Name: Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Leer een druppelgebaseerde microfluidische methode voor microsfeer-PCR-versterking om enkelstrengs-DNA te produceren zonder scheiding. Deze techniek ondersteunt diagnostische en therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie wordt ondersteund door een project getiteld "coöperatieve onderzoeksprogramma voor landbouw Science & Technology Development (Project nr. PJ0011642) "gefinancierd door de landelijke ontwikkeling administratie, Republiek Korea. Dit onderzoek werd ook deels gesteund door een subsidie (NRF-2017R1A2B4012253) van de fundamentele wetenschap Research Program door de National Research Foundation (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT & toekomst Planning, Republiek Korea. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie (N0000717) van het onderwijs-programma voor creatieve en industriële convergentie gefinancierd door het ministerie van handel, industrie en energie, Zuid-Korea.

1. fabricage van een PDMS Microfluidic Platform
<ol><li>Bereid 20 mL vloeibare PDMS prepolymeren door het mengen van de basis polymeer en katalysator in een volumeverhouding van 10:1. Giet 10 mL van de vloeistof PDMS op een schimmel SU-8 bereid op een silicium wafer voor het bovenste deel van het microfluidic netwerk. Voor het onderste gedeelte plat, giet u dezelfde hoeveelheid vloeibare PDMS op het silicium wafer zonder de structuur van een schimmel. Opmerking: Het microfluidic-netwerk is ontworpen in een CAD-programma en vervolgens omgezet in een photomask om het fabriceren van een model met behulp van de typische fotolithografie proces (Zie Aanvullende cijfers). Dit model bestaat uit de negatieve fotoresist SU-8 schimmel op de silicium wafer11.</li>
	<li>Plaats twee silicium wafers bekleed met vloeibare PDMS prepolymeren op de hete plaat en uitharding bij 75 ° C gedurende 30 minuten.<ol>
<li>Handmatig naar de uitgeharde laag van het PDMS van de SU-8 mal afschilferen. Hiermee lijnt u een diameter van 1,5 mm ronde hole punching gereedschap op de poort van de olie van de gerepliceerde microfluidic netwerk voor interfacing micron-schaal stroom kanalen met de macro vloeistof monsters. Punch handmatig uit het via-gat.</li>
		<li>Herhaal dit proces drie keer voor de vorming van de twee oplossingen en de retourzijde ponsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hydrofiele oppervlaktebehandeling uitvoeren op zowel de bovenste en de onderste PDMS lagen met behulp van een hand-held corona treater12 gedurende enkele seconden per monster.<ol>
<li>Stapel twee plasma-behandelde PDMS lagen en warmte bij 90 ° C gedurende 30 minuten met behulp van een warmhoudplaat voor het PDMS-naar-PDMS hechting proces. De hydrofoor watervoorziening met behulp van de spuitpomp op drie inlaat poorten voor de structurele lijmen en lekken testen van het gefabriceerde apparaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. productie van Polyacrylamide Oligo-microsferen
<ol><li>Bereiden kraal-mengsel gedetailleerd in tabel 1.</li>
	<li>Vortex en kort centrifuge de standaard ssDNA acrydite label sonde (Ap, 100 μM) en acrylamide:bis (19:1) stamoplossing.</li>
	<li>Bereid oplossing ik door het mengen van 25 μL van 40% acrylamide bis oplossing, 10 μL van ssDNA (acrydite sonde), 10 μL van 5 x TBE buffer (900 mM boraat, 1.1 M Tris; 25 mM EDTA) en 5 μL van water. Bereid met 50 μl van 20% ammoniumnitraat persulfate-oplossing II.</li>
	<li>Twee opstellen spuiten individueel gevuld met oplossing ik en oplossing II, en mount ze op de pomp in te voeren oplossing stromen in het microfluidic platform. Bereiden van minerale olie gemengd met 0,4% TEMED voor oppervlakte stollen van de microsfeer. Opmerking: TEMED is bekend als een vrije radicalen stabilisator. Vrije radicalen kunnen versnellen het tempo van de polymeer formatie met ammonium persulfate (APS) om te katalyseren acrylamide polymerisatie.</li>
	<li>Vul een glazen fles met 4 mL van de minerale olie voor het genereren van een continue stroom.</li>
	<li>Invoegen van twee buizen naar twee poorten in de dop van de fles als een reservoir van de microfluidic: de pneumatische poort voor de toepassing van de samengeperste lucht in de fles van de luchtcompressor en de vloeistof haven voor de aardolievoorziening van de onder druk staande aan de micro channel-netwerk uit de fles. Verbinding buizen tussen de fles en de poort van de olie in het microfluidic-apparaat.<ol>
<li>De buizen verbinden met de oplossing van de twee havens in het microfluidic-apparaat om de twee oplossingen van de injectiespuit pompen. Invoegen buizen naar de retourzijde wilt overbrengen, moet de gegenereerde microsfeer af in het bekerglas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel het debiet van de spuitpomp op 0,4 - 0,7 mL/h. aanpassen samengeperste luchtdruk van de compressor met een regulator (82-116 kPa). Stel de draaisnelheid (500 rpm) van de magneetroerder bar in het bekerglas van het glas op een hete plaat. De spuitpomp bedienen en leveren de samengeperste lucht gegenereerd door een externe compressor in de glazen fles met behulp van de ON/OFF controle van een elektromagnetische klep13.</li>
	<li>Observeer de vorming van microbolletjes in de stroom-focusing geometrie en stollen van gegenereerde microbolletjes in het bekerglas van glas met een digitale Microscoop. Opmerking: De snelheid van het formaat en de productie van de microsfeer hangt het debiet van oplossingen en de druk toegepast voor de minerale olie-stroom (tabel 2).
</li>
</ol>3. uitvoeren van Polyacrylamide Oligo-microsferen telt
<ol><li>Voor hemocytometer de kwantificering, nemen een kleine hoeveelheid (ongeveer 100 μl) van waterige oplossing van polyacrylamide oligo-microsferen en plaats op de hemocytometer van het glas, en zachtjes Vul de opschorting van de microsfeer het goed van de tellen kamer. Opmerking: Voor nadere bijzonderheden, zie http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.</li>
