Name: Vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door Dibromomaleimide-disulfide chemie maken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer een bio-conjugatiemethode om virusachtige deeltjes met disulfidebruggen fluorescent te labelen met dibromomaleimide-chemie. Deze techniek maakt functionele groepen en fluoroforen in één reactie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.J.G. erkent de National Science foundation (DMR-1654405) en de kanker preventie Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) voor hun steun.

1. voorbereiding
<ol><li>Maken van lysogenie Bouillon (LB) agar en giet platen12.</li>
	<li>
Tover BL21(DE3) met een plasmide van de pET28 met de wtQβ jas eiwit sequentie.
	<ol>
<li>Ontdooi E. coli BL21(DE3) bevoegde cellen in een ijsbad. Plaats 50 μl van cellen in een buis van microcentrifuge.</li>
		<li>Voeg 2 l plasmide in één buis en zachtjes flick de buis. Incubeer vervolgens op ijs gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Warmte-schok de cellen voor 45 s in een waterbad dat precies 42 ° C. Plaats de buis terug in het ijsbad onmiddellijk na het warmte-schokkend en incubeer gedurende 5 min.</li>
		<li>Toevoegen van 950 μL van LB-media die geen antibioticum bevat.</li>
		<li>Schudden van de cultuur bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 60 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>100 μl van de cultuur op LB agar platen plaat (met kanamycine) en Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C. Selecteer wit kolonies wanneer nodig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Super optimale Bouillon (SOB) media maken
	<ol>
<li>Autoclaaf twee 2 L verbijsterd conische kolven op een superdry cyclus.</li>
		<li>In een aseptische omgeving, weeg en Voeg 20,0 g trypton, 5,0 g gist extract, 2.469 g watervrij magnesium-sulfaat, 0.584 g natriumchloride en 0.186 g kaliumchloride aan elke maatkolf.</li>
		<li>Breng het volume tot 1 L met ultrazuiver water in elke kolf en autoclaaf op de vloeibare cyclus.</li>
		<li>Zodra de SOB-media kamertemperatuur na autoclaaf bereikt heeft, voeg 1 mL kanamycine (100 mg/mL) toe aan elke liter van media en bewaren bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00) maken
	<ol>
<li>1 M kalium monobasisch oplossing door het oplossen van 68.045 g kalium monobasisch in 500 mL ultrazuiver water maken</li>
		<li>1 M kalium dibasische oplossing door het oplossen van 87.09 g kalium dibasische in 500 mL ultrazuiver water maken</li>
		<li>Voeg 38.5 mL kalium monobasisch oplossing en 61,5 mL kalium dibasische op een 1 L-fles.</li>
		<li>Breng pH op 7,00 indien nodig, en brengen een volume van 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maak 5 – 40% sucrose verlopen in 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).
	<ol>
<li>Bereiden in 50 mL centrifuge buizen, oplossingen met 5 – 40% (in stappen van 5% stijgt) sacharose opgelost in 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).</li>
		<li>Stort 3,3 mL 5% sacharoseoplossing onderin een ronde bodem polycarbonaat-tube 38 mL met behulp van een lange naald-spuit en herhaal deze procedure voor de vijf andere buizen.</li>
		<li>Zorgvuldig stort 3,3 mL 10% sacharoseoplossing aan de onderkant van de buis, en verwijder voorzichtig de naald wat betreft het verloop niet te storen. Herhaal voor de andere vijf buizen. 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>Blijven storten 3,3 mL lagen van sacharose oplossingen, verhoging van 15% tot 40% in elke buis, terwijl ze voorzichtig om niet storen het verloop.</li>
	<li>Als alles klaar is, betrekking hebben op de toppen van de hellingen met folie en opslaan bij-80 ° C.</li>
</ol>2. weergave van de Qβ
<ol><li>Veeg Bank gebied met 1:1 bleekwater/ethanol.</li>
	<li>Maak twee 3 mL starterculturen in een aseptische omgeving door enkele kolonies van E. coli BL21(DE3) in 3 mL SOB media toe te voegen in een aseptische omgeving.</li>
	<li>Groeien in een roteerapparaat bij 250 omwentelingen per minuut in een 37 ° C en 0% relatieve vochtigheid (rH) kamer 's nachts.</li>
	<li>
Inoculeer starter cultuur in SOB media:
	<ol>
<li>Beide 3 mL starterculturen opstijgen de shaker en giet in een aseptische omgeving, elke starter cultuur in één van de twee 2 L verbijsterd conische kolven met 1 L voor verse SOB media in elk.</li>
		<li>Plaats de geënte media op een shaker op 250 toeren per minuut in een 37 ° C en 0% rH-kamer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De bacteriën in een roteerapparaat bij 250 omwentelingen per minuut in een ruimte van 37 ° C en 0% rH groeien totdat OD600 0.9-1.0 bereikt.</li>
	<li>Voeg 1 mL 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) met behulp van een pipet P1000 ertoe eiwit expressie.</li>
