Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila
June 13th, 2018
Hier presenteren we een protocol om te stagen en ontleden olfactorische weefsel van Drosophila diersoorten te ontwikkelen. Het ontleed weefsel kan later worden gebruikt voor moleculaire analyses, zoals kwantitatieve RT-PCR (Reverse transcriptie-Polymerase Chain Reaction) of RNA sequencing (RNAseq), evenals in vivo analyses uitgevoerd, zoals immunohistochemistry of in situ hybridisatie.
Het algemene doel van het in scène zetten en dissekeren van zich ontwikkelende pupil- en volwassen periferie reukweefsels bij Drosophila-soorten is om monsters te genereren voor moleculaire en ontwikkelingsanalyses van de perifere reukweefsels. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkeling en evolutie van het reukstelsel, zoals de expressiedynamiekniveaus en patronen van specifieke genen in de zich ontwikkelende perifere reukweefsels. Door deze methode kunnen we inzichten verkrijgen in het zich ontwikkelende perifere reukstelsel bij Drosophila-soorten.
Het kan ook worden toegepast op andere sensorische systemen, zoals de perifere smaak- en visuele systemen. Voor een RNA-sequencing-experiment, plan om tussen de 100 en 200 antenneschijven of antenne te verzamelen voor vier verschillende ontwikkelingsstadia. Voor immunohistochemie, plan om 10 tot 20 vliegen te dissekeren.
Reinig alle materialen die bij de dissectie betrokken zijn met 70% ethanol. Reinig de materialen vervolgens verder met RNase-neutralisatoren. En maak alle oplossingen met nuclease-vrij of DEPC-behandeld water.
Om poppen te verzamelen, bewaak de larven op intervallen van 30 minuten. En verzamel de pop op het nuluur APF prepupale stadium. De larven zullen onbeweeglijk zijn en omringd door een zeer lichte, bijna witte kleurige pophuis.
In dit stadium, breng de larven over naar een kleine tweeduimpige petrischaal met een vochtige filterpapier. Voor dissecties in het nuluur APF-stadium, ga onmiddellijk verder met het oogsten van de prepupale antenne schijf. Anders, bedek de schaal met paraffinefolie en laat de dieren zich ontwikkelen bij 25 graden Celsius, totdat ze zich in de ontwikkelingsstadium van belang bevinden.
Om de ontwikkeling van poppen van andere Drosophila-soorten te bepalen, verzamel nuluur prepupale larven en sorteer ze in een verse buis. Noteer vervolgens het aantal dagen van prepupa tot volwassenheid. En schaal deze tijd eenvoudig naar de tijdlijn voor melanogaster.
Om te beginnen, koel 150 microliter RNA-isolatieoplossing af in een RNase-vrije 1,5 millimeter buis. Plaats vervolgens verschillende afzonderlijke druppels PBS op de dissectiepad. In elke druppel PBS, plaats één pop om te worden gedissecteerd.
Voor de nul tot twee uur poppen, gebruik pincetten om de mondhaken vast te grijpen en trek aan deze structuren om de hersenen en imaginaire schijven te scheuren en bloot te leggen. Voor de acht uur poppen, pel eerst voorzichtig de pophuis van het meest anterieure kwart van de pop, om het zich ontwikkelende hoofd bloot te leggen. Trek vervolgens het hoofd los bij de nekverbinding.
De antenneschijven bevinden zich in het hoofd in dit ontwikkelingsstadium. Breng nu de weefsels die de antenneschijven bevatten over naar een nieuwe druppel PBS. Identificeer vervolgens de oog-antenneschijf die verbonden is met de hersenen bij de optische lobben.
Gebruik pincetten om de oog-antenneschijf los te koppelen en breng deze over naar een nieuwe druppel. Bij acht uur poppen, omringen de oogschijven de antenneschijven en beide bevinden zich aan de voorkant van de hersenen. In de volgende druppel, verdeel de oog- en antenneschijven met behulp van pincetten.
Verzamel vervolgens met behulp van een P20 pipettip voorzichtig het gedissekteerde weefsel met een minimale hoeveelheid vloeistof. Deponeer de schijf in het RNA-isolatieoplossingsreagens en ga door met het dissekeren van antenneschijven totdat er minstens 100 zijn verzameld. Na 40 uur na popformatie heeft de volwassen antenne zijn uiteindelijke vorm aangenomen, maar is nog steeds transparant.
Ten minste 50 prepupae in dit stadium zijn nodig voor RNA-sequentiecollectie. Bereid eerst 150 microliter gekoelde RNA-isolatieoplossing voor. Plaats een pop in een druppel PBS op de dissectiepad.
Stabiliseer vervolgens het lichaam met een paar pincetten en verwijder voorzichtig de pophuis van het meest anterieure kwart om het hoofd bloot te leggen. Verwijder vervolgens voorzichtig het hoofd bij de nekverbinding. Breng nu voorzichtig het hoofd over in een schone druppel PBS.
Om het membraan rond het hoofd te verwijderen, pipet het hoofd op en neer in de PBS. Bij deze reiniging zou de antenne zichtbaar moeten worden. Koppel nu de antenne los van het membraan tussen het tweede en derde segment bij de segmentverbinding.
Het derde segment bevat de antenne reukreceptoren. Gebruik vervolgens een pipet om het gedissekteerde weefsel voorzichtig over te brengen naar de RNA-isolatieoplossing, waarbij de hoeveelheid overgedragen vloeistof wordt geminimaliseerd. Voor RNA-extractie, dissecteer volwassenen terwijl ze verdoofd zijn op een CO2-pad.