	<li>Gebruik een microscoop en hand tally teller wilt tellen microbolletjes in één set van 16 vierkantjes. Vervolgens plaatst u de hemocytometer met de volgende reeks van de kamer en voort tellen totdat alle vier sets van 16 hoeken worden geteld.</li>
	<li>Bepalen van de gemiddelde microsfeer telling en bereken het aantal microbolletjes in de originele kraal suspensie.</li>
	<li>100 μl van microsferen overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Verwijder het supernatant via zachte centrifugeren (400 x g) en pipetteren.</li>
</ol>4. het uitvoeren van DNA hybridisatie op het oppervlak van Polyacrylamide Oligomicrosphere
Opmerking: Een identiek DNA sonde met een 5'-NH2-groep in plaats van 5'-acrytide wijziging wordt toegevoegd in de oplossing die ik en getest voor Ap-bevattende microbolletjes in parallel. DNA hybridisatie resultaten worden weergegeven in Figuur 2. De oplossing van Cy3-geëtiketteerden complementaire oligonucleotide sondes (GLB) moet worden geplaatst in een donkere kamer.
<ol><li>Resuspendeer Cy3-cAp met 100 μl van 1xTE buffer (TE buffer: 10 mM Tris en 1μM EDTA, pH 8,0) met het oog op een eindconcentratie van 100 μM. Bijvoorbeeld resuspendeer 1 pmol van GLB in 100 mL TE buffer en overdracht aan een microcentrifuge buis bedekt met aluminiumfolie. Opmerking: Voor strand sequenties, Zie tabel 3.</li>
	<li>100 μM van Cy3-cAp aan een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis met microsferen Ap-copolymerized toevoegen.</li>
	<li>Tik op de buis een paar keer om te mengen en Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en verwijder residuele buffer via pipetteren.</li>
	<li>Spoel driemaal met 500 μL van TE buffer.</li>
	<li>Resuspendeer microsferen door zachtjes te tikken op de microcentrifuge buis. Herhaal vervolgens stap 4.4.</li>
	<li>Plaats microsferen op het glasplaatje (75 x 50 mm) en bedek met de aluminiumfolie voorafgaand aan de beeldvorming.</li>
</ol>5. asymmetrische PCR voor het versterken van de ssDNA
<ol><li>Voorbereiden op een asymmetrische PCR reagens mix sturen ssDNA te analyseren. Ontdooi de reagentia in tabel 4 op het ijs. Houd niet het Taq polymerase enzym (50 U/µL) op het ijs, maar eerder opgeslagen bij-20 ° C totdat het nodig is.</li>
	<li>Zachtjes vortex alle reagentia en vervolgens kort centrifugeren buizen bij 10.000 x g gedurende 10 s.</li>
	<li>Alle reagentia combineren zoals beschreven in tabel 4.
</li>
	<li>Leg monsters in een thermocycler en beginnen de asymmetrische PCR onder de volgende voorwaarden: 25 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 52 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s), 85 ° C gedurende 5 min, houd bij 4 ° C.</li>
</ol>6. microsfeer-PCR voor het versterken van de ssDNA
Opmerking: Deze sectie beschrijft het protocol voor het versterken van de ssDNA in een PCR reactiebuis. Microsfeer-PCR reacties werden uitgevoerd in 50 μl van reactie volume. De gedetailleerde sequenties gebruikt om te vergroten van ssDNA zijn vermeld in tabel 5. In dit geval, kan Ap op het oppervlak van de microsferen ontharden aan willekeurige DNA sjablonen complementair. Dit is een zeer belangrijke stap voor de productie van complementaire DNA-strengen (antisense bundel van DNA, Figuur 3). Het DNA uitgebreid wordt gebruikt als een sjabloon voor microsfeer-PCR versterking.
<ol><li>Bereiden microsfeer-PCR reagens mix. Ontdooi de reagentia in tabel 6 op het ijs; echter houd niet het enzym Taq polymerase op ijs. Bewaar het bij-20 ° C totdat het nodig is.</li>
	<li>Zachtjes vortex alle reagentia en vervolgens kort centrifugeren buizen bij 10.000 x g gedurende 10 s.</li>
	<li>Verkrijgen door middel van microscopische tellen ongeveer ~ 25 microsferen. Opmerking: Het aantal microbolletjes in één reactiebuis worden berekend met behulp van een lichte Microscoop met 40 X vergroting. Ongeveer 25 ~ microsferen worden gebruikt voor microsfeer-PCR versterking. Meer gedetailleerde informatie is in stap 3.</li>
	<li>Alle reagentia combineren zoals beschreven in tabel 6.
</li>
	<li>Leg monsters in een thermocycler en beginnen de asymmetrische PCR onder de volgende voorwaarden: 25 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 52 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s), 85 ° C gedurende 5 min, houd bij 4 ° C.</li>
	<li>Volgende versterking, voeg 8 l 6 x laden buffer en laadt 15 μL van elk monster in 2% agarose gel. Voer de Elektroforese bij 100 V gedurende 35 min. in 1 x TAE (Tris-acetaat-EDTA, 40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.</li>
</ol>7. confocale microscopie overname
Opmerking: De resultaten van de microsfeer-DNA sonde hybridisatie zijn beeld onder een confocal microscoop. Beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van ImageJ.
<ol><li>Corrigeer gehybridiseerde microsferen tot het stadium van de Microscoop in een houder.</li>
	<li>Selecteer de laser (laser Helium/Neon, 543 nm lijn) en zet hem aan in laser controle.</li>
	<li>Selecteer het objectief in Microscoop controle.</li>
	<li>Selecteer het gewenste filter voor Cy3 en kanaal in configuratiecontrole.</li>
	<li>Start van het experiment en observeren van het monster. Instellingen voor de confocal microscoop zijn samengevat in tabel 7.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
<li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li>
<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Verontreinigingen van dsDNA zijn een belangrijk thema in de versterking van de ssDNA. Blijft het moeilijk om te minimaliseren dsDNA versterking in conventionele asymmetrische PCR versterking15. Bovendien, hoewel technische verbeteringen voor het genereren van ssDNA we het verhogen van de efficiëntie van monsters worden verwerkt kunnen, is ssDNA isolatie nog steeds problematisch vanwege de hoge kosten en opbrengsten van de onvolledige zuivering.
Asymmetrische PCR is een ...

