Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie
May 24th, 2018
Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van plant-microbe interacties, zoals hoe pathogene bacteriën de optimale conditie van hun gastheerplantcellen kunnen verstoren door gebruik te maken van eiwitten die effectoren worden genoemd, die in plantencellen worden uitgescheiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het bacteriële effector-eiwit wordt tot expressie gebracht in de bacteriële cel met behulp van hun natuurlijke expressiesysteem en vervolgens wordt afgeleverd naar de plantcel via het bacteriële type III secretiesysteem. Om deze procedure te beginnen, bereidt u Nicotiana benthamiana en Arabidopsis thaliana planten voor zoals beschreven in het tekstprotocol.
Gebruik vervolgens standaard elektroporatie om het plasmide dat een effectorgen draagt en gefuseerd is met de sfGFP11-tag, te transformeren naar Pseudomonas syringae pathovar tomato CUCPB5500-stam. Het optimale tijdstip en expressieniveau, of de reconstitutie van sfGFP, hangt echt af van uw effector-eiwit. We raden aan om de in- of observatiecondities te optimaliseren.
Verspreid de getransformeerde bacteriële cellen voorzichtig over het oppervlak van King's B Agar platen. Bewaar de platen vervolgens twee dagen op 28 graden Celsius. Daarna, inoculeer een bacteriekolonie in King's B vloeibaar medium met een antibioticum dat geschikt is voor de vector.
Bewaar de volgende dag overnacht bij 28 graden Celsius met schudbeweging bij 200 rpm. Voeg autoclaved glycerol toe aan het geïnoculeerde medium tot een eindconcentratie van 50%. Bewaar bij min 80 graden Celsius. Om te beginnen, transformeer het plasmide in Agrobacterium tumefaciens stam GV3101-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Laat de cellen groeien op aangevuld LB Agar-medium bij 28 graden Celsius gedurende twee dagen. Gebruik een enkele kolonie van het LB Agar-medium om 5 milliliter aangevuld vloeibaar LB-medium te inoculeren. Laat vervolgens de cellen overnacht groeien bij 28 graden Celsius met schudbeweging bij 200 rpm.
Centrifugeer vervolgens bij 3000 G gedurende 10 minuten om de cellen te oogsten. Giet het supernatant af en suspendeer het pellet opnieuw in 1 milliliter vers bereid infiltratiebuffer. Bepaal de hoeveelheid Agrobacterium-cellen met behulp van een spectrofotometer door de optische dichtheidswaarde te meten bij een absorptie van 600 nanometer.
Gebruik vervolgens infiltratiebuffer om de OD 600 van de bacteriële cellen aan te passen naar 0,5. Laat de cultuur een-tot-vijf uur op een zachte schudmachine bij kamertemperatuur staan. Om de bladeren te infiltreren, gebruik een 10-microliter pipettepunt om een gat in het midden van elk blad te prikken.
Gebruik een naaldloze 1-milliliter spuit om voorzichtig 500 microliter van de Agrobacterium-suspensie in de adaxiale kant van het blad te injecteren. Veeg de resterende bacteriële suspensie van de bladeren en markeer de grens van het geïnfiltreerde gebied. Bewaar de geïnfiltreerde planten in een kweekkamer bij 25 graden Celsius en 60% vochtigheid gedurende twee dagen.
Streek de getransformeerde Pseudomonas-stam van de glycerolvoorraad op King's B Agar-medium met het juiste antibioticum. Bewaar de cultuur twee dagen op 28 graden Celsius. Inoculeer een lus van Pseudomonas-cellen in mannitol-glutamaat vloeibaar medium.
Bewaar de cultuur overnacht bij 28 graden Celsius met schudbeweging bij 200 rpm. Centrifugeer vervolgens bij 3000 G gedurende 10 minuten om de cellen te oogsten. Giet het supernatant af en suspendeer het pellet opnieuw in 10-millimolaire magnesiumchlorideoplossing.
Pas vervolgens de optische dichtheid aan op 0,02 voor Nicotiana benthamiana-bladeren en op 0,002 voor Arabidopsis-bladeren. Voor de Nicotiana benthamiana-bladeren, infiltreer de Pseudomonas-suspensie in hetzelfde gebied waar de Agrobacterium twee dagen eerder is geïnfiltreerd. Voor de transgene Arabidopsis, infiltreer de Pseudomonas-suspensie in twee vier weken oude korte dag-gegroeide bladeren.
Snij tenslotte een bladschijf uit voor de met Pseudomonas geïnfiltreerde bladeren. Gebruik op specifieke tijdstippen na de infiltratie van Pseudomonas een confocale laserscanning-systeem om twee, twee vierkante centimeter grote bladschijven van de enkele plant te beeld. Observeer de cellen weg van het infiltratiegat om dode cellen die door wonden zijn gedood te vermijden.
Translocase effectoren van de bacteriën zijn slechts in zeer kleine hoeveelheden aanwezig. Daarom kunt u het laservermogen verhogen en een fluorescentie-emissie verkrijgen om een fluorescent signaal te detecteren. Overdrijf echter niet om het opvangen van valse signalen van autofluorescentie van de plantencellen te voorkomen.
In deze studie wordt een fluorescentie-eiwit-gebaseerde aanpak gebruikt om effectoren te monitoren die door bacteriën in gastheercellen worden uitgescheiden. Een confocale laserscan van een Nicotiana benthamiana-blad drie uur na infectie wordt hier getoond. Cellen die geoptimaliseerd sfGFP met alleen AvrB tot expressie brengen, vertonen geen enkel fluorescent signaal.