	<li>Laat de media in het roteerapparaat bij 250 omwentelingen per minuut in een 37 ° C en 0% rH kamer 's nachts.</li>
	<li>Verwijder media uit de shaker de volgende ochtend en centrifuge met behulp van 1000 mL flessen bij 20,621 × g gedurende 1 uur bij 4 ° C om te oogsten van de cellen.</li>
	<li>
Verwijder het supernatant en verzamelen van de cel-pellet.
	<ol>
<li>Giet het supernatant in een kolf met ongeveer 5 mL bleekwater om bacteriën te doden. Dit is afval.</li>
		<li>Gebruik een spatel om schrapen de cel pellet vanaf de onderkant van de centrifuge fles en zet de pellet in een centrifugebuis 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de zuivering van Qβ
<ol><li>Resuspendeer de pellet cel met ~ 20-30 mL 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).</li>
	<li>Controleer of de resuspensie heeft geen brokken en lyse de cellen met een microfluidizer-processor volgens protocol van de fabrikant (Zie Tabel van materialen). Lyse de cellen ten minste tweemaal te verhogen van het rendement van de deeltjes.</li>
	<li>Centrifugeer het lysate in flessen van 250 mL centrifuge op 20,621 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Negeren van de pellet en meten van de omvang van de bovendrijvende substantie in mL. Deze waarde vermenigvuldig met 0.265 en die hoeveelheid g ammoniumsulfaat toevoegen aan het supernatant.</li>
	<li>Roer bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur op een bord roer bij 200 t/min te precipiteren uit het eiwit.</li>
	<li>Centrifugeer in 250 mL flessen bij 20,621 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet met ongeveer 10 mL 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).</li>
	<li>Gelijke hoeveelheden van 1:1 chloroform/n-butanol aan het ruwe monster en de mix toevoegen door de vortexing voor een paar seconden.</li>
	<li>Centrifugeer in 38 mL tubes 20,621 × g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>De waterige toplaag met behulp van een precisiepipet Pasteur te herstellen. Wees voorzichtig niet te nemen een van de gel zoals laag die tussen de waterige en organische laag heeft gevormd.</li>
	<li>Ontdooi zes 5-40% pre-en-klare sacharose verlopen en laden van ongeveer 2 mL het extract op elk.</li>
	<li>Ultracentrifuge bij 99,582 x g gedurende 16 uur bij 4 ° C met gratis vertraging.</li>
	<li>Glans een licht emitterende diode (LED) licht onder elke buis en een blauwe band moet zichtbaar worden. Het herstellen van deze deeltjes met een lange naald-spuit.</li>
	<li>Ultrapellet de deeltjes op 370,541 x g gedurende 2,5 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de transparante pellet van gezuiverde deeltjes met 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).</li>
</ol>4. kwantificering en bevestiging van het Product
<ol><li>Gebruik analyse van Bradford te kwantificeren van de product-13.</li>
	<li>Stormloop te verminderen en niet-reducerende natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) om te bevestigen het product14. Opmerking: Vermindering van de SDS-pagina wordt gebruikt om te bevestigen het molecuulgewicht van vacht eiwit; niet-vermindering van SDS-pagina is ter bevestiging van de hogere orderstructuur.</li>
</ol>5. conjugating DB verbindingen op Qβ
<ol><li>
Verminderen disulfides op Qβ.
	<ol>
<li>Los 0,0020 g tris(2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP) in 1 mL ultrazuiver water te maken van een stamoplossing van 100 x. Opmerking: Bereiden verse TCEP vóór vermindering.</li>
		<li>Voeg 200 µL van Qβ (5 mg/mL) in een microcentrifuge buis.</li>
		<li>Volg door 20 µL van 100 x TCEP stockoplossing toe te voegen.</li>
		<li>Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opnieuw een brug verminderde bisulfide met behulp van dibromomaleimide polyethyleenglycol (DB-PEG).
	<ol>
<li>Los 0.0017 g dibromomaleimide-polyethyleenglycol (DB-PEG) in 100 µL DMF.</li>
		<li>Voeg 680 µL van 10 mM natriumfosfaat oplossing (pH = 5,00).</li>
		<li>Voeg Qβ verminderd in de oplossing van DB-PEG en observeren het mengen proces onder een 365 nm UV-lamp. De heldere gele fluorescentie kan onmiddellijk worden gevisualiseerd met een 365 nm handbediende UV-lamp op het mengen.</li>
		<li>Laat de reactie gaan 's nachts bij kamertemperatuur (RT) op een rotisserie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het reactiemengsel zuiveren door centrifugaal filter (COMW = 10 kDa) drie keer met 1 x PBS op 3,283 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Controleren de vervoeging doordat niet-SDS-pagina en inheemse agarose gel electroforese. Opmerking: Experimentele uitgevoerd als intact deeltjes in native agarose gel, en zij worden gescheiden op basis van hun kosten, de grootte en de vorm.</li>
</ol>

