Name: Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer het prepareren van ontwikkelend perifeer olfactorisch weefsel van Drosophila voor moleculaire analyses. Deze methode maakt genexpressieonderzoek en immunohistochemie mogelijk voor inzicht in zintuiglijke ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd gesteund door een subsidie van de National Science Foundation Pelin C. Volkan (DEB-1457690).

Het volgende protocol is in overeenstemming met de richtsnoeren van de ethiek door het Duke University onderzoek ethisch comité vastgesteld.
1. de weefsels voorbereiding en Developmental enscenering van Drosophila melanogaster Verpopping
<ol><li>Kies eerst hoeveel vliegen nodig zal zijn voor de dissectie. Voor RT-PCR en RNAseq, 100-200 antennal schijven en antennes van individuen die nodig in prepupal, 8 h APF, 40 h APF, en volwassen stadia zijn te verzamelen. Ontleden voor immunohistochemistry, 10-20 individu.</li>
	<li>Alle materialen, met inbegrip van hersendissectie pads en pincet, doekjes met 70% reinigen EtOH. Als de ontleed materiaal is om te worden gebruikt voor RNA extracties, schoon alles met RNase neutraliserende en alle oplossingen via nuclease-vrije of diethyl-pyrocarbonate (DEPC) behandeld water. Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van silicone dissectie pads in plaats van glas voor de ontledingen. Silicone pads zijn vriendelijk voor ultra-fijne pincet en bevorderen van snelle en kwalitatief hoogwaardige dissecties.</li>
	<li>Verzamelen Verpopping bij de 0 h APF/prepupal stadium.<ol>
<li>Om de meest nauwkeurige tijdelijke, monitor de larven op 30 min tot 1U intervallen. Opmerking: Dolende derde instar-larven in een matig overvolle fles zal waarschijnlijk binnen een paar uur verpoppen.</li>
		<li>Zodra de larven immobiel en zijn omringd door een erg licht (bijna witte) gekleurde pop geval, ze vervolgens overbrengen naar een kleine 2 - in petrischaal met een vochtig filterpapier.</li>
		<li>Blijven voor 1-2 h, af en toe controle, identificatie, en de overdracht van prepupae. Opmerking: Als alternatief, duidelijk een fles van alle poppen en laat de larven te ontwikkelen gedurende 2 uur. Alle poppen verzameld na 2U zal binnen een 0 - 2 h APF bereik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Onmiddellijk naar stap 3.1 verplaatsen om te ontleden de prepupal antennal schijf voor de fase van de APF 0 h. Als de prepupa worden ouder moet, verzamelen ze in een schotel, dekking van de schotel en plaats een paraffine-film rond de randen voor de remming van de droogte en plaats de petrischaal bij 25 ° C. Opmerking: De poppen kunnen nu worden leeftijd tot eclosion.</li>
	<li>Leeftijd voor poppen verzameld in een 2U-bereik, de prepupae voor minder dan de gewenste leeftijd 2 h om ervoor te zorgen dat de poppen geen overdosering.</li>
	<li>Gebruik ultra-fijne pincet (Dumont 55) als het weefsel is zeer klein en kwetsbaar.</li>
</ol>2. de weefsels voorbereiding en ontwikkelingsstoornissen enscenering van Verpopping van andere diersoorten Drosophila
<ol><li>Om te bepalen van de lengte van de pop ontwikkeling in andere soorten Drosophila , leg de monsters op de optimale temperatuur, vastleggen van de data wanneer prepupae worden waargenomen, sorteren hen in een verse flesje en registreren het aantal dagen vanaf de prepupa tot volwassenheid.</li>
	<li>De verhouding van tijd voor pop ontwikkeling voor niet -melanogaster soorten en melanogasteropnemen. De verhouding van de ontwikkelings tijd door het aantal uren voor de enscenering melanogaster gebruikt zodat het aantal uren tot de leeftijd van de soorten niet -melanogaster vermenigvuldigen.</li>
</ol>3. dissectie van D. melanogaster pop Antennal Disc
Opmerking: Alle tijden van de veroudering en dissectie protocollen worden beschreven voor Drosophila melanogaster. Voor alle andere soorten, zal een wijziging van het protocol van de veroudering op basis van de punten van de soortspecifieke ontwikkelings tijd nodig zijn, zoals hierboven beschreven.
<ol><li>Voor pop antennal schijf dissecties, verzamelen van 50-100 0 - 2 h of 6-8 h oude poppen met behulp van een spatel en leg ze op een dissectie pad.</li>
	<li>Pipetteer 150 µL van RNA isolatie-oplossing in een RNase gratis 1.5-mL microfuge buis met behulp van een precisiepipet 200-µL en plaats de buis op ijs.</li>
	<li>Het ontleden van de poppen in 150-200 µL van 1 x PBS (phosphate buffered saline, nuclease-gratis). Plaats meerdere druppels met PBS (150-200 µL per druppel) op de dissectie-pad.</li>
	<li>Op het pad van de dissectie, plaats u de 0 - 2 h of 6-8 h ouder poppen (één Verpopping per druppel) om te worden ontleed in één van de 1 x PBS druppels. Gebruik pincet in de ene hand om het lichaam te stabiliseren.</li>
	<li>Voor de 0 - 2 h veroudering van poppen, pincet in de andere hand, houd op met het meest voorste deel (de mond hooks) van de prepupa en het blootstellen van de hersenen en het imaginaire schijven aangesloten op het voorste pop geval uitlichten.</li>
	<li>Voor de 8 h APF poppen, eerst zachtjes afschilferen het pop geval vanaf het meest anterior kwartaal voor de verpopping, bloot het hoofd binnen de membraan-zak, die het lichaam omringt. Opmerking: Het lichaam, in dit stadium ziet eruit als een degenererende larve.</li>
	<li>Verwijder het hoofd op het gewricht van de nek. Opmerking: Dit zorgt ervoor dat de antennal schijven zal niet verloren gaan, die in dit stadium zijn aangesloten voornamelijk op de optische kwabben van de hersenen.</li>
	<li>Het weefsel met de hersenen en het imaginaire schijven naar een andere 1 x PBS druppel met pincet of een 20-µL pipet overbrengen.</li>
	<li>Het identificeren van de oog-antennal schijf aangesloten op de hersenen bij de optische kwabben. Met behulp van Tang, Verbreek de oog-antennal schijf de hersenen en de pop zaak. Overbrengen naar een nieuwe 1 x PBS druppel met pincet of een 20-µL pipet. Opmerking: De prepupal oog-antennal disc is een platte weefsel. Echter door de 8 h poppen, worden de oog-schijven geroteerd cupping de antennal schijven, die zit anterior to de centrale hersenen.</li>
	<li>Met behulp van Tang, knip het weefsel op de site van de verbinding tussen het oog en de antennal schijf. Een 20-µL pipet zachtjes overdracht van het ontleed weefsel in het RNA reagens voor de oplossing van de isolatie gebruiken Het minimaliseren van de hoeveelheid vloeistof die door een zo klein mogelijk bedrag pipetteren overgedragen.</li>
	<li>Herhaal totdat alle poppen hebben is ontleed.</li>
</ol>4. dissectie van D. melanogaster medio-pop en volwassen antennes
Opmerking: Door 40 h APF, de meerderheid van de metamorfose is voltooid, en de volwassen structuren zijn steeds herkenbaar, maar zijn nog steeds wit en onopvallend. Op dit punt van de ontwikkelings tijd, de volwassen antenne heeft haar definitieve vorm gekregen maar nog steeds is transparant en de meerderheid van de olfactorische receptoren, met uitzondering van enkelen, expressie niet zijn begonnen.
<ol><li>Voor pop antennal dissecties, verzamelen van 50-100 prepupae zoals beschreven in stap 1 en leeftijd ze voor 40 h bij 25 ° C.</li>
