Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen
20 juni 2018
Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over niermetabolisme, zoals oxidatie van vetzuren, die nauw verbonden is met de ontwikkeling van renale fibrose en verschillende andere nefropathieën. Het grote voordeel van deze techniek is het gebruik van een high-throughput platform om stoffen te screenen die de mitochondriale bio-energetica in renale tubulaire epitheelcellen reguleren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van niermetabole ziekten omdat het een hoogwaardige screening van stoffen mogelijk maakt die de mitochondriale stofwisseling in nierepitheelcellen reguleren.
Om de met collageen beklede 60-millimeter Petri-schalen voor te bereiden, voegt u twee milliliter van een vooraf gefilterde 20-millimolaire azijnzuur toe, gevolgd door 35 microliter collageen I-oplossing in elke schaal. Bewaar de plaat vervolgens een uur op kamertemperatuur, laat hem drogen en stel hem bloot aan UV. Was vervolgens de azijnzuurresten af met PBS. Voer drie spoelbeurten uit.
Bewaar de schaal vervolgens in een koolstofdioxidevrije celkweekincubator op 37 graden Celsius. Nadat de muis klaar is voor de operatie, verwijdert u het haar van de borst en buik met een ontharingscrème. Desinfecteer vervolgens de huid met jodium en veeg de jodiumresten weg.
Maak vervolgens een incisie om de buikholte te openen en leg het hart en de nieren bloot. Stel nu een perfusiepomp in op 32 milliliter per minuut en verwijder eventuele luchtbellen in de slang voordat u met de perfusie begint. Gebruik een 27-gauge naald aan het einde van de lijn.
Om door te gaan, steekt u een naald door het hart via de hartspits in de linker ventrikel. Zodra de buffer het hart vult, maakt u een gat in het rechter atrium om een uitlaat voor de perfusiebuffer te creëren. Schakel vervolgens over naar de verteringsbuffer en verlaag de pompsnelheid iets tot 30 milliliter per minuut voor de vertering.
Nadat 20 milliliter verteringsbuffer is geperfundeerd, verwijdert u beide nieren voor de isolatie van de tubulaire cellen. Om de geoogste nieren te verwerken, verwijdert u eerst de nierschalen en merg. Snijd vervolgens beide nieren in kleine stukjes en incubeer ze in 10 milliliter verteringsbuffer in een oven van 37 graden Celsius met zacht draaien gedurende vijf minuten.
Na de vertering verwijdert u eventueel onverteerd weefsel door de buffer door een 70-micronfilter te laten lopen. Nadat u het verteerde weefsel hebt verzameld, voegt u 10 milliliter kweekmedium toe om de vertering te stoppen. Centrifugeer vervolgens de gefilterde weefselsuspensie bij 50 g gedurende vijf minuten om de tubulaire cellen te pellen.
Breng vervolgens het supernatant over in een nieuwe buis, voeg vijf milliliter kweekmedium toe en herhaal de centrifugatie om eventuele resterende tubulaire cellen te verzamelen. Herstel het eerste pellet op in 20 milliliter kweekmedium en centrifugeer het bij 50 g gedurende vijf minuten om de verzamelde cellen verder te zuiveren. Gooi het supernatant weg.
Breng vervolgens beide pellets op in 10 milliliter kweekmedium. Tel vervolgens de levende cellen met behulp van trypanblauwkleuring. Zaai vervolgens maximaal 10 miljoen cellen op een 60-millimeter met collageen beklede schaal en laat de tubulaire cellen een nacht lang hechten.
Voor het begin zaait u P1-tubulaire cellen in aantallen van 40.000 in de putjes van een vers bereide 96-well microplaat bekleed met collageen. Gebruik 100 microliter kweekmedium per putje. Optimalisatie van celdichtheid en stofconcentratie in de extracellulaire flux assay is cruciaal voor een succesvol experiment.
We raden een piloot titratie-experiment aan om de optimale celdichtheid en stofconcentratie te identificeren. Hydrateer vervolgens de sensorcartridge. Til eerst de sensorcartridge op en vul elk putje van de plaat met 200 microliter kalibratie-oplossing.
Plaats vervolgens de cartridge opnieuw om de sensoren onder te dompelen en incubeer de assemblage een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag zuigt u het oude medium af en vervangt u het door 175 microliter glucose- of vetzuuranalysemedium. Gaat u dan door met incuberen gedurende een uur zonder koolstofdioxide.
Tijdens de celincubatie laadt u poort A van de cartridge met 25 microliter oligomycine, poort B met FCCP, poort C met rotenon/antimycin A en laadt u poort D en alle andere poorten met water. Bewaar de cartridge vervolgens in de koolstofdioxidevrije incubator totdat de setup klaar is voor kalibratie. Ga verder door de extracellulaire flux-analyzer en de controller in te schakelen.
Open vervolgens de Analyzer Software, kies een standaardtest en druk op de Assay Wizard-optie. Kies vervolgens onder het tabblad Compounds de verbindingen toe aan de juiste poorten. Kies onder het tabblad Background Correction de putjes die geen cellen bevatten.
