Name: Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Leer hoe interneuron-voorlopercellen uit verschillende hersengebieden van postnatale muizen worden geoogst en getransplanteerd naar leeftijdsgelijke ontvangers. Deze techniek maakt analyse mogelijk van hoe omgevingsveranderingen de differentiatie en rijping van neuronen beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health (K99MH104595) en de NICHD intramurale research program aan T.J.P. Wij danken de Gord Fishell, wiens lab deze aanpak was oorspronkelijk gevestigd.

<ol><li>Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+as+a+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Epilepsy as a neurodevelopmental disorder.</a> Front Psychiatry. 3 (19), (2012).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+Dysfunction+in+Syndromic+Autism%3A+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances.</a> Dev Neurosci. , (2015).</li>
<li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losing+your+inhibition%3A+linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li>
<li>Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+cortical+interneuron+precursors+is+prescient+of+their+mature+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function.</a> Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).</li>
<li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).</li>
<li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).</li>
<li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).</li>
<li>Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+and+temporal+origin+of+chandelier+cells+in+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex.</a> Science. 339 (6115), 70-74 (2013).</li>
<li>Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneuron+specification%3A+the+juncture+of+genes%2C+time+and+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry.</a> Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+emergence+of+cortical+interneuron+diversity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo.</a> Science. 360 (6384), 81-85 (2018).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
<li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li>
<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een kritisch aspect van dit protocol is het maximaliseren van het overlevingsvermogen van de cellen. Ervoor te zorgen dat de weefsels en cellen altijd in ijskoude carboxygenated sACSF is noodzakelijk ter bevordering van de overleving van de cel. Dit vereist een efficiënte dissectie en dissociatie strategie om te minimaliseren van de lengte van de tijd dat de cellen in diverse oplossing en buiten de omgeving van de hersenen. Afhankelijk van het aantal hersengebieden wordt ontleed en getransplanteerd, kan het zinvol zijn o...

Corticale werking vereist een evenwicht tussen excitatory projectie neuronen en remmende GABAergic interneuronen, een uiterst heterogene populatie met verschillende morphologies, elektrofysiologische eigenschappen, connectiviteit en neurochemical markeringen. Abnormale ontwikkeling en functie van interneuronen (en specifieke interneuron subgroepen) is gekoppeld aan de pathobiology van psychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie, autisme en epilepsie1,2,3. Bovendien zijn vele genen betrokken bij deze hersenafwijkingen sterk verrijkt met jonge interneuronen4. Dus is een groter inzicht in de mechanismen die interneuron lot vastberadenheid en rijping regelen nodig om te begrijpen van de normale ontwikkeling en potentiële etiologie van talrijke hersenziekten.
Reukkolf interneuronen zijn geboren voornamelijk uit twee voorbijgaande embryonale structuren, de mediale en caudal ganglionaire eminenties (MGE en CGE, respectievelijk). Deze postmitotic cellen (interneuron precursoren) dan het ondergaan van een migratiefase van de langdurige tangentiële te verspreiden in de telencephalon waar ze integreren in een breed scala aan circuits. MGE afkomstige interneuronen bestaan uit drie grotendeels niet-overlappende, neurochemically gedefinieerde subgroepen: snel stekelige parvalbumin (PV+) interneuronen, niet-fast stekelige interneuronen Somatostatine (SST+), en laat stekelige neuronale nitraatstikstof oxide synthase (nNOS+) interneuronen die hippocampal neurogliaform en ivy cellen vormen. Talrijke labs hebben verschillende mechanismen binnen de MGE die eerste lot besluiten in PV+ of SST + interneuronen, met inbegrip van ruimtelijke gradiënten van morphogens, geboortedatum van interneuron precursoren, en de wijze van neurogene divisie regelen vastgesteld 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. er is voorgesteld dat interneuronen aanvankelijk in 'kardinaal klassen onderscheiden' en vervolgens geleidelijk in 'definitieve klassen' rijpen als ze met hun omgeving-11 interageren. Recente gegevens blijkt dat sommige volwassen interneuron subtypen genetisch hardwired wellicht deze cellen naarmate postmitotic in de ganglionaire eminenties, die aangeeft dat de vroege gedefinieerde intrinsieke genetische programma's een grotere rol dan voorheen kunnen spelen gewaardeerd12,13. De belangrijke vraag hoe de intrinsieke genetische programma's met milieu aanwijzingen naar station differentiatie in verschillende interneuron subtypen communiceren blijft echter grotendeels onontgonnen.
Talrijke studies hebben getransplanteerde embryonale MGE cellen rechtstreeks in een verscheidenheid van hersengebieden, met de resultaten van de consensus die geënt van cellen volwassen en vrijgeven van GABA te remmen in het algemeen de lokale endogene circuit14,15, 16,17,18,19. Deze waarnemingen veelbelovend hebben gegenereerd significant belang in het gebruik van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hIPSC)-afgeleid van interneuronen voor de behandeling van een verscheidenheid van hersenziekten. Nochtans, zeer weinigen van deze studies beoordelen als deze geënte cellen in de verwachte soorten rijpe interneuronen rijpen, een kritische component wanneer men denkt over translationeel benaderingen.
Om aan te pakken hoe milieu invloeden interneuron differentiatie en rijping, werd een strategie ontworpen om de transplantatie van onrijpe interneuron precursoren in nieuwe omgevingen van de hersenen om te onderzoeken of geënte interneuronen kenmerken van de host nemen milieu of functies van de donor milieu20behouden. MGE transplantaties zijn niet geschikt om aan te pakken van deze vraag, omdat de MGE bevat een gemengde bevolking van interneuron en GABAergic projectie cellen dat in talrijke regio's van de hersenen21 dispergeren. Zonder te weten waar deze MGE cellen zou zijn gemigreerd, kan men niet volledig beoordelen hoe deze transplantaties worden beïnvloed door het milieu van de hersenen. Door interneuron precursoren op vroege postnatale timepoints te oogsten, wordt dit probleem omzeild door het verkrijgen van onrijpe cellen die hebben hun migratie voltooid en hun doel bereikt brain regio maar hebben minimale interactie met de omgeving. Door te focussen op specifieke kenmerken van interneuronen die differentieel tussen verschillende hersengebieden worden uitgedrukt, kan men vervolgens bepalen hoe de hostomgeving interneuron eigenschappen verandert. De algemene aanpak in dit protocol dient te gelden tot een onderzoeker dat wil onderzoeken hoe jonge neuronen zich wanneer gedragen uitgedaagd in een nieuwe omgeving.