<ol><li>Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Virus-Based+Polymer-Protein+Nanoparticles+by+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).</li>
<li>Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Integration+of+Gold+Nanoparticles+and+Organic+Fluorophores+Using+Synthetically+Modified+MS2+Viral+Capsids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Directed+Synthesis+of+Porous+and+Protective+Core-Shell+Bionanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).</li>
<li>Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Chemistry%3A+The+Chemical+Functionalization+of+Viral+Architectures+to+Create+New+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology.</a> WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).</li>
<li>Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+proteins+at+cysteine%3A+opportunities+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+-+Asian+J%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology.</a> Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).</li>
<li>Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+Virus+X%2C+a+Filamentous+Plant+Viral+Nanoparticle+for+Doxorubicin+Delivery+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy.</a> Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).</li>
<li>Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-templated+FRET+Platform+for+the+Rational+Design+of+Ratiometric+Fluorescent+Nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors.</a> Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Structure+and+Conformation+Alter+the+Antigenicity+of+Virus-like+Particle-Polymer+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates.</a> J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsmacrolett.7b00049">Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity.</a> ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).</li>
<li>Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Hybrid+Bacteriophage+Qbeta+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles.</a> Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Functionalization+across+Quaternary+Structure+in+a+Virus-+like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle.</a> Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).</li>
<li>Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/">https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</a> (2016).</li>
<li>Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf</a> (2017).</li>
<li>Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf</a> (2017).</li>
<li>Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Modification%2C+Bioconjugation%2C+and+Disulfide+Bridging+Using+Bromomaleimides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).</li>
<li>Castaneda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mild+Synthesis+of+N-functionalised+Bromomaleimides%2C+Thiomaleimides+and+Bromopyridazinediones%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones.</a> Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).</li>
<li>Fiedler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Mutations+Change+the+Structure+and+Stability+of+a+Virus-+Like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).</li>
<li>Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+Virus-like+Particles+with+Poly%282-oxazoline%29s%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functionalized+Bacteriophage+Q%CE%B2+as+a+Photocaged+Drug+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier.</a> Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Vergeleken met kleinere EiwitReiniging, is een unieke stap in het zuiveren van de bacteriofaag Qβ de gradiënt centrifugeren van sacharose. Na de chloroform/n-butanol extractie stap, is Qβ verder gezuiverd met behulp van 5-40% sucrose verlopen. Tijdens centrifugeren, worden deeltjes gescheiden op basis van hun grootte. Grotere deeltjes reizen naar de hogere dichtheid regio, terwijl de kleinere deeltjes blijven in de lagere regio van de dichtheid. Qβ reist naar het onderste derde van het verloop en blijft er terwijl kleine...