	<li>Pipetteer 150 µL van RNA isolatie-oplossing in een RNase gratis 1.5-mL microcentrifuge tube met behulp van een 200-µL pipet en plaats de buis op ijs.</li>
	<li>Het pad van de dissectie, plaatst de verpopping te worden ontleed in één van de 1 x PBS druppels. Gebruik pincet in de ene hand om het lichaam te stabiliseren. Zachtjes de pop geval vanaf het meest anterior kwartaal van de verpopping, bloot het hoofd binnen de membraan-zak, die het lichaam omringt met pincet in de andere hand, afschilferen.</li>
	<li>Met behulp van Tang, zorgvuldig afgesneden het hoofd van de rest van de pop lichaam door het lichaam met één set pincet en rippen van het hoofd af bij de hals gezamenlijk met een andere set van verlostang. Pipetteer zachtjes het hoofd in een ander 1 x PBS druppel met pincet. Pipetteer omhoog en omlaag om de inhoud van het hoofd (hersenen, etc.) te verkrijgen van een duidelijke membraan dat gebruikt om te omringen het ontwikkelende Drosophila hoofd leeghalen. Opmerking: Bij 40-50 h APF, de antennes zijn aangesloten op het anterior-meeste gedeelte van het membraan. Zij zal blijken voor dissectie wanneer de inhoud van het hoofd met pipetteren zijn gewist.</li>
	<li>Met behulp van Tang, wordt de pop antennes verbreken door het membraan. De 2nd -segment van de antenne te verbreken van de 3rd met behulp van Tang aan het segment op het segmentale gewricht, zoals alleen de 3rd segment zal het huis van de olfactorische receptor neuronen.</li>
	<li>Een 20-µL pipet zachtjes overdracht van het ontleed weefsel in het RNA reagens voor de oplossing van de isolatie gebruiken Het minimaliseren van de hoeveelheid vloeistof die door een zo klein mogelijk bedrag pipetteren overgedragen. Herhaal totdat alle poppen hebben is ontleed.</li>
	<li>Voor volwassen antennal dissecties, verzamelen van ongeveer 50 volwassenen en hen voor een week na eclosion leeftijd. Opmerking: De expressie van genen die olfactorische receptor en andere genen piek een week na eclosion. De volwassenen zijn leeftijd voor een week om biologisch relevante genen met lage overvloed afschriften te stijgen boven de drempel van detectie.</li>
	<li>Ontleden voor RNA extracties, vliegen terwijl ze nog in leven op een CO2 pad. Behandel de CO2 -pad met RNase remmers. Voor confocal imaging, ontleden de vliegen op een pad van de dissectie in 1 x PBS of PBS + 0,2% Triton.</li>
	<li>Ten eerste, de volwassenen om te slapen op de CO2 station pad onder het toepassingsgebied van de dissectie plaatsen Op de CO2 station pad, gebruik pincet in de ene hand te stabiliseren van het lichaam, kunt pincet in de andere hand zachtjes trekken/snuifje uit het derde antennal segment van de tweede.</li>
	<li>Overdracht van de antennes in een isolatie-oplossing van RNA, gebruik pincet te plaatsen van de antenne rechtstreeks in de vloeistof. Herhaal totdat alle volwassenen hebben is ontleed. Opmerking: Zorg ervoor dat de antennes zijn ondergedompeld in RNA isolatie-oplossing. De antennes kunnen worden vast te zitten aan de zijkant van de buis. Hierdoor wordt een verhoogde afbraak van het RNA, vermindering van RNA kwaliteit en kwantiteit.</li>
	<li>Direct overgaan tot de RNA extractie of plaats de buis bij-80 ° C voor langdurige opslag.</li>
</ol>5. RNA isolatie uit ontleed weefsels
<ol><li>Verwijder alle monsters van de opslag-80 ° C en hen in de ijskast ontdooien.</li>
	<li>Kort draaien (5-6 s, ~ 6.000 x g) elk monster voor het verzamelen van het materiaal aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Slijpen van elk monster met behulp van een gesteriliseerde met autoclaaf kunststof stamper en een elektromotor voor 10 s op ijs.</li>
	<li>Herhaal stap 5.2 en 5.3 4.</li>
	<li>Uitvoeren van het RNA extractie met behulp van commercieel beschikbare kits en de protocollen van de fabrikant voor een optimale opbrengst.</li>
	<li>QRT-PCR met verkrijgbare reagentia en specifieke primers tegen genen van belang en na de fabrikant protocollen uitvoeren.<ol>
<li>Alle PCR reacties met behulp van de volgende voorwaarden vervullen: denaturatie van 95 ° C gedurende 10 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s, 55 ° C gedurende 30 s en 60 ° C gedurende 30 s. Opmerking: Primerparen voor DIP en dpr genen zijn vermeld in tabel 1, en inleidingen voor olfactorische receptor genen staan in Hueston CE et al. 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. fixatie van de pop Antennal schijven en antennes voor Immunohistochemistry
Opmerking: Correctie van de weefsels in batches van 10-20 personen te zorgen dat de weefsels zijn vaste voor dezelfde hoeveelheid tijd. Minimaliseer de hoeveelheid tijd die de monsters in PBT (PBS met afwasmiddel blijven) vóór het overbrengen van hen naar een fixatief om te maximaliseren van de integriteit van de weefsels.
<ol><li>Verzamel de ontleed antennal schijven of pop antennes in een 200-µL PCR buis met 200 µL van 0,2% PBT op ijs om weefsel integriteit te handhaven, en om te voorkomen dat het monster van het plakken aan de muur van 200-µL PCR buizen die tot een onvolledige fixatie leiden zal. Opmerking: Pop antennes en antennal schijven kunnen worden moeilijk te zien zoals ze vrij doorzichtig zijn. Het is raadzaam om een dissectie bereik voor alle wassen stappen gebruiken om te voorkomen dat enig verlies van weefsel. Anderzijds kunnen 96-wells-platen voor Terasaki worden gebruikt voor de fixatie en kleuring voor het beste bijhouden van het weefsel.</li>
	<li>Fix de ontleed antennal schijf en antennal monsters van poppen in ongeveer 200 µL van 4% PFA (Paraformaldehyde) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor dit en daaropvolgende houd stappen, de buizen met de monsters op een nutator goed mengen de monsters in de oplossing. Vooruitgang naar stap 6.7.</li>
	<li>Voor de volwassen antenne, eerst de gehele kop ontleden en repareren in ongeveer 200 µL van 4% PFA (paraformaldehyde) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen van 3 x met 200 µL van 0,2% PBT voor elke 10 min. Houd de monsters op de nutator tijdens de incubatie.</li>
	<li>Ga terug naar de dissectie Microscoop voor een fijnere dissectie van de tweede antennal segment van de vaste hoofden. Met behulp van Tang te stabiliseren van het hoofd zachtjes trekken/snuifje uit het derde antennal segment van de tweede.</li>
	<li>Breng de ontleed derde antennal segmenten in ongeveer 200 µL van 4% PFA (paraformaldehyde) en corrigeren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen van 3 x met 200 µL van 0,2% PBT voor elke 10 min. Houd de monsters op de nutator tijdens de incubatie.</li>
	<li>Opslaan van de monsters bij 4 ° C of gaan direct met hele mount immunohistochemistry. Opmerking: De efficiëntie van de kleuring kan veranderen wanneer het antilichaam wordt gebruikt. Deze methode moet geschikt zijn voor minder overvloedige eiwit tags of zwakkere antilichamen. Nochtans, soms, wellicht het een optimalisering van het protocol (de identiteit of de fixeerspray hoeveelheid of de tijd van fixatie).</li>
</ol>