Behandel eerst het CO2-pad en de pincetten met RNase-remmers. Verdoof vervolgens de volwassenen en bekijk het pad onder een dissectiemicroscoop. Gebruik twee paar pincetten om het lichaam te stabiliseren en trek of knijp voorzichtig het derde antennesegment uit het tweede antennesegment om de weefsels te verzamelen.
Breng de antennes over in een buis met RNA-isolatieoplossing door de pincetten in de vloeistof te dompelen en los te laten. De antenne moet ondergedompeld zijn. Als de antenne aan de zijwand vast komt te zitten, zal de RNA voortijdig degraderen.
Na het verzamelen van voldoende antennes, ga verder met de RNA-extractie. Of bewaar de verzamelbuis op onbepaalde tijd op 80 graden Celsius. Als de antenne bedoeld is voor immunohistochemie, voer deze dissectie uit op een dissectiepad met de vlieg ondergedompeld in PBS met of zonder Triton.
Het gedissekteerde zich ontwikkelende reukweefsel kan worden gebruikt voor RNA-extractie gevolgd door RT-PCR om genexpressie te beoordelen. Bijvoorbeeld, de expressie van oppervlaktereceptor transcripten en reukreceptor transcripten kunnen op deze manier worden bestudeerd. Alternatief kunnen de weefsels worden gebruikt voor immunohistochemie om het expressiepatroon en de subcellulaire lokalisatie van genen van belang te bepalen.
Bijvoorbeeld, Rn-EGFP
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bepalen van het ontwikkelingsstadium en het dissekeren van zich ontwikkelend reukweefsel van Drosophila-soorten. Het gedissekteerde weefsel is geschikt voor verschillende moleculaire analyses, inclusief kwantitatieve RT-PCR en RNA-sequencing.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- De studie richt zich op de ontwikkeling van het perifere reuksysteem in Drosophila.
- Begrip van genexpressiedynamiek in reukweefsels is cruciaal voor inzichten in de ontwikkeling van sensorische systemen.
- Deze methode kan ook worden toegepast op andere sensorische systemen, zoals smaak en zicht.
- Dissectie van reukweefsels maakt gedetailleerde moleculaire en ontwikkelingsanalyses mogelijk.
Doel van het Onderzoek
- Om monsters te genereren voor moleculaire analyses van perifere reukweefsels.
- Om expressieniveaus en patronen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling te onderzoeken.
- Om inzichten te verschaffen in de evolutie van het reuksysteem.
Gebruikte Methoden
- Bepaling van het ontwikkelingsstadium en dissectie van zich ontwikkelend reukweefsel van Drosophila.
- Kwantitatieve RT-PCR voor genexpressieanalyse.
- RNA-sequencing voor uitgebreide moleculaire profilering.
- Immunohistochemie en in situ hybridisatie voor in vivo analyses.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle dissectie van reukweefsels voor moleculaire studies.
- Inzichten in genexpressiedynamiek in zich ontwikkelende weefsels.
- Mogelijke toepassingen in het bestuderen van andere sensorische systemen.
- Stablisering van een betrouwbaar protocol voor toekomstig onderzoek.
Conclusies
- Het protocol maakt gedetailleerde analyse van de ontwikkeling van het reuksysteem mogelijk.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van de evolutie van sensorische systemen.
- De methodologie kan worden aangepast voor andere sensorische modaliteiten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise staging and dissection of developing peripheral olfactory tissue in Drosophila, providing a scalable source of biologically relevant material for molecular profiling. By supporting gene expression analysis and immunohistochemical localization, it aids in target validation and mechanistic de-risking during early discovery. The method’s adaptability across Drosophila species and sensory systems enhances translational continuity and predictive confidence in pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through spatiotemporal gene expression profiling in developing olfactory tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking gene expression dynamics to subcellular localization via immunohistochemistry.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing mechanistic insights into sensory system development and evolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream molecular assays such as qRT-PCR and RNA-seq.
- Operational Value: Promotes assay standardization and reproducibility through staged tissue collection and RNase-free handling.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by supplying consistent tissue inputs for transcriptional profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage tissue preparation to preclinical validation through conserved sensory system biology.
- Biomarker Alignment: Facilitates identification of transcriptional profiles that may serve as predictive indicators in disease-relevant models.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by clarifying mechanistic ambiguity in neurodevelopmental pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying molecular-ready tissue for target identification and pathway analysis, with outputs feeding into lead identification and preclinical evaluation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via staged dissection and gene expression analysis.
- Screening: Enables assay readiness through standardized collection of antennal discs and antennae for RNA extraction.
- Analytics: Generates quantitative readouts from qRT-PCR and RNA-seq that allow cross-condition comparison of gene expression levels.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by enabling immunohistochemical assessment of protein expression patterns in developing tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue preparation platform applicable across multiple sensory systems and Drosophila species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in sensory system development.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability through defined staging and dissection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through translational biomarker alignment and pathway validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila staging, dissection, and molecular handling.
- Dependent on RNase-free environments, nuclease-free water, and proper cleaning with ethanol and RNase neutralizers.
- Necessitates cross-team standardization for consistent tissue collection across developmental stages.
- Requires adaptation of timing based on species-specific pupal development rates.
- Limited by tissue yield requirements, with 100–200 antennal discs recommended for RNA-seq and 10–20 antennae for immunohistochemistry.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Tissue Preparation and Developmental Staging of Drosophila melanogaster Pupa
2:24
Dissection of D. melanogasterAntennal Discs at 0 - 8 h APF
4:17
Dissection of D. melanogaster Mid-pupal Antennae
5:43
Dissection of D. melanogaster Adult Antennae
7:02
Results: Analyses of Prepared Tissues
8:02
Conclusion