Single-stranded DNA (ssDNA) heeft uitgebreid beschouwd als een element van de moleculaire erkenning (MRE) als gevolg van zijn intrinsieke eigenschappen voor DNA-DNA hybridisatie1,2. De ontwikkeling van ssDNA synthetische systemen kan leiden tot biologische toepassingen zoals DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostiek en geïntegreerde moleculaire detectie op basis van aanvullende interacties4,5.
Tot op heden zijn micrometer-schaal polymeer deeltjes met succes aangetoond met behulp van microfluidic-apparaten. Verschillende technieken van de microfluidic hebben bewezen te krachtig voor het produceren van zeer homogene microsferen op continue stroom in de microchannel milieu6,7.
In de studie van Lee et al. 8, een druppel gebaseerde microfluidic platform voor de microfluidic synthese van copolymerizable oligo-microsfeer en ssDNA versterking werd gemeld. Het microfluidic platform bestaat uit twee lagen van het PDMS (Polydimethylsiloxaan): een bovenste deel met een microfluidic channel-netwerk voor het genereren van de microsfeer en een bodem plat deel. Deze bestaan uit drie soorten PDMS fluidic kanalen: 1) een stroom focussering kanaal voor druppel-generatie, 2) een serpentine kanaal voor het mengen van twee oplossingen, en 3) een sequentiële polymerisatie-kanaal voor microsfeer stollen. Zodra twee onmengbare stromen in een PDMS fluidic enkellijns worden binnengebracht, kunnen de stromen worden gedwongen door de smalle opening structuur. De stroom gedrag zoals kanaal geometrie, debiet en viscositeit van invloed op de grootte en morfologie van de microsfeer. Daarom is de belangrijkste vloeibare stroom kan worden onderverdeeld in microscale monospheres9,10.
Hier vindt u een gedetailleerde microsfeer-PCR protocol voor de amplificatie van ssDNA. Ten eerste wordt een druppel gebaseerde microfluidic apparaat ontwerpproces beschreven. Dan, de manier waarop in welke polyacrylamide microbolletjes met willekeurige DNA sjabloon kan worden matiemaatschappij op een complementaire manier wordt uitgelegd. Tot slot wordt een microsfeer-PCR protocol voor het versterken van de ssDNA weergegeven.