<ol><li>Barish, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory+receptor+neuron+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).</li>
<li>Pan, J. W., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/mechanisms-of-development-and-evolution-of-the-insect-olfactory-system-2168-9296.1000130.php?aid=21773">Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system.</a> Cell and Developmental Biology. 2, 130(2013).</li>
<li>Ramdya, P., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+olfactory+systems+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolving olfactory systems on the fly.</a> Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).</li>
<li>Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience%3A+a+history+lesson+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li>
<li>Knecht, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+combinations+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+mediate+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> eLife. 5, 44-60 (2016).</li>
<li>Enjin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Humidity sensing in Drosophila.</a> Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).</li>
<li>Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+endogenous+rotund+expression+and+function+in+developing+Drosophila.+olfactory+system+using+CRISPR-Cas9-mediated+protein+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).</li>
<li>Hueston, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modulatory+proteins+and+olfactory+receptor+signaling+in+the+refinement+and+maintenance+of+fruitless+expression+in+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons.</a> PLoS Biology. 14 (4), 1002443(2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+rules+of+precursor+specification+underlying+olfactory+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity.</a> Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+gene+regulatory+network+module+governing+olfactory+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity.</a> PLoS Genetics. 12 (1), 1005780(2016).</li>
<li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+transcriptional+parallelism+and+variation+in+the+developing+olfactory+system+of+Drosophila+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8804(2017).</li>
<li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+behavioral+and+transcriptional+variation+underlying+CO2+sensory+neuron+function+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila.</a> Fly. 11 (4), 239-252 (2017).</li>
<li>Stern, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transgenic+reagents+for+Drosophila+simulans%2C+D.+mauritiana%2C+D.+yakuba%2C+D.+santomea%2C+and+D.+virilis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol is een nuttige bron voor labs geïnteresseerd in het identificeren van de genetische en transcriptionele programma's actief in het ontwikkelen van Drosophila olfactorische weefsel, evenals een vergelijkende analyse van deze programma's over Drosophila soorten. Het is vooral nuttig als systemen-niveau transcriptionele profielen uit verschillende ontwikkelingsstadia nodig zijn als een primer voor toekomstige studies. Het protocol beschreven hier laat zien hoe stagen en isoleren olfactorische w...

