Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van plant-microbe interacties, zoals hoe pathogene bacteriën de optimale conditie van hun gastheerplantcellen kunnen verstoren door gebruik te maken van eiwitten die effectoren worden genoemd, die in plantencellen worden uitgescheiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het bacteriële effector-eiwit wordt tot expressie gebracht in de bacteriële cel met behulp van hun natuurlijke expressiesysteem en vervolgens wordt afgeleverd naar de plantcel via het bacteriële type III secretiesysteem. Om deze procedure te beginnen, bereidt u Nicotiana benthamiana en Arabidopsis thaliana planten voor zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik vervolgens standaard elektroporatie om het plasmide dat een effectorgen draagt en gefuseerd is met de sfGFP11-tag, te transformeren naar Pseudomonas syringae pathovar tomato CUCPB5500-stam. Het optimale tijdstip en expressieniveau, of de reconstitutie van sfGFP, hangt echt af van uw effector-eiwit. We raden aan om de in- of observatiecondities te optimaliseren.

Verspreid de getransformeerde bacteriële cellen voorzichtig over het oppervlak van King's B Agar platen. Bewaar de platen vervolgens twee dagen op 28 graden Celsius. Daarna, inoculeer een bacteriekolonie in King's B vloeibaar medium met een antibioticum dat geschikt is voor de vector.

Bewaar de volgende dag overnacht bij 28 graden Celsius met schudbeweging bij 200 rpm. Voeg autoclaved glycerol toe aan het geïnoculeerde medium tot een eindconcentratie van 50%. Bewaar bij min 80 graden Celsius. Om te beginnen, transformeer het plasmide in Agrobacterium tumefaciens stam GV3101-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Laat de cellen groeien op aangevuld LB Agar-medium bij 28 graden Celsius gedurende twee dagen. Gebruik een enkele kolonie van het LB Agar-medium om 5 milliliter aangevuld vloeibaar LB-medium te inoculeren. Laat vervolgens de cellen overnacht groeien bij 28 graden Celsius met schudbeweging bij 200 rpm.

Centrifugeer vervolgens bij 3000 G gedurende 10 minuten om de cellen te oogsten. Giet het supernatant af en suspendeer het pellet opnieuw in 1 milliliter vers bereid infiltratiebuffer. Bepaal de hoeveelheid Agrobacterium-cellen met behulp van een spectrofotometer door de optische dichtheidswaarde te meten bij een absorptie van 600 nanometer.

Gebruik vervolgens infiltratiebuffer om de OD 600 van de bacteriële cellen aan te passen naar 0,5. Laat de cultuur een-tot-vijf uur op een zachte schudmachine bij kamertemperatuur staan. Om de bladeren te infiltreren, gebruik een 10-microliter pipettepunt om een gat in het midden van elk blad te prikken.

Gebruik een naaldloze 1-milliliter spuit om voorzichtig 500 microliter van de Agrobacterium-suspensie in de adaxiale kant van het blad te injecteren. Veeg de resterende bacteriële suspensie van de bladeren en markeer de grens van het geïnfiltreerde gebied. Bewaar de geïnfiltreerde planten in een kweekkamer bij 25 graden Celsius en 60% vochtigheid gedurende twee dagen.

Streek de getransformeerde Pseudomonas-stam van de glycerolvoorraad op King's B Agar-medium met het juiste antibioticum. Bewaar de cultuur twee dagen op 28 graden Celsius. Inoculeer een lus van Pseudomonas-cellen in mannitol-glutamaat vloeibaar medium.

Bewaar de cultuur overnacht bij 28 graden Celsius met schudbeweging bij 200 rpm. Centrifugeer vervolgens bij 3000 G gedurende 10 minuten om de cellen te oogsten. Giet het supernatant af en suspendeer het pellet opnieuw in 10-millimolaire magnesiumchlorideoplossing.

Pas vervolgens de optische dichtheid aan op 0,02 voor Nicotiana benthamiana-bladeren en op 0,002 voor Arabidopsis-bladeren. Voor de Nicotiana benthamiana-bladeren, infiltreer de Pseudomonas-suspensie in hetzelfde gebied waar de Agrobacterium twee dagen eerder is geïnfiltreerd. Voor de transgene Arabidopsis, infiltreer de Pseudomonas-suspensie in twee vier weken oude korte dag-gegroeide bladeren.

Snij tenslotte een bladschijf uit voor de met Pseudomonas geïnfiltreerde bladeren. Gebruik op specifieke tijdstippen na de infiltratie van Pseudomonas een confocale laserscanning-systeem om twee, twee vierkante centimeter grote bladschijven van de enkele plant te beeld. Observeer de cellen weg van het infiltratiegat om dode cellen die door wonden zijn gedood te vermijden.

Translocase effectoren van de bacteriën zijn slechts in zeer kleine hoeveelheden aanwezig. Daarom kunt u het laservermogen verhogen en een fluorescentie-emissie verkrijgen om een fluorescent signaal te detecteren. Overdrijf echter niet om het opvangen van valse signalen van autofluorescentie van de plantencellen te voorkomen.

In deze studie wordt een fluorescentie-eiwit-gebaseerde aanpak gebruikt om effectoren te monitoren die door bacteriën in gastheercellen worden uitgescheiden. Een confocale laserscan van een Nicotiana benthamiana-blad drie uur na infectie wordt hier getoond. Cellen die geoptimaliseerd sfGFP met alleen AvrB tot expressie brengen, vertonen geen enkel fluorescent signaal.

GFP-signalen worden echter gezien van de geïnfecteerde cellen die AvrB, sfGFP11 bevatten. Dit verifieert dat het AvrB sfGFP11-complex wordt gereconstitueerd met geoptimaliseerd sfGFP in het cytosol en vervolgens transloceert naar het plasmamembraan. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de plantmaterialen gezond te houden en verse bacteriecultuur voor actieve cellen te bereiden.

Na dit proces kunnen andere methoden zoals harsbloedanalyse worden gebruikt om valse translatiemodificatie van bacteriële effector-eiwitten in plantencellen tijdens plantenimmuniteitsreacties te begrijpen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de type III effector-levering in geïnfecteerde plantencellen visualiseert. Plantmaterialen en bacterieculturen moeten worden weggegooid volgens de criteria van uw lab voor biogevaarlijk afval en vergeet niet uw PPE te dragen.