2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Deze methode kan niet alleen worden gebruikt om sleutelvraagstukken in fundamenteel onderzoek aan te pakken, maar draagt ook bij aan de medische, farmaceutische en biotechnologiesectoren door nieuwe kleine moleculaire liganden van essentiële eiwitten te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het parallelle analyse van eiwit- en metabolische partners van het eiwit van keuze onder nauwgezet in vivo-omstandigheden mogelijk maakt. Deze methode helpt bij het opsporen van interacterende moleculen zonder beperkt te zijn tot vooraf geselecteerde liganden.

Hoewel deze methode werd ontwikkeld voor planten, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals HeLa-cellen, E.coli en S.Cerevisiae. Om te beginnen, bereid MSMO-medium en pas de pH aan tot 5,7 met één molair kaliumhydroxide. Steriliseer vervolgens de oplossing gedurende 15 minuten bij 121 graden Celsius.

Voeg de supplementen toe aan het medium vlak voor het begin van het experiment. Kweek vervolgens transgene PSBL Arabidopsis thaliana-celcultuur in 50 milliliter MSMO-medium in een 100 milliliter fles. Plaats vervolgens de fles op een orbitale platform shaker en schud de cellen voorzichtig met 130 rpm bij 20 graden Celsius in het licht.

Elke zeven dagen, subcultureer de cellen in vers medium in een oplossing van een tot tien. Gebruik vervolgens een glazen trechter met een nylon gaas op een kegelkolf, aangesloten op een vacuümpomp om de cellen te oogsten tijdens de logaritmische groeifase. Wikkel vervolgens de gedroogde cellen in aluminiumfolie en vries ze in in vloeibare stikstof.

Gebruik een voorgekoelde mixermolen, ingesteld op een trillingsfrequentie van 20 hertz. Homogeniseer het geoogste en bevroren plantencelmteriaal gedurende twee minuten tot een fijn poeder. Verdeel vervolgens drie gram van het gemalen poeder per monster met vloeibare stikstof, voorgekoeld apparatuur om bevriezing te voorkomen.

Gebruik vervolgens een met vloeibare stikstof voorgekoelde mortel om het gemalen poeder te tritureren met drie milliliter ijskoud lysisbuffer totdat het ontdooit. Verdeel het ontdooide monster onmiddellijk in twee milliliter microcentrifugebuisjes. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 20.817 g bij vier graden Celsius om de cellulaire deeltjes te verwijderen.

Terwijl het monster wordt gecentrifugeerd, verdeel 100 microliter IgG sepharosekorrels per monster. Voeg een milliliter lysisbuffer toe en suspendeer de korrels opnieuw door te vortexen. Draai gedurende drie seconden bij 2.000 g en gooi de lysisbuffer weg.

Suspendeer vervolgens de korrels in 400 microliter lysisbuffer. Na centrifugatie, breng drie milliliter van het heldere plantenlysaat over in een 15 milliliter kegelcentrifugebuis. Voeg de voorgeëquilibreerde korrels toe aan het plantenlysaat en incubeer het mengsel gedurende één uur op een draaiende wiel bij vier graden Celsius.

Breng het mengsel over in een spuit verbonden met een lock-lockdop op een spinkolom met een 35 micrometer poriegroottefilter op de vacuümmanifold. Laat het lysaat door de eenheid lopen door de vacuümpomp in te schakelen met lichte druk om schade aan de korrels te voorkomen. Het ongebonden lysaat wordt afgevoerd naar de afvalstation op de basis van de manifold en de eiwitcomplexen, gebonden aan de korrels, blijven op het filter.

Zodra de spuit leeggelopen is van het cellysaat, voeg 10 milliliter wasbuffer toe om de korrels te wassen. Voeg vervolgens één milliliter elutiebuffer toe om de tweede wasstap uit te voeren. Verwijder nu de spuit en lock-lockdop.

Sluit de onderste dop op de kolom en voeg 400 microliter van de elutiebuffer met 50 eenheden van de verbeterde vorm van tabaksspikkelvirus, protease, toe aan de korrels. Plaats de kolom op een tafelshaker, ingesteld op 1.000 rpm gedurende 30 minuten bij 16 graden Celsius. Voeg vervolgens nog eens 50 eenheden van de protease toe aan de kolom en incubeer het mengsel op de shaker zoals in de vorige stap.

Verwijder vervolgens de onderste dop en plaats de kolom in een twee milliliter microcentrifugebuisje. Centrifugeer gedurende één minuut bij 20.817 g om het eluaat te verzamelen en ga verder met eiwit- en metabolietenextractie. Om de extractie te beginnen, voeg één milliliter van drie tot één op één MTBE methanol water oplosmiddel toe aan het eluaat.

Keer de buis om om het monster te mengen. Voeg vervolgens 0,4 milliliter van één op drie methanol water oplossing toe aan het mengsel en keer de buis om om het monster te mengen. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende twee minuten bij 20.817 g bij kamertemperatuur om fasescheiding mogelijk te maken.

Gebruik een manuele vloeistofbeveiligingspijp van één milliliter om de bovenste fase met lipiden te verwijderen. Voeg vervolgens 0,2 milliliter methanol toe en keer de buis om om het monster te mengen. Centrifugeer gedurende twee minuten bij 20.817 g bij kamertemperatuur en verzamel de polaire fase in een nieuwe buis voor metabolietenmetingen.

Laat ongeveer 50 microliter van de polaire fase op de bodem van de buis achter om losraken van de eiwitpellet te voorkomen. Droog vervolgens de buis met de polaire fase in een centrifugaal verdamper gedurende de nacht. Droog de eiwitpelletbuisjes gedurende 30 tot 60 minuten om overdrogen te voorkomen.

Met behulp van eenstaps affiniteitszuivering, samen met massaspectrometrie, zijn eiwit-eiwit en eiwit-metabolieteninteracties in transgene Arabidopsis thaliana-celculturen geïdentificeerd. Celculturen die NDPK1 tot expressie brengen, vertonen significante verrijking in valine-leucine, isoleucine glutamaat, leucine isoleucine en isoleucine fenylalanine in vergelijking met lege vector, NDPK2 en NDPK3 monsters. Om naar bekende eiwit-eiwit en eiwit-metabolieteninteracties te zoeken, worden 13 eiwitten en vier dipeptiden die met NDPK1 mee-elueren, vergeleken met de stitch-database.

De belangrijkste associaties worden gezien tussen APX1 ortholog en de aldehyde dehydrogenase familie