De olfactorische systeem van Drosophila is een veelgebruikt systeem in developmental neurobiologie, systemen neurowetenschappen, evenals neurofysiologie, gedrag studies en gedrags evolutie1,2,3, 4. Drosophila olfactorische weefsels huis de olfactorische receptor neuronen (ORNs) die vluchtige chemische signalen naast hydro - en thermo-sensorische neuronen1,5,6te detecteren. Het algemene doel van dit manuscript is om aan te tonen hoe te stagen en ontleden ontwikkelen van pop en volwassen olfactorische weefsel in Drosophila soorten. De reden voor deze techniek is het genereren van monsters van verschillende pop stadia voor moleculaire en developmental analyses van de perifere olfactorische systeem, zoals RNAseq en kwantitatieve RT-PCR, daarnaast aan in vivo weefsel labeling technieken . Deze techniek kunnen vooral nuttig zijn om te identificeren dynamiek van transcriptionele profielen in de ontwikkelingslanden volwassen olfactorische systeem van niet -Drosophila melanogaster soorten, die niet over alle transgene reagentia voor celtype specifieke beschikken labelen en analyses. In dit manuscript, laten we zien hoe te ontleden antennal schijven en antennes van pop en volwassen Drosophila diersoorten. Eerst laten we zien hoe te identificeren Drosophila 0 h van de puparium formatie (APF, witte poppen of prepupae) voor ontwikkelingsstoornissen fasering en soortspecifieke veroudering. Vervolgens laten we zien hoe ontleden antennal schijven en het derde antennal segment; in het bijzonder hoe hen te distantiëren van de oog-schijf en tweede antennal segment voor de zuiverheid van de weefsel vereist voor RNAseq of RT-PCRs. De stadia in D. melanogaster beschreven in dit protocol ongeveer overeenkomen met de vooraf gedessineerde antennal schijf (prepupae), de selectie van precursoren van de antennal disc (8 h APF), het begin van de terminal differentiatie voor ORNs (40 h APF), en volwassen antenne. Tot slot geven we voorbeelden voor een kwantitatieve RT-PCR van volwassen antennes geïsoleerd met behulp van de methode, en voor in vivo immunohistochemistry. Deze methode kan worden gebruikt voor het genereren van monsters voor een RNA/DNA-analyse en voor immunohistochemistry op de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsels van verschillende soorten van Drosophila .