<table><tbody><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Brain Matrices</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Alleen nodig als striatum wordt geoogst</td></tr><tr><td>Fine point Dumont Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Microdissectie schaar</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Vlames</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetten</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manuele Manipulator met standaard</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml plastic buisjes met ronde bodem</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri-schalen</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri-schalen</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um filters</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

homochronic transplantatie van interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Vereist een ingewikkelde interactie tussen genetische programma's en Milieusignalen neuronale lot vastberadenheid en rijping. Ontwarren van de rollen van intrinsieke vs. extrinsieke mechanismen die deze differentiatie proces regelen is echter een raadsel voor alle ontwikkelingsstoornissen neurobiologists. Dit probleem is vergroot voor GABAergic interneuronen, een ongelooflijk heterogene celpopulatie dat is geboren uit voorbijgaande embryonale structuren en ondergaan een langdurige trekkende fase te verspreiden in de telencephalon. Om te ontdekken hoe verschillende hersenen omgevingen beïnvloeden interneuron lot en rijping, ontwikkelden we een protocol voor het oogsten van fluorescently geëtiketteerde onvolwassen interneuron precursoren van specifieke hersengebieden bij pasgeboren muizen (P0-P2). Op deze leeftijd, interneuron migratie is bijna voltooid en deze cellen zijn die woonachtig zijn in hun laatste rustplaats omgevingen met relatief weinig synaptic integratie. Na inzameling van eencellige oplossingen via stroom cytometry, deze interneuron precursoren in P0-P2 wildtype postnatale pups worden getransplanteerd. Door het uitvoeren van beide homotoop (bijvoorbeeld cortex-naar-cortex) of heterotopic (bijvoorbeeld cortex-naar-hippocampus) transplantaties, men kan beoordelen hoe het uitdagende onvolwassen interneuronen in nieuwe omgevingen van de hersenen van invloed is op het hun lot, rijping en integratie van het circuit. Hersenen kunnen worden geoogst in volwassen muizen en vehiculumcontrolegroep met een breed scala aan posthoc analyse op geënte cellen, met inbegrip van immunohistochemical, elektrofysiologische en transcriptionele profilering. Deze algemene aanpak biedt onderzoekers met een strategie voor de gehaltebepaling van hoe verschillende omgevingen: hersenen kunnen invloed hebben op tal van aspecten van neuron ontwikkeling en identificeren als neuronale specificiteit voornamelijk door hardwired genetische programma's gedreven worden of de signalen van het milieu.