GFP-signalen worden echter gezien van de geïnfecteerde cellen die AvrB, sfGFP11 bevatten. Dit verifieert dat het AvrB sfGFP11-complex wordt gereconstitueerd met geoptimaliseerd sfGFP in het cytosol en vervolgens transloceert naar het plasmamembraan. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de plantmaterialen gezond te houden en verse bacteriecultuur voor actieve cellen te bereiden.
Na dit proces kunnen andere methoden zoals harsbloedanalyse worden gebruikt om valse translatiemodificatie van bacteriële effector-eiwitten in plantencellen tijdens plantenimmuniteitsreacties te begrijpen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de type III effector-levering in geïnfecteerde plantencellen visualiseert. Plantmaterialen en bacterieculturen moeten worden weggegooid volgens de criteria van uw lab voor biogevaarlijk afval en vergeet niet uw PPE te dragen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een geoptimaliseerd gesplitst superfolder GFP-systeem om bacteriële effectoren te visualiseren die worden uitgescheiden in gastheerplantcellen. Deze methode gaat in op uitdagingen geassocieerd met fluorescente eiwitcompatibiliteit en het type-III secretiesysteem.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plant-microbe interacties
- Pathogene bacteriën
- Fluorescente eiwitvisualisatie
Achtergrond
- Pathogene bacteriën scheiden effectoren af om gastheerplantcellen te manipuleren.
- Traditionele fluorescente eiwitmethoden hebben compatibiliteitsproblemen.
- Het type-III secretiesysteem is cruciaal voor de aflevering van effectoren.
- Optimaliseren van visualisatietechnieken is essentieel voor onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het visualiseren van bacteriële effectoren in plantencellen.
- Om het begrip van plant-microbe interacties te verbeteren.
- Om een protocol te bieden voor onderzoekers in het veld.
Gebruikte methoden
- Bereiding van Nicotiana benthamiana en Arabidopsis thaliana planten.
- Elektroporatie om plasmiden met effectorgenen te transformeren.
- Gebruik van sfGFP11 tag voor visualisatie van effectoren.
- Optimalisatie van inoculatie- en observatieomstandigheden op basis van effectoreiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van bacteriële effectoren in gastheercellen.
- Gedemonstreerde compatibiliteit van het gesplitste superfolder GFP-systeem.
- Biedt inzichten in de timing en expressieniveaus voor optimale resultaten.
- Een protocol vastgesteld voor toekomstig onderzoek in plant-microbe interacties.
Conclusies
- Het geoptimaliseerde gesplitste superfolder GFP-systeem is effectief voor het bestuderen van effectoren.
- Deze methode kan onderzoek naar plant-pathogeen interacties bevorderen.
- Verdere optimalisatie kan visualisatieresultaten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing effector protein delivery from bacterial pathogens into host cells is critical for understanding virulence mechanisms and identifying therapeutic targets in plant-microbe interactions. The split sfGFP system enables direct observation of translocated effectors via the native type III secretion system, overcoming fluorescent protein compatibility barriers. This approach supports target validation by confirming subcellular localization and dynamics of pathogen-derived proteins in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing effector translocation and host compartmentalization in real time.
- Operational Value: Uses native bacterial expression and secretion systems to preserve effector functionality and avoid artifacts from heterologous expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts at specific organelles, supporting assay standardization for effector localization studies.
- Operational Value: Compatible with confocal imaging platforms, allowing scalable screening of effector variants or mutants across plant models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights into effector targeting of plasma membrane and cytosol, informing mechanistic de-risking of virulence factors.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow from bacterial culture to plant infection and imaging, enabling cross-functional collaboration between microbiology and plant biology teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where effector delivery and host targeting must be confirmed prior to lead identification or mechanistic screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of effector function by linking secretion to subcellular localization in live plant cells.
- Screening: Enables assay readiness through standardized reconstitution of split GFP upon effector delivery, providing a binary readout of translocation success.
- Analytics: Generates spatially resolved fluorescence signals that allow comparison of effector variants or mutants in planta.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating effector activity in a native host context, supporting biomarker-aligned pathway analysis.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to other effector-organelle pairs by swapping sfGFP11-effector and organelle-targeted sfGFP1-10OPT constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in effector functionality by confirming delivery and localization without reliance on surrogate systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized bacterial preparation, infiltration, and imaging conditions across laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by validating effector behavior in a native infection model.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of effector-targeted strategies by confirming subcellular activity in planta.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, plant infiltration, and confocal microscopy.
- Dependent on fluorescence detection instrumentation and spectral separation capabilities to distinguish signal from plant autofluorescence.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial culture conditions, OD adjustment, and infiltration timing for reproducible results.
- Must account for variation in effector expression, stability, and secretion efficiency across different pathogen strains and host species.
- Limited by low effector translocation levels, requiring optimization of laser power and gain to avoid false signals while maintaining sensitivity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Preparation of Plant Materials and Pseudomonas Culture
2:09
Transient Expression of Organelle-targeted sfGFP1-10OPT in N. benthamiana
3:58
Inoculation of Pseudomonas and Observation of sfGFP Signal via Confocal Microscopy
5:46
Results: Split Superfolder Fluorescent Protein System: A Useful Tool to Examine the Dynamics of Effectors in Host Plants
6:32
Conclusion