Met behulp van virale capsids nano-sized heeft ontpopt als een spannende gebied, die gericht is op het verbreden van de reikwijdte van toepassingen in biomedisch onderzoek1,2,3. Recombinantly uitgesproken virusachtige deeltjes (experimentele) zijn structureel afgeleid van virussen, maar ze missen de oorspronkelijke virale genetische materiaal waardoor ze niet-infectieuze eiwithoudende nanodeeltjes. Aangezien de oppervlaktekenmerken zijn genetisch geprogrammeerd en elke Eiwitmantel identiek aan die voor en na het wordt uitgedrukt, is het mogelijk om te weten de locatie en het aantal reactieve zijketens van de aminozuren met atomistic precisie. In veel gevallen bezitten zowel het exterieur en interieur oppervlak vele soorten oplosmiddel blootgestelde aminozuurresidu's, die redelijkerwijs kunnen worden matiemaatschappij door bioconjugation reacties - reacties die covalente bindingen tussen een Biomolecuul en een synthetische vormen molecuul4,5.
Bioconjugation reacties helpen biomoleculen van belang hebben diverser functionaliteiten op een relatief eenvoudige manier. Moleculen van belang, zoals therapeutische drugs6, fluorescerende labels7 en polymeren8,9 kunnen worden vooraf gesynthetiseerd en gekenmerkt voordat ze zijn aangesloten op het oppervlak van experimentele. Een bijzonder gemeenschappelijk VLP transferoefeningen biomedische en biomaterialen onderzoek geweest de VLP gebaseerd op bacteriofaag Qβ, die als recombinantly uitgesproken, is een 28 nm icosahedrale virale Eiwitmantel10. De meest voorkomende reactie sites op Qβ zijn lysines door een brede marge, hoewel wij hebben onlangs de succesvolle vervoeging11 van dibromomaleimide verbindingen aan de verminderde disulfides die lijn de poriën van Qβ via de reactie van een Haddleton-Baker meegedeeld. De reactie verloopt met een goede opbrengst en, even belangrijk, zonder verlies van de thermische stabiliteit van de deeltjes. Op hetzelfde moment genereert deze reactie vervoeging-geïnduceerde fluorescentie, die kan worden gebruikt voor het bijhouden van de opname van deze deeltjes in cellen. In dit werk tonen we de vervoeging van polyethyleenglycol (PEG) op het oppervlak van Qβ door de Haddleton-Baker-reactie, wat in een heldere gele fluorophore resulteert. Deze deeltjes kunnen vervolgens worden bijgehouden als ze worden genomen door de cellen. Het protocol hierin zal helpen genereren van nieuwe TL gepegyleerde eiwithoudende nanodeeltjes gebaseerd op Qβ, hoewel haar beginselen zijn van toepassing op een van de vele andere experimentele oplosmiddel blootgestelde disulfides met onderzoekers.

<table><tbody><tr><td>LB Broth (Miller)&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrous magnesium sulfate</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System</td><td>Fisher Scientific</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590B</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>096-041053</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Alfa Aesar</td><td>32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Protein Assay</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Hydrochloride</td><td>Research Products International</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-Dibromomaleimide 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>Polythylene Glycol</td><td>Alfa Aesar</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/bis-Acrylamide</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000 confocal laser scanning microscope</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Revolver Adjustable Rotator&nbsp;</td><td>Thomas Scientific&nbsp;</td><td>1190P25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr><tr><td>2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim</td><td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P Microfluidizer Materials Processor</td><td>Microfluidics</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL</td><td>PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>533LS-E Series Steam Sterilizers</td><td>Getinge</td><td>533LS-E</td><td></td></tr><tr><td>TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Microcentifuge Tube: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>VWR Os-500 Orbital Shaker</td><td>VWR Scientifc Products</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Handcast systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene, 250 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>Long Needle&nbsp;</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance</td><td>Intelligent Weighting Technology</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 &micro;l</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door dibromomaleimide-disulfide chemie maken

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

De recente stijging van de virusachtige deeltjes (experimentele) in biomedische en onderzoek van materialen kan worden toegeschreven aan hun gebruiksgemak biosynthese, discrete grootte, genetische programmeerbaarheid en biologische afbreekbaarheid. Terwijl ze zeer vatbaar voor bioconjugation reacties voor het toevoegen van synthetische liganden op hun oppervlak, is het bereik in bioconjugation methodologieën op deze waterige geboren capsids relatief beperkt. Ter vergemakkelijking van de richting van functionele biomaterialen onderzoek, moeten niet-traditionele bioconjugation reacties worden beschouwd. De reactie beschreven in dit protocol maakt gebruik van dibromomaleimides om nieuwe functionaliteit in het oplosmiddel blootgestelde bisulfide obligaties van een VLP gebaseerd op bacteriofaag Qβ. Bovendien is het eindproduct TL, die heeft het extra voordeel van het genereren van een traceerbare in vitro sonde met behulp van een commercieel beschikbare filter set.