<table><tbody><tr><td>liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Componenten van chip</td></tr><tr><td>40% Acrylamide:bis oplossing (19:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610140</td><td>Componenten van copolymeriseerbare oligo-microsfeer</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat, APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Verharder van acrylamide:bis oplossing</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethyleendiamine, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Katalysator van ammoniumpersulfaat</td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>Tabel 1. Oplossing III. Component van microsfeer reagentia</td></tr><tr><td>Cy3 gelabelde complementaire oligonucleotide proben</td><td>Bioneer</td><td>gesynthetiseerd</td><td>Tabel 3. Sequentie-informatie&nbsp;</td></tr><tr><td>ssDNA acrydide gelabelde sonde</td><td>Bioneer</td><td>gesynthetiseerd</td><td>Tabel 1. Oplossing I. Component van microsfeer reagentia</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp;T1016</td><td>Componenten van TE buffer, pH buffer oplossing</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>Componenten van TE buffer, verwijdering van ion (Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>ssDNA amplificatie</td></tr><tr><td>Confocale microscoop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Identificeren van oligonucleotiden blootstelling van microsfeeroppervlak</td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>eclipse 80i</td><td>Berekenen van het aantal microsferen</td></tr><tr><td>T100 Thermische Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>ssDNA amplificatie</td></tr><tr><td>Handbediende Corona-behandelaar</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td><td>Hydrofiele oppervlaktebehandeling</td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>As one</td><td>HI-1000</td><td>verwarmingsplaat voor het uitharden van vloeibaar PDMS</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>kd Scientific</td><td>78-1100</td><td>Uniforme stroming van Oplossing I en Oplossing II</td></tr><tr><td>Compressor</td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>Stromingscontrole van Oplossing III</td></tr><tr><td>Bright-Line Hemacytometer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Berekenen van het aantal microsferen</td></tr></tbody></table>

een droplet gebaseerde benadering van het microfluidic en de microsfeer-pcr versterking voor single-stranded dna waarbij

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Druppel gebaseerde microfluidics inschakelen de betrouwbare productie van homogene microbolletjes in het kanaal van de microfluidic, die gecontroleerde grootte en morfologie van de verkregen microsfeer. Een copolymerized met een acrydite-DNA-sonde microsfeer werd met succes vervaardigd. Verschillende methoden zoals asymmetrische PCR exonuclease spijsvertering en isolatie op daar beklede magnetische kralen kunnen worden gebruikt voor het synthetiseren van single-stranded DNA (ssDNA). Echter, deze methoden niet efficiënt gebruiken grote hoeveelheden van hoogst gezuiverde ssDNA. Hier beschrijven we een microsfeer-PCR protocol detailleren hoe ssDNA kunnen worden efficiënt versterkt en gescheiden van dsDNA gewoon door pipetteren van een PCR reactiebuis. De amplificatie van ssDNA kan worden toegepast als potentiële reagentia voor de microarray DNA en DNA-SELEX (systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking) processen.

