Antimicrobiële karakterisering van geavanceerde materialen voor Bioengineering toepassingen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van materiaalkunde, zoals antimicrobiële eigenschappen, die zeer wenselijk zijn voor veel bio-engineering toepassingen. Deze techniek kan worden gebruikt als een consistent protocol in laboratoria om minder ervaren onderzoekers te helpen die diepgaande stapsgewijze procedures nodig hebben om nauwkeurige resultaten te behalen. We kregen het idee voor deze methode toen we op zoek gingen naar antimicrobiële protocollen en ontdekten dat er geen gedetailleerde protocollen hierover in de literatuur waren.

In deze studie zullen vier geavanceerde materialen met verschillende chemische aard en een controlemateriaal worden getest op antimicrobiële activiteit. Bereid elk materiaal voor door het in schijven van 10 mm diameter te snijden. Steriliseer vervolgens elk specimen door het 10 minuten in 70% ethanol te dompelen, gevolgd door ultraviolette straling gedurende één uur per kant.

Er zullen drie verschillende micro-organismen worden gebruikt om de antimicrobiële activiteit van de geavanceerde materialen te testen. De gram-positieve bacterie, Staphylococcus aureus, de gram-negatieve bacterie, Escherichia coli, en de gistachtige, Candida albicans. Gebruik een steriele wattenstaafje om een paar kolonies van elk micro-organisme te hersuspenderen in 25 ml tryptische sojabouillon, of TSB, in een steriele centrifugebuis.

Vortex gedurende één minuut om een uniforme menging te bereiken. Meet de absorbentie bij 540 nm voor elke micro-organismecultuur met een spectrofotometer. Pas de concentratie van elk micro-organisme aan tot een geschikt aantal kolonievormende eenheden, of CFU per milliliter.

Vortex de microbiële suspensie gedurende vijf seconden om de verspreiding van micro-organismen te verbeteren, en dompel kortstondig een steriele wattenstaaf in deze microbiële suspensie. Verwijder het overtollige vocht van de staaf door de staaf tegen de buiswand met de cultuur te drukken. Strijk gelijkmatig elke microbiële bouillonsuspensie met het steriele wattenstaafje over het oppervlak van een tryptische soja-agar, of TSA plaat, in drie vlakken om het hele oppervlak met het micro-organisme te bedekken.

Laat de platen vijf minuten drogen na de inoculatie. Laat de microbiële bouillonsuspensies op de werktafel liggen voor later gebruik om de concentratie en zuiverheid van de microbiële suspensie te controleren. Steriliseer een stel pincetten door het in een beker met 96% ethanol te dompelen en vervolgens te ontsmetten met een alcoholbrander.

Gebruik de steriele pincetten om de te testen monsterschijven in het midden van de TSA platen te plaatsen. Incubeer de TSA platen in een omgekeerde positie bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Om de resultaten van de diffusietest te analyseren, meet u de diameter van de remmingszone en de diameter van de monsterschijf met een digitale schuifmaat, of door een foto te maken en een geschikte software voor beeldverwerking te gebruiken.

Deze procedure is noodzakelijk om te verifiëren dat de eerder bepaalde microbiële concentraties correct zijn, en om de afwezigheid van microbiële omgevingsbesmetting te waarborgen. Gebruik een micropipet met geschikte gesteriliseerde punten en onder aseptische omstandigheden, en verdeel steriele TSB in steriele microcentrifugebuisjes. Neem een monster op dat als negatieve controle zal worden gebruikt.

Voer zes decimale seriële verdunningen uit met de microbiële bouillonsuspensies die eerder werden gebruikt voor het strijken van de TSA platen. Verspreid met een voorgesteriliseerde Drigalski spatel 100 l van elke geselecteerde verdunning op een TSA plaat. Verspreid 100 l TSB medium zonder micro-organisme op een TSA plaat als negatieve controle.

Incubeer de TSA platen bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De volgende dag telt u het aantal kolonies om te controleren of het aantal CFU per milliliter vergelijkbaar is met dat wat eerder werd bepaald. Controleer de negatieve controleplaat om te bevestigen dat er geen microbiële omgevingsbesmetting is.

Begin deze procedure door de verschillende micro-organismen die getest zullen worden in TSB te kweken, in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius gedurende een nacht. De volgende dag meet u de OD540 van elke nachtelijke cultuur en verdunt u vervolgens elke cultuur in 20 ml TSB in een voorgesteriliseerde centrifugebuis van 50 ml tot een concentratie van ongeveer tien tot de zesde CFU per milliliter. Plaats vier schijven van elk type materiaal en vier controleschijven in afzonderlijke putjes van een steriele 48-wells plaat.

Pipet 150 l van de microbiële suspensie op elk schijfoppervlak. Incubeer de plaat in de 37 graden Celsius incubator gedurende 24 uur. Nadat de 48-wells plaat gedurende 24 uur is geïncubeerd, pipet 850 l steriele PBS op het oppervlak van elk van de vier monsterschijven en vier controleschijven en meng het met de microbiële suspensie.

Verzamel elke PBS microbiële suspensiemengsel en elk schijfje van de 48-wells plaat en breng ze over naar een voorgesteriliseerde 15 ml buis. Vortex de PBS microbiële suspensiemengsels en schijven gedurende één minuut. Soniceer gedurende vijf minuten op 50 Hz en vortex opnieuw gedurende één minuut om ervoor te zorgen dat er geen levensvatbare micro-organismen aan het materiaaloppervlak blijven plakken.

Voer decimale seriële verdunningen uit van de gesoniceerde culturen en steriele microcentrifugebuisjes met TSB. Verspreid 100 l van elke verdunning op een TSA plaat en incubeer de platen aëroob bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Tel na 24 uur het aantal kolonies en druk dit aantal uit in CFU per milliliter.

De resultaten van de contactmethode worden vervolgens geanalyseerd zoals beschreven in het tekstprotocol. De resultaten van de agar schijf diffusie tests tonen geen antimicrobiële activiteit voor het eerste materiaal, en toenemende antibacteriële activiteit tegen S.aureus en E.coli voor de andere drie materialen. Deze grafiek toont de genormaliseerde halo voor elke materiaal schijf tegen S.aureus en E.coli na 24 uur incubatie.

De resultaten van de contactmethode wijzen ook op geen antimicrobiële activiteit voor het eerste