Vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door Dibromomaleimide-disulfide chemie maken

Het algemene doel van deze bio-conjugatiemethode is om virusachtige deeltjes die disulfidebruggen bevatten, fluorescent te functionaliseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de bio-conjugatiereactie voor virusachtige deeltjes die een beperkt aantal aminozuurresiduen hebben die gefunctionaliseerd kunnen worden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er door middel van één reactie nieuwe functionele groepen kunnen worden geïntroduceerd, terwijl er tegelijkertijd door conjugatie geïnduceerde fluoroforen kunnen worden gevormd. Naast Q-Beta geloven wij dat deze reactie kan worden toegepast op alle virusachtige deeltjes die disulfidebindingen bezitten.

Veeg vóór aanvang van de procedure voor de expressie van de Q-Beta-bacteriofaag het werkvlak af met een 1:1 bleekmiddel:ethanol-oplossing. Maak in een aseptische omgeving twee startculturen van drie milliliter door individuele kolonies E.coli BL21 toe te voegen aan SOB-medium. Kweek de culturen overnight bij 37 °C en 0% relatieve luchtvochtigheid met schudden op 250 rpm. Verwijder de volgende dag beide startculturen van drie milliliter uit de schudmachine en giet in een aseptische omgeving elke startcultuur in een gebaffelde Erlenmeyer van twee liter met één liter vers SOB-medium. Plaats de twee kolven met geïnoculeerd medium op een schudmachine op 250 rpm in de ruimte bij 37 °C en 0% relatieve luchtvochtigheid. Kweek de bacteriën totdat ze een optische dichtheid bij 600 nanometer of OD 600 van 0,9 tot 1,0 bereiken. Dit duurt gewoonlijk ongeveer vijf uur. Wanneer de culturen de gewenste OD 600 hebben bereikt, gebruik dan een P1000-pipet om één milliliter één-molair IPTG aan elke kolf toe te voegen om de eiwitexpressie te induceren. Laat de kolven overnight op de schudmachine in de warme ruimte staan.

Verwijder de volgende ochtend de kolven uit de schudmachine, overbreng de inhoud van elke kolf naar een fles van één liter en centrifugeer bij 20.621 ×g bij vier graden Celsius gedurende één uur om de cellen te oogsten. Wanneer de centrifugatie is voltooid, wordt het supernatant weggegooid door het in een kolf met ongeveer vijf milliliter bleekmiddel te gieten om de bacteriën te doden.

Om de celpellet te verzamelen, gebruikt u een spatel om de celpellet van de bodem van de centrifugefles te schrapen en brengt u de pellet over naar een centrifugebuis van 50 milliliter.

Om te beginnen met de procedure voor Q-Beta-zuivering, resuspendeert u elk celpellet met 20 tot 30 milliliters 0,1-molaire kaliumfosfaatbuffer, pH 7. Zorg ervoor dat de resuspensie geen klontjes bevat. Lyseer de cellen met een microfluidizer-processor volgens het protocol van de fabrikant. Lyseer de cellen minstens twee keer om de opbrengst van de partikels te verhogen. Breng de lysaten over in centrifugeflessen van 250 milliliters en centrifugeer bij 20.621 ×g bij vier graden Celsius gedurende één uur. Meet het volume van het supernatant in milliliters. Vermenigvuldig deze waarde met 0,265 en voeg vervolgens deze hoeveelheid in grammen ammoniumsulfaat toe aan het supernatant. Voeg een roerbalkje toe en roer op een roerplaat bij 200 rpm bij vier graden Celsius gedurende ten minste één uur om het eiwit neer te slaan. Centrifugeer in flessen van 250 milliliters bij 20.621 ×g bij vier graden Celsius gedurende een uur. Gooi het supernatant weg en resuspendeer het pellet met ongeveer 40 milliliters 0,1-molaire kaliumfosfaatbuffer, pH 7. Voeg aan het ruwe monster gelijke volumes 1:1 chloroform: n-butanol toe en meng door enkele seconden te vortexen. Breng het mengsel over naar een buis van 38 milliliters. Centrifugeer bij 20.621 ×g bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Gebruik een pipette om de bovenste waterige laag te recupereren. Wees voorzichtig om geen deel van de gelachtige laag mee te nemen die zich tussen de waterige en organische lagen heeft gevormd.

Ontdooi vervolgens 65% tot 40% vooraf bereide sucrosegradiënten. Breng ongeveer twee milliliter van het extract aan op elke gradiënt.