Dit protocol laat zien hoe u oogst specifieke hersengebieden vanuit vroege postnatale brains (Figuur 1-2), verzamelen van eencellige dissociations van interneuron precursoren en deze cellen in verschillende hersengebieden in naïef WT transplantatie postnatale pups (Figuur 3). Voor de analyse van de posthoc, zijn hersenen die interneuron voorloper transplantaten ontvangen geoogst tussen P30-35 te karakteriseren ce...

Uitdagende jonge neuronen in nieuwe hersengebieden kan het onthullen van belangrijke inzichten in hoe het milieu neuronale lot en rijping beeldhouwt. Dit protocol beschrijft een procedure om de oogst interneuron precursoren van specifieke hersengebieden en verplant ze ofwel homotopically of heterotopically in de hersenen van postnatale pups.

Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Het algemene doel van deze procedure is om interneuron-precursors te verzamelen uit verschillende hersengebieden in postnatale muizenpups, en deze cellen te transplanteren naar leeftijdsgenoten om te beoordelen hoe omgevingsveranderingen het lot en de rijping van interneuronen beïnvloeden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingsneurowetenschap over hoe intrinsieke genetische programma's en omgevingssignalen samenwerken om het lot van neurale cellen te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat veranderingen in het lot en de rijping van interneuron-precursors kunnen worden geanalyseerd na hun adoptieve overdracht naar een nieuw hersomgeving.Visuele demonstratie van de stappen voor celverzameling en -transplantatie is van cruciaal belang omdat kleine fouten in de techniek kunnen leiden tot inefficiënte en onsuccesvolle transplantatie-experimenten. Om te beginnen, plaats een scheermes door de voorste frontale kwab van de hersenen van een postnatale dag één pup en voeg extra scheermessen toe in de sleuven net achter het eerste scheermes om twee 0,5 millimeter dikke plakken te maken. Breng de striatale plakken over in een petrischaal met beluchte sucrose kunstmatige cerebrospinale vloeistof of sACSF en plaats het resterende hersenweefsel in een petrischaal met sACSF op ijs.Plaats de plakken onder een dissectiemicroscoop en gebruik pincetten om het striatum uit beide hemisferen te knijpen, waarbij de striatale stukken in een 50-milliliter buisje met sACSF op ijs worden geplaatst terwijl ze worden geoogst. Als de hersenen zijn verzameld van een fluorescerende reportermuis, gebruik dan fluorescentiemicroscopie om het striatale td-tomato signaal te onderscheiden van het sterkere fluorescente signaal van de globus pallidus. Om de hippocampus te verwijderen, gebruik pincetten om de hersenen langs de middellijn te hemiseceren en plaats een hemisfeer onder een dissectiemicroscoop met de mediale oppervlakte naar boven.Gebruik pincetten om het ventrale hersenweefsel te verwijderen en identificeer de worstvormige hippocampus die zich over de anteroposteriore as langs de dorsale en ventriкулair zijde van de cortex uitstrekt. Plaats de uiteinden van de pincetten voor de voorste hippocampus en schuif de pincetten naar achteren terwijl u langs de hippocampale corticale grens knijpt om de hippocampus voorzichtig van de cortex te scheiden. Plaats het geïsoleerde weefsel in een 50-milliliter buisje met sACSF op ijs en herhaal de hippocampus-oogst voor de contralaterale hemisfeer.Plaats vervolgens de hemisecteerde cortex met de mediale zijde naar beneden en gebruik pincetten om de meest dorsale, ventrale, voorste en achterste delen van de cortex te verwijderen. Breng het resterende vierkante stuk mediale cortex over in een 50-milliliter buisje met sACSF op ijs. Na het verwijderen van de hersenen, speld de hersenen met de ventrale zijde naar beneden door het cerebellum en de voorste cortex of reuklobben.Gebruik gebogen pincetten om de achterste cortex voorzichtig te scheiden van de onderliggende hippocampus en ander weefsel in elke hemisfeer. En pel de dorsale cortex naar voren om de onderliggende structuren bloot te leggen. Gebruik pincetten om de hippocampus in één hemisfeer op de middellijn te knijpen en verwijder de hippocampus door deze lateraal van de hersenen af te pellen.Plaats de hippocampus in een 50-milliliter buisje met sACSF op ijs en oogst de contralaterale hippocampus op dezelfde manier. Schraap vervolgens voorzichtig rond de randen van de striatum om het los te maken van het omringende weefsel. Knijp voorzichtig onder de striatum om het striatale weefsel te verzamelen.Na het verzamelen van de cortex uit beide hemisferen, zoals eerder gedemonstreerd, brengt u het striatum onder een fluorescente dissectiemicroscoop over. Gebruik pincetten om eventueel helder rood td-tomato positief globus pallidus-weefsel uit elke striatum te verwijderen. Wanneer al het weefsel is verzameld, brengt u het weefsel over in een vijf-millimeter ronde buis met een ronde bodem en vervangt u de sACSF in elke verzamelbuis door twee milliliter versbereide pronase-sACSF-oplossing voor een incubatie van 20 minuten op kamertemperatuur met af en toe schudden.Aan het einde van de incubatie vervangt u voorzichtig de pronase-sACSF door een tot twee milliliter reconstitutie-oplossing en dissocieert u de weefsels mechanisch met vuur-gepolijste Pasteur-pijpen. Wanneer het weefsel troebel is en er geen weefselklontjes meer zichtbaar zijn, zeeft u de celoplossing door een 50-micronfilter in nieuwe vijf-milliliter ronde buizen met een ronde bodem om eventuele celklontjes te verwijderen voordat u de celoplossing sorteert op fluorescentie. Na ontvangst van de cellen uit flowcytometrie, brengt u de celsuspensies over in 1,5-milliliter conische buisjes voor centrifugatie.Na centrifugatie, aspireert u alle oplosmiddel behalve de laatste 20 microliters uit elke buis en brengt u de pellets aan voor het tellen. Indien nodig, verdunt u de celoplossing met sACSF tot een concentratie van een tot drie keer 10 tot de 5e cellen per microliter. Laad een fijne micropipet met mineraalolie.Bevestig de micropipet aan een nanoliter-injector en bevestig de nanoliter-injectie-apparatuur aan een manipulator die is bevestigd aan een magnetische basis. Terwijl de eerste pup wordt geanesthetiseerd op ijs, pipetteert u de celoplossing meerdere keren om een homogene celverdeling te garanderen. Spuit de mineraalolie uit en vul de pipet volledig met de single-cell suspensie.Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teenprik, plaatst u de pup op een petrischaaldeksel met het hoofd op een plakband, zodat de bovenkant van het hoofd relatief plat is. Bedek het hoofd met een stuk lab-tape met een diamantgat, trek de tape strak totdat de huid is uitgerekt, zodat het hoofd stevig is bevestigd en lambda zichtbaar is door het gat. Beweeg de bevestigde pup onder de nanoliter-injector en laat de micropipet zakken zodat de punt zich direct boven lambda bevindt.Observeer de X, Y-coördinaten op de manipulator en pas de manipulatorknoppen aan tot de micropipet op de juiste coördinaten langs de mediale, laterale en anteroposteriore assen van

