zachte centrifuging en pipetting.

Resuspend de gratis sonde-gemodificeerde cyanine-3 met behulp van 100 microliters van 1X TE buffer om een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar te bereiken. Voeg vervolgens 100 micromolar van complementaire sonde-gemodificeerde cyanine-3 toe aan een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met AP gecopolymeriseerde microsferen. Tik een paar keer op de buis om een uur lang te mengen en uit te broeden bij kamertemperatuur in het donker.

Na incubatie, gooi de supernatant en verwijder de resterende buffer door pipetting. Spoel vervolgens drie keer met 500 microliters TE-buffer. Plaats de microsferen op een glazen schuif van 75 bij 50 millimeter en bedek met aluminiumfolie voorafgaand aan de beeldvorming.

Verkrijg ongeveer 25 microsferen door microscopisch tellen met behulp van een lichtmicroscoop met 40x vergroting. Combineer hierna alle reagentia zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de monsters in een thermocycler en start de asymmetrische PCR onder de juiste omstandigheden.

De verzameling van een supernatant na asymmetrische PCR is een van de meest kritieke stap, omdat het een belangrijk proces is voor het genereren van single-streng DNA met microsfeer. Voeg na versterking acht microliters van 6X-laadbuffer toe aan elk monster. Laad 15 microliter van elk monster in 2%agarose gel.

Voer vervolgens elektroforese uit op 100 volt gedurende 35 minuten in 1X TAE buffer. Plaats de gehybride microsferen in een houder en bevestig de houder aan het stadium van een confocale microscoop. Selecteer de laser en zet deze in de laserbesturing in.

Selecteer de objectieve lens in de microscoopbediening. Selecteer vervolgens het gewenste filter voor cyanine-3 en kanaal in het configuratiebesturingselement. Begin ten slotte met het experiment en observeer het monster.

Het gefabriceerde polymeerdruppelgebaseerde microfluïde platform bestaat uit twee PDMS-lagen. Drie soorten microfluïde kanaalnetwerken worden gebruikt voor het genereren van microsferen, die flow-focus geometrie, een serpentine kanaal voor het mengen van oplossingen een en twee, en een polymerisatie kanaal voor microsfeer stolling. Een lab-gebaseerde pneumatische controlesysteem voor continue stroom van de minerale olie en twee spuit pompen voor de oplossing stroom werden gebruikt voor het genereren van microsferen in de microfluïde platform.

Als de microsferen correct zijn gefunctionaliseerd met de vijf-prime acrydite DNA-sonde, moeten ze resulteren in dekking van fluorescerende activiteit op het oppervlak tijdens de hybridisatie experiment zoals getoond in deze fluorescerende beelden. Als copolymerisatie niet correct optreedt, zou het optische microsfeerbeeld interne verontreiniging in de microsferen vertonen. Het manipuleren van het 3D-oppervlak van microsferen met een DNA-oligo-sonde is een veel sneller proces en een on-flow microsfeersyntheseplatform kan een hulpmiddel bieden voor enkelstrengse DNA-versterking en -zuivering.

De aanvankelijk gecopolymeriseerde vijf-priemgetal AP biedt een drie-prime hydroxyl einde voor DNA polymerisatie na annealing aan de complementaire sjabloon. Dubbelstrengs DNA-verontreinigingen werden waargenomen in het asymmetrische PCR-experiment. Het resulterende enkelstrengse DNA dat zich ophoopt uit microsfeer-PCR werd aangetoond in vergelijking met de synthetische groottemarkers door middel van gelelektroforeseanalyse.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat voorkennis van protocollen en aanpassingen die vaak nodig zijn voor het optimaliseren van PCR-experimenten nodig zijn voor het verkrijgen van de versterkingscyclus, annealing temperatuur, en sonde sequentie in deze methode. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van diagnose en therapie om twee regio's in moleculaire biotechnologie en biogeneeskunde met elkaar te verbinden. Vergeet niet dat het werken met acrylamide oplossing kan gevaarlijk zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en lab jassen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.