Ultrasentrifugeer bij 99.582 ×g bij vier °C gedurende 16 uur met vrije vertraging. Wanneer de ultracentrifugatie voltooid is, schijn met een led-lamp onder elke buis om te bevestigen dat een blauwe band zichtbaar is. Gebruik een spuit met een lange naald om deze deeltjes te herstellen. Pelletiseer de deeltjes via ultracentrifugatie bij 370.541 ×g bij vier °C gedurende 2,5 uur. De resulterende pellet van gezuiverde deeltjes moet transparant zijn. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,1-molair kaliumfosfaatbuffer, pH 7.

Dit schema toont de conjugatie die gedemonstreerd zal worden. 10 equivalenten Tris(2-carboxyethyl)fosfine of TCEP ten opzichte van de disulfiden in één milligram Q-Beta worden gebruikt om alle disulfiden te reduceren en zo de gereduceerde Q-Beta-capsiden bij kamertemperatuur in één uur te genereren. Bereid vlak voor de reductie van de disulfiden op Q-Beta een verse TCEP-oplossing.

Los 0,002 gram TCEP op in één milliliter ultrapuur water om een 100X-stamaoplossing te maken. Voeg 200 µL Q-Beta met een concentratie van 5 mg/mL toe aan een microcentrifugebuisje. Voeg vervolgens 20 µL van de 100X TCEP-stamaoplossing toe aan het microcentrifugebuisje. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Bereid in de tussentijd de dibroom-maleïmide polyethyleenglycol of DB-PEG-oplossing voor de latere reactie van het heroverbruggen van gereduceerde disulfiden. Los 0,0017 gram DB-PEG op in 100 µL dimethylformamide. Voeg 680 µL van een 10 mM natriumfosfaatoplossing, pH 5 toe. Voeg vervolgens de gereduceerde Q-Beta toe aan de DB-PEG-oplossing en observeer het mengproces onder een handlamp met 365 nm UV-licht. Bij het mengen moet onmiddellijk een heldergele fluorescentie zichtbaar zijn. Laat de reactie gedurende de nacht bij kamertemperatuur plaatsvinden op een rotisserie.

Zuiver de volgende ochtend het reactiemengsel met een centrifugaalfilter met behulp van 1X PBS bij 3.283 ×g bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Controleer tot slot de conjugatie middels niet-reducerende SDS-polyacrylamidegelelektroforese en native agarosegelelektroforese.

De conjugatie van DB-PEG op Q-Beta werd bevestigd via niet-reducerende SDS-polyacrylamidegelelektroforese onder UV-licht en Coomassie-blauwkleuring. Alle fluorescerende banden colocaliseerden met de Coomassie-blauwkleuring, wat duidt op een succesvolle conjugatie. De integriteit van de Q-Beta-PEG-conjugaten werd bevestigd via native agarosegelelektroforese en transmissie-elektronenmicroscopie.

De bovenste micrografie toont Q-Beta-maleïmide of Q-Beta-M en de onderste micrografie toont Q-Beta-PEG. Fluorescentiespectroscopie van Q-Beta-M en Q-Beta-PEG in 0,1 molar kaliumfosfaatbuffer vertoonde een excitatiemaximum rond 400 nanometer en een emissiemaximum tussen 540 en 550 nanometer. Wanneer Q-Beta-PEG werd geïncubeerd met muismacrofagen in serumvrij DMEM-medium, gevolgd door kernkleuring, tonen co-lokalisatiebeelden aan dat geel fluorescerende deeltjes door de cellen werden opgenomen en kunnen worden gevolgd na vier uur incubatie.

In contrast vertonen de niet-gefunctionaliseerde Q-Beta virus-achtige partikels een verwaarloosbare fluorescentie.

Dit protocol kan onderzoekers helpen om Q-Beta in vier dagen te zuiveren en de overnight re-bridging conjugatiereactie uit te voeren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de conjugatiereactie het beste verloopt onder zure omstandigheden, zoals pH 5.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Q-Beta VLP kunt zuiveren en de disulfidebindingen opnieuw kunt overbruggen met dibroommaleïmideverbindingen om een fluorescent gelabelde VLP te maken. Na de ontwikkeling bood deze techniek onderzoekers een extra functionele handgreep die kan worden gebruikt om het buitenoppervlak van bacteriofaag Q-Beta duaal te functionaliseren.