homochronic-transplantation-interneuron-precursors-into-early

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Weber, R. Z., et al. Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the stereotaxic transplantation of genetically modified human neural progenitor cells (NPCs) into the mouse brain. Researchers inject NPCs expressing luciferase and fluorescent proteins, enabling in vivo bioluminescence imaging and post-mortem fluorescence microscopy to study cell survival, migration, and...

Transplantation of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Quattrocolo, G., et al. Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the transplantation of interneuron precursor cells into the neonatal mouse brain using either a homotopic or heterotopic approach. The procedure involves securing an anesthetized recipient pup, identifying the target brain region, and injecting a suspension of precursor cells derived from a donor pup at the same developmental stage.

Transplantation of Interneuron Precursor Cells into the Brain of a Mouse Pup

Source: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the stereotaxic injection of human-derived interneuron precursor cells into the hippocampus of a genetically modified mouse pup with reduced inhibitory interneurons, aiming to restore excitatory-inhibitory balance.

Transplantation of Human-Derived Interneuron Precursor Cells into the Mouse Pup Hippocampus

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide GABAerge neuronen gegenereerd door neuronale programmering zou een potentiële behandelingsbenadering kunnen zijn voor neurologische ontwikkelingsstoornissen. Dit protocol beschrijft de generatie en transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronale voorlopers in de hersenen van neonatale muizen, waardoor langdurig onderzoek van geënte neuronen en evaluatie van hun therapeutisch potentieel mogelijk is.

Transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronen in de vroege postnatale muis hippocampus om neurologische ontwikkelingsstoornissen te verminderen

Mozaïek Analyse van Gene Functie in Postnatale Mouse ontwikkeling van de hersenen met behulp van Virus-based Cre recombinatie

Leer hoe interneuron-voorlopercellen uit verschillende hersengebieden van postnatale muizen worden geoogst en getransplanteerd naar leeftijdsgelijke ontvangers. Deze techniek maakt analyse mogelijk van hoe omgevingsveranderingen de differentiatie en rijping van neuronen beïnvloeden.

Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen

Meer video's verkennen