Het verzonnen polymere druppel gebaseerde microfluidic platform bestaat uit twee lagen van het PDMS (Figuur 1a). Drie soorten microfluidic kanaal netwerken worden gebruikt voor het genereren van microsferen: 1) Flow-focusing geometrie zoals weergegeven in Figuur 1b, 2) een serpentine kanaal voor het mengen van oplossing ik en oplossing II en 3) een polymerisatie-kanaal voor microsfeer stollen. De hoogte van alle kanalen was 60 μm...

Dit werk biedt een methode voor de fabricage van microfluidic druppel gebaseerde platforms en de toepassing van polyacrylamide microsferen voor microsfeer-PCR versterking. De microsfeer-PCR-methode maakt het mogelijk om te verkrijgen van single-stranded DNA waarbij zonder te scheiden van de double-stranded DNA.

Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de combinatorische techniek van het microfluïde systeem en het moleculaire biotechnologieveld, zoals microfluïde apparaten en asymmetrie-PCR-methode. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het efficiënt genereren van sterk gehomogeniseerde microsferen en de productie van enkelstrengs DNA zonder extra scheidingsstappen. De implicaties van deze techniek breiden zich uit naar de diagnose of therapie van verschillende ziekten.Omdat het genereren van single-streng DNA de sleutel is voor ap-ta-mo-sis tests, kan het worden gebruikt voor detectie en behandeling. Hoewel deze methode inzicht kan geven in driedimensionaal microfluïdisch systeem in MEMS, kan het ook worden toegepast op andere systemen die worden gebruikt voor detectie en behandeling van ziekten. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal moeite hebben om goed te controleren vloeistoffen uit stroomt in de omgekeerde richting.Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang om de microsfeervorming in de flow-focus geometrie en stolling van gegenereerde microsferen te observeren. Bereid eerst 20 milliliter vloeibaar PDMS-voo

a-droplet-based-microfluidic-approach-microsphere-pcr-amplification

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

This video describes the technique of amplifying single-stranded DNA using oligonucleotide-coated polymer microspheres in a single-tube reaction. This process yields pure single-stranded DNA, which can be further used for DNA sequencing and microarray analysis.

Microsphere Polymerase Chain Reaction to Amplify Single-Stranded DNA

This video demonstrates the multiplex droplet polymerase chain reaction technique for the simultaneous quantification of methylated DNA regions in different white blood cell populations as an early biomarker for clinical diagnosis and prognosis.

Multiplex Droplet Polymerase Chain Reaction to Detect DNA Methylation in Leukocytes

This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Eencellige sequencing blijkt genotypische heterogeniteit in biologische systemen, maar de huidige technologieën ontbreken de doorvoer die nodig zijn voor de diepe profilering van communautaire samenstelling en functie. Hier beschrijven we een microfluidic workflow voor het rangschikken &gt; 50.000 eencellige genomen uit verschillende cel populaties.

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Epigenetische markers worden gebruikt voor witte bloedcellen (WBC) subtypering door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen. Dit protocol presenteert een multiplex druppelpolymeerkettingreactie (mdPCR) methode met behulp van een thermoplastische elastomer (TPE) gebaseerd microfluïde apparaat voor druppelgeneratie waardoor nauwkeurige en multiplex methylatie-specifieke doelkwantificering van WBC differentiële telt.

Methylatiespecifieke Multiplex Droplet PCR met polymeerdruppelgenerator voor hematologische diagnostiek

Water-in-olie druppels testen zijn nuttig voor analytische chemie, enzymevolutie en eencellige analyse, maar vereisen meestal microfluïdica om de druppels te vormen. Hier beschrijven we deeltjessjabloonemulgering, een microfluïdische benadering om druppeltests uit te voeren.

Deeltjessjabloonemulgering maakt microfluïdische druppeltests mogelijk

Leer een druppelgebaseerde microfluidische methode voor microsfeer-PCR-versterking om enkelstrengs-DNA te produceren zonder scheiding. Deze techniek ondersteunt diagnostische en therapeutische toepassingen.

Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Meer video's verkennen