De dibromomaleimide derivaten kunnen worden gesynthetiseerd door de condensatiereactie tussen dibromomaleimide anhydride (en) en primaire amines15. U kunt ook een milde synthetische methode16 met behulp van N-methoxycarbonyl ingeschakeld 3,4-dibromomaleimide misbruik wordt gemaakt van hier door te reageren met methoxypolyethylene glycol (PEG) rendement DB-PEG (Figuur 1). NMR werd gebruikt voor het identificeren ...

Hier presenteren we een procedure fluorescently functionalize de disulfides op Qβ VLP met dibromomaleimide. We beschrijven Qβ meningsuiting en zuivering, de synthese van dibromomaleimide-matiemaatschappij moleculen en de vervoeging reactie tussen dibromomaleimide en Qβ. Het resulterende gele fluorescerende geconjugeerd deeltje kan worden gebruikt als een fluorescentie sonde binnen cellen.

Vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door Dibromomaleimide-disulfide chemie maken

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Het algemene doel van deze bio-conjugatiemethode is om virusachtige deeltjes die disulfidebruggen bevatten, fluorescent te functionaliseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de bio-conjugatiereactie voor virusachtige deeltjes die een beperkt aantal aminozuurresiduen hebben die gefunctionaliseerd kunnen worden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er door middel van één reactie nieuwe functionele groepen kunnen worden geïntroduceerd, terwijl er tegelijkertijd door conjugatie geïnduceerde fluoroforen kunnen worden gevormd. Naast Q-Beta geloven wij dat deze reactie kan worden toegepast op alle virusachtige deeltjes die disulfidebindingen bezitten.Veeg vóór aanvang van de procedure voor de expressie van de Q-Beta-bacteriofaag het werkvlak af met een 1:1 bleekmiddel:ethanol-oplossing. Maak in een aseptische omgeving twee startculturen van drie milliliter door individuele kolonies E.coli BL21 toe te voegen aan SOB-medium. Kweek de culturen overnight bij 37 °C en 0% relatieve luchtvochtigheid met schudden op 250 rpm. Verwijder de volgende dag beide startculturen van drie milliliter uit de schudmachine en giet in een aseptische omgevin

making-conjugation-induced-fluorescent-pegylated-virus-like-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level

Profiterend van de vooruitgang in de ontwikkeling fluorofoor en imaging technologie, een eenvoudige methode van Alexa Fluor etikettering van dengue virus was ontwikkeld om het begin van de interacties tussen virus en cel visualiseren.

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker...

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

We illustreren hier een in vitro membraanbindingstest waarin interacties tussen HIV-1 Gag en lipidemembraan visueel worden geanalyseerd met behulp van YFP-gelabelde Gag gesynthetiseerd in een tarwekiem-gebaseerd in vitro translatiesysteem en GUV's bereid door middel van een elektrovormingstechniek.

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

We hebben de Eiwitmantel proteïne van hepatitis E virus ontworpen als een theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP assembleert zelf in een stabiele icosahedrale kooi in mucosale levering. Hier beschrijven we de wijziging van de HEVNPs voor tumor gericht op door muteert residuen oppervlak-blootgesteld aan cysteines, die conjugaat van synthetische liganden die specifiek tumorcellen binden.

Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Het protocol hier beschreven kan onderzoekers specifiek adenovirus capsids op geselecteerde locaties wijzigen door eenvoudige chemie. Afgeschermde adenovirus vectoren deeltjes retargeted gene transfer vectoren kunnen worden gegenereerd en vector-gastheer interacties kunnen worden bestudeerd.

Gecombineerde genetische en chemische Eiwitmantel wijzigingen van genenoverdracht Adenovirus gebaseerde vectoren voor afscherming en Targeting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Leer een bio-conjugatiemethode om virusachtige deeltjes met disulfidebruggen fluorescent te labelen met dibromomaleimide-chemie. Deze techniek maakt functionele groepen en fluoroforen in één reactie.

Vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door Dibromomaleimide-disulfide chemie maken

Meer video's verkennen