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate-buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>Verdunnen tot 1X in RNase vrij water</td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td>Air Gas</td><td>CD R200</td><td></td></tr><tr><td>Twee scherpe pincetten (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA isolatie oplossingen</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine emmer met ijs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 en P200 micropipetten en tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Microfuge buizen</td><td></td><td></td><td>Nuclease vrij kopen voor beste resultaten</td></tr><tr><td>0,2 mL PCR buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde poeder</td><td>Polysciences</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td>Verdun tot 0,2% v/v in 1X PBS</td></tr><tr><td>2" petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55mm filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Bevochtig met water en plaats in een petrischaal om poppen vochtig te houden</td></tr><tr><td>25 C incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>De-ioniseren H2O</td><td></td><td></td><td>Nuclease vrij kopen of behandelen met DEPC</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Siliconen Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Te gebruiken voor het maken van dissectiepads van Terizaki plaatdeksels.</td></tr><tr><td>MicroWell Mini Trays met deksels</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td>De deksels kunnen worden gebruikt om siliconen dissectiepads te maken</td></tr><tr><td>Konijn anti-GFP antilichaam</td><td>MBL international corpor</td><td>PM005</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Muis anti RAT CD2</td><td>AbD seroTec</td><td>MCA154RHDL</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>ADL195 (anti lamin, muis)</td><td>Dev studies hydoma ban</td><td>ADL195-s</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 488 geit anti-konijn IgG (H+L)</td><td>invitrogen</td><td>A11008</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Cy3 Geit Anti-Muis IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Triton X-100, Eiwitgraad Detergent, 10% Oplossing, Sterile-Gefilterd</td><td>CALBIOCHEM</td><td>648463</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Lab Rotator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Rotator</td></tr><tr><td>Nuclease Vrij Water</td><td>Growcells.com</td><td>NUPW-0125</td><td>Water</td></tr><tr><td>Light-Duty Tissue Wipers</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td>Voor het schoonmaken van dissectiematerialen</td></tr><tr><td>Superscript II</td><td>invitrogen</td><td>18064014</td><td>Omgekeerde Transcriptase&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAshredder (50)</td><td>RNA extractie</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td></tr><tr><td>Oligo(dT)12-18 Primer</td><td>RT</td><td>life technologies</td><td>18418012</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)</td><td>RNA extractie</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td></tr><tr><td>FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04913850001</td></tr><tr><td>FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&nbsp;</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>06402712001</td></tr><tr><td>LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04729692001</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td><td>qPCR</td><td>NEB</td><td>M0541S</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van immunohistochemical in drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