Gebruik vervolgens het tabblad Groups and Labels om de experimentele groepen te labelen. Stel vervolgens onder het tabblad Protocol de juiste mix- en meetcycli in met behulp van de beschikbare commando's. Deze instellingen worden aangegeven in het tekstprotocol en eenmaal ingevoerd, slaat u de sjabloon op voor toekomstig gebruik.
Druk nu op End Wizard om door te gaan. Druk nu op Start om met de kalibratie te beginnen. De analyzer werpt vervolgens de plaathouder uit en vraagt om de cartridgeplaat te plaatsen.
Dit kalibratieproces duurt 20 tot 25 minuten om te voltooien. Zodra het systeem is gekalibreerd, drukt u op de prompt-opdracht om de kalibratieplaat te verwisselen voor de celplaat en gaat u verder met de run. Wanneer de run is voltooid, slaat u de OCR-gegevens op en verwijdert u de plaat uit de analyzer.
Voeg nu Hoechst toe aan elk van de testputjes en incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Tel vervolgens de cellen met 355-nanometer excitatie en 460-nanometer emissie, en normaliseer de OCR-gegevens op het aantal cellen. In dit protocol werd een heterogene populatie niercellen, onvolledig verteerde tubuli en ander weefselafwisselend op met collageen beklede platen gekweekt.
De dag na isolatie werd het k
Overzicht
Dit protocol biedt een kosteneffectieve aanpak om primaire renale tubulaire cellen van muizen te isoleren en te karakteriseren, die vervolgens kunnen worden subgecultiveerd om renale biologische functies ex vivo te beoordelen, inclusief mitochondriale bioenergetica.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Nefrologie
- Celbiologie
- Metabolisch onderzoek
Achtergrond
- Deze methode beantwoordt belangrijke vragen over niermetabolisme.
- Het richt zich op vetzuuroxidatie in verband met renale fibrose en nefropathieën.
- De techniek maakt high-throughput screening van verbindingen mogelijk.
- Het is belangrijk voor therapie bij renale metabole ziekten.
Doel van het onderzoek
- Om renale tubulaire cellen te isoleren en te karakteriseren.
- Om mitochondriale bioenergetica in deze cellen te beoordelen.
- Om high-throughput screening van verbindingen die het renale metabolisme beïnvloeden mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van collageen-gecoate schalen voor celcultuur.
- Chirurgische isolatie van muizennieren voor extractie van tubulaire cellen.
- Gebruik van verteringsbuffers en centrifugatie voor celzuivering.
- Extracellulaire fluxanalyse om mitochondriale functie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en cultivatie van renale tubulaire cellen.
- Cellen bereikten 80-90% confluency binnen vijf dagen.
- High-throughput screening mogelijk gemaakt voor mitochondriale metabolisme verbindingen.
- Protocol zorgt voor reproduceerbare resultaten in niercelstudies.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van renale tubulaire celfuncties.
- Het biedt inzicht in niermetabolisme en mogelijke therapieën.
- High-throughput mogelijkheden verhogen de efficiëntie van het onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput extracellular flux analysis of primary mouse renal tubular epithelial cells enables robust interrogation of mitochondrial bioenergetics, a critical determinant in renal disease pathogenesis. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for metabolic pathways implicated in chronic kidney disease. The protocol's scalability and reproducibility position it as a foundational capability for renal metabolism-focused drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of mitochondrial function in disease-relevant renal cell populations.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying fatty acid oxidation and metabolic flux.
- Facilitates functional target validation for pathways linked to renal fibrosis and nephropathies.
- Provides predictive confidence for advancing metabolic targets in renal disease pipelines.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput screening of compounds affecting mitochondrial bioenergetics.
- Optimizes assay conditions for cell density and compound concentration, ensuring reproducibility.
- Generates quantitative outputs (OCR) for reliable compound evaluation and comparison.
- Enables platform reuse for iterative screening and lead optimization cycles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo metabolic readouts with disease-relevant renal cell models.
- Supports translational biomarker development by linking mitochondrial function to renal pathology.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of metabolic interventions.
- Reduces biological risk by enabling functional assessment prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both target validation and compound screening in renal metabolism research.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial respiration and fatty acid oxidation to clarify metabolic pathway involvement in renal disease.
- Screening: Provides high-throughput, reproducible assay conditions for compound evaluation in primary renal cells.
- Analytics: Delivers normalized OCR measurements for robust statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Bridges ex vivo metabolic findings to preclinical models of chronic kidney disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for ongoing renal metabolism research and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metabolic target selection and validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in renal cell-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in renal drug discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic targets and compounds for renal indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and mitochondrial functional assays.
- Needs access to high-throughput extracellular flux analyzers and compatible software.
- Demands rigorous standardization of cell density and compound concentrations for reproducibility.
- Adaptation may be needed for other species or renal cell subtypes.
- Careful tracking of assay variables is essential to avoid experimental failure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Preparing Collagen I Plates
1:31
Perfusion, Digestion and Harvesting Kidneys from Mice
2:36
Tissue Processing and Primary Tubular Cells Isolation
4:11
Mitochondria Bioenergetics Assay
7:26
Results: Renal Tubular Epithelial Cell (TEC) Morphology and Metabolism
9:04
Conclusion