De olfactorische systeem van Drosophila is een veelgebruikt systeem in developmental neurobiologie, systemen neurowetenschappen, evenals neurofysiologie, gedrag en gedrags evolutie. Drosophila olfactorische weefsels huis de olfactorische receptor neuronen (ORNs), die vluchtige chemische signalen naast hydro - en thermo-sensoriële neuronen detecteren. In dit protocol beschrijven we de dissectie van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel van de volwassen Drosophila soorten. Eerst beschrijven we hoe stagen en leeftijd Drosophila larven, gevolgd door de dissectie van de antennal schijf van vroege pop stadia, gevolgd door de dissectie van de antennes van medio-pop podia en volwassenen. We tonen ook methoden waar de voorbereidingen in moleculaire technieken, zoals de RNA extractie voor qRT-PCR, RNAseq of immunohistochemistry kunnen worden gebruikt. Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere soorten Drosophila na soortspecifieke pop ontwikkelingstijd worden bepaald, en de respectieve fasen worden berekend voor passende veroudering.

De ontleed ontwikkelende olfactorische weefsels voor RNA extractie gevolgd door RT-PCR kan worden gebruikt voor het beoordelen van de genexpressie of via de protocollen van immunohistochemistry kan worden genomen om te bepalen zijn expressiepatroon, en de sub cellulaire lokalisatie van genen van belang. In deze sectie presenteren wij representatieve resultaten uit beide protocol. Figuur 1 is de vertegenwoordiger kwantitatieve RT-PCR de transcriptie van cel op...

Hier presenteren we een protocol om te stagen en ontleden olfactorische weefsel van Drosophila diersoorten te ontwikkelen. Het ontleed weefsel kan later worden gebruikt voor moleculaire analyses, zoals kwantitatieve RT-PCR (Reverse transcriptie-Polymerase Chain Reaction) of RNA sequencing (RNAseq), evenals in vivo analyses uitgevoerd, zoals immunohistochemistry of in situ hybridisatie.

Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Het algemene doel van het in scène zetten en dissekeren van zich ontwikkelende pupil- en volwassen periferie reukweefsels bij Drosophila-soorten is om monsters te genereren voor moleculaire en ontwikkelingsanalyses van de perifere reukweefsels. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkeling en evolutie van het reukstelsel, zoals de expressiedynamiekniveaus en patronen van specifieke genen in de zich ontwikkelende perifere reukweefsels. Door deze methode kunnen we inzichten verkrijgen in het zich ontwikkelende perifere reukstelsel bij Drosophila-soorten.Het kan ook worden toegepast op andere sensorische systemen, zoals de perifere smaak- en visuele systemen. Voor een RNA-sequencing-experiment, plan om tussen de 100 en 200 antenneschijven of antenne te verzamelen voor vier verschillende ontwikkelingsstadia. Voor immunohistochemie, plan om 10 tot 20 vliegen te dissekeren.Reinig alle materialen die bij de dissectie betrokken zijn met 70% ethanol. Reinig de materialen vervolgens verder met RNase-neutralisatoren. En maak alle oplossingen met nuclease-vrij of DEPC-behandeld water.Om poppen te verzamelen, bewaak de larven op intervallen v

preparing-developing-peripheral-olfactory-tissue-for-molecular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze techniek onthult de Drosophila embryonale neuromusculature voor immunohistochemie of elektrofysiologische opname. Het is handig voor het bestuderen van vroege gebeurtenissen in neuromusculaire ontwikkeling of het uitvoeren van elektrofysiologie in mutanten die niet kan uitkomen.

Oogsten en voorbereiden Drosophila Embryo&#39;s voor elektrofysiologische opname en andere procedures

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te...

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

De dendritische arborization sensorische neuronen van...

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

In this video, a live Drosophila fly is mounted in a tube for electrophysiological studies. Electrodes are positioned at the base of the sensillum to record specific neuronal responses to pheromones with the fly's olfactory receptor neurons.

Electrophysiological Recordings from Drosophila Sensilla in Response to Volatile Odorants

Hier beschrijven we het proces van gehele immunologische kleuring van Drosophila-antennes, waardoor we de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de diversificatie van olfactorische receptorneuronen (ORN's) beter kunnen begrijpen.

Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe geurstoffen met lage volatiliteit voor single-sensillum-opname van Drosophila- olfactorische receptorneuronen kunnen optreden die reageren op lang-keten-cutulaire feromonen.

Elektrofysiologische opname van<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in reactie op geurstoffen met lage volatiliteit

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Dit document stelt een chirurgische methode voor het ontleden van Drosophila pop netvlies samen met de protocollen voor de verwerking van weefsels voor RNA-extractie, immunohistochemistry en westelijke analyse.

Dissectie van de Drosophila pop netvlies voor Immunohistochemistry, westelijke analyse en RNA isolatie

Dit protocol beschrijft de dissectieprocedure, kweekconditie en live beeldvorming van een antenne-hersenexplantatiesysteem voor de studie van de olfactorische circuitassemblage.

Een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila

We beschrijven hier methoden voor het induceren en analyseren van olfactorische ervaring-afhankelijke remodellering van synaptische glomeruli van de antennekwab in de juveniele hersenen van Drosophila .

Ervaringsafhankelijke hermodellering van juveniele reukbare sensorische neuronen Synaptische connectiviteit van de hersenen in een kritieke periode in het vroege leven

Leer het prepareren van ontwikkelend perifeer olfactorisch weefsel van Drosophila voor moleculaire analyses. Deze methode maakt genexpressieonderzoek en immunohistochemie mogelijk voor inzicht in zintuiglijke ontwikkeling.

Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila

Meer